Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung
20. September 2021
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.
Unsere Methode hilft, Genexpressionsdaten aus komplexen Geweben auf Einzelzellebene zu generieren und zu verstehen. Unsere Methode kann auf praktisch jedes Gewebe in gleicher Weise angewendet werden und führt zu qualitativ hochwertigen Daten mit sehr wenigen protokollbezogenen Artefakten. Dr. Janna Leiz und ich aus der Arbeitsgruppe Schmidt-Ott werden das Protokoll vorstellen.
Beginnen Sie damit, die Niere auf eine Kaltpräparierplatte zu legen und verwenden Sie ein scharfes Skalpell oder eine Rasierklinge, um eine mittlere Scheibe von ein bis zwei Millimetern zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebestück die gesamte kortikomedulläre Achse enthält. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere und eine Pinzette, um den Kortex vorsichtig von den Seiten des Mittelstücks abzuschneiden.
Innerhalb des präparierten Gewebestücks sollten die drei Segmente Kortex, äußere Medulla und innere Medulla deutlich sichtbar sein. Übertragen Sie das Nierenstück in die zuvor hergestellte RNA-Stabilisierungslösung und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Entfernen Sie nach 24 Stunden die RNA-Stabilisierungslösung.
Entfernen Sie die überschüssige Lösung vorsichtig mit einem Seidenpapier und lagern Sie das Taschentuch bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie das gefrorene Nierenstück und übertragen Sie es in eine 60 Millimeter große, vorgekühlte Polystyrol-Petrischale auf Eis, die einen Milliliter Nuclei Lysis Buffer 1 oder NLB1 enthält. Zerkleinern Sie die Taschentücher gründlich mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell.
Schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab und geben Sie das Hackfleisch und den Puffer in das auf Eis gelegte Mahlrohr. Stellen Sie sicher, dass alle Stücke übertragen wurden, und waschen Sie die Petrischale fünf- bis 10-mal mit dem Puffer. Bewegen Sie den Stößel A langsam 25 Mal im Mühlenrohr auf Eis auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.
Führen Sie das Homogenisat durch ein 100-Mikrometer-Sieb in einem vorgekühlten 15-Milliliter-Auffangrohr auf Eis und waschen Sie den Filter mit einem weiteren Milliliter NLB1. Waschen Sie das Mahlröhrchen mit kaltem EZ-Kernlysepuffer und entsorgen Sie den Puffer. Übertragen Sie das Homogenisat zurück in das Mahlrohr und bewegen Sie den Stößel B langsam 15 Mal im Mahlrohr auf Eis auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.
Übertragen Sie das Homogenisat in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Sammelrohr auf Eis. Waschen Sie das Mühlenröhrchen mit weiteren zwei Millilitern NLB1 und stellen Sie sicher, dass alle Gewebefragmente in das Sammelröhrchen übertragen werden. Inkubieren Sie das Homogenat fünf Minuten lang auf Eis, um die Zellen zu lysieren.
Das Homogenisat wird durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Auffangrohr geleitet. Schleudern Sie das Sammelröhrchen fünf Minuten lang bei 500 mal G bei vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit einem Schwenkeimerrotor. Fügen Sie in der Zwischenzeit RNase-Inhibitorlösung zu NLB2 hinzu.
Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in vier Millilitern NLB2. Legen Sie die Aufhängung vorsichtig mit einem Ein-Milliliter-Kissen aus Saccharose-Gradientenpuffer unter.
Schleudern Sie die Suspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit einem Schaufelrotor auf 500 mal G. In der Zwischenzeit RNase-Inhibitorlösung in den Suspensionspuffer der Kerne geben. Entfernen Sie das Auffangröhrchen nach dem Zentrifugieren vorsichtig aus der Zentrifuge und achten Sie darauf, die beiden Schichten beim Umgang mit dem Auffangröhrchen nicht zu stören.
Die Zelltrümmer können zwischen den beiden Schichten beobachtet werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, beginnend mit den Trümmern. Entfernen Sie den verbleibenden Überstand, ohne das Kernpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Kernsuspensionspuffer.
Das Homogenat wird durch ein 20-Mikrometer-Sieb in das vorgekühlte, fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen mit einem Fassungsvermögen von fünf Millilitern geleitet. Die Anzahl der Gene wurde gegen die Anzahl der Transkripte aufgetragen, die durch eindeutige molekulare Identifikatoren definiert und durch den Anteil der mitochondrialen Reads gefärbt wurden, um die Qualität der isolierten Kerne zu beurteilen. Insgesamt wurden 20.000 Gene in 6.000 Kernen mit 1.600 Mediangenen und 2.800 Median-Identifikatoren pro Zellkern nachgewiesen.
Genexpressionsmuster von Cluster-angereicherten Markern wurden mit Hilfe eines Punktdiagramms und Zelltyp-Clustern in einem t-verteilten stochastischen Nachbar-Embedding-Diagramm visualisiert. Der Prozentsatz jedes Zelltyps wurde berechnet und verwendet, um das Verhältnis von proximalen Tubuluszellen zu dicken aufsteigenden Gliedmaßenzellen zu bestimmen. Es ist wichtig, jederzeit bei vier Grad Celsius zu arbeiten und in Probeläufen die optimale Gewebemenge zu bestimmen, um qualitativ hochwertige Suspensionen und optimale Konzentrationen zu gewährleisten.
Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Isolierung von hochwertigen Zellkernen aus gefrorenen Mäuse-Nieren, das die Darstellung von Nierenmark-Zelltypen verbessert und gleichzeitig Artefakte der Genexpression durch enzymatische Dissoziation minimiert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genexpression
Hintergrund
- Das Verständnis der Genexpression auf Einzelzellebene ist entscheidend für die Untersuchung komplexer Gewebe.
- Traditionelle Methoden können Artefakte einführen, die die Datenqualität beeinflussen.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine zuverlässige Alternative für die Gewebeverarbeitung bereitzustellen.
- Es ist auf verschiedene Gewebetypen über die Nieren hinaus anwendbar.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Isolierung von hochwertigen Zellkernen aus Mäuse-Nieren zu entwickeln.
- Die Genauigkeit der Genexpressionsdaten von Nierenzelltypen zu verbessern.
- Protokoll-bezogene Artefakte in der Genexpressionsanalyse zu reduzieren.
Verwendete Methoden
- Sektion von gefrorenem Nierengewebe zur Gewinnung einer repräsentativen Probe.
- Verwendung einer RNA-Stabilisierungslösung zur Erhaltung der RNA-Integrität.
- Homogenisierung und Zentrifugation zur Isolierung von Zellkernen.
- Bewertung der Kernqualität durch Genexpressionsanalyse.
Hauptergebnisse
- Insgesamt wurden 20.000 Gene in 6.000 Kernen nachgewiesen.
- Medianwerte von 1.600 Genen und 2.800 eindeutigen molekularen Identifiern wurden pro Kern beobachtet.
- Genexpressionsmuster wurden mittels Punktplots und t-SNE-Plots visualisiert.
- Zelltypverhältnisse wurden berechnet, um Nierenzellpopulationen zu analysieren.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll isoliert effektiv hochwertige Zellkerne aus Nierengeweben.
- Es minimiert Artefakte und verbessert die Zuverlässigkeit der Genexpressionsdaten.
- Diese Methode kann für verschiedene Gewebetypen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-fidelity single-nucleus transcriptomics from frozen kidney tissue, addressing a key limitation in renal drug discovery where enzymatic dissociation biases cortical cell representation and obscures medullary targets. By preserving the corticomedullary axis and minimizing transcriptional stress, it improves target validation confidence for diuretic, fibrotic, and metabolic kidney disease programs. The method supports reproducible, scalable nuclei isolation for downstream screening and biomarker discovery in preclinical renal research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across the full corticomedullary axis, reducing bias toward cortical cell types in target identification.
- Operational Value: Provides a standardized nuclei isolation workflow compatible with frozen biobanked samples, increasing sample availability for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality nuclei with low mitochondrial read fractions, supporting reliable single-nucleus RNA-seq for compound screening in kidney disease models.
- Operational Value: Delivers consistent nuclei yields (6,000 nuclei per sample) with median 1,600 genes and 2,800 UMIs per nucleus, enabling assay standardization across discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by capturing medullary cell populations critical for studying concentration-dependent drug effects in the kidney.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by preserving native gene expression profiles without dissociation-induced artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead optimization, providing nuclei preparation for genomic screening in kidney disease models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by enabling unbiased cell type profiling across cortex, outer medulla, and inner medulla.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible nuclei isolation outputs suitable for high-throughput single-nucleus transcriptomic screening.
- Analytics: Provides gene expression readouts (UMI counts, mitochondrial fraction) and clustering data (t-SNE, dot plots) to compare treatment conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by maintaining corticomedullary architecture relevant to drug distribution and response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation platform applicable to multiple renal disease models and tissue archives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity from dissociation bias and transcriptional artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized, RNase-protected nuclei isolation from frozen tissue.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling comprehensive cell type profiling that reduces late-stage biological risk in renal programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through improved representation of medullary targets in drug target atlases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, nuclei isolation, and single-nucleus RNA-seq library preparation.
- Dependent on access to cryostat, centrifuge with swinging-bucket rotor, RNase inhibitors, and gradient centrifugation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue dissection, freezing, and lysis protocols to ensure consistency across sites.
- Adaptation to other tissues requires optimization of dissection timing and lysis buffer conditions based on tissue density and RNAse sensitivity.
- Practical limitations include the need for RNA stabilization prior to freezing and careful gradient handling to avoid nuclei loss or debris contamination.
