Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

Unser Ergebnis legt nahe, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Endothelzell-Kardiomyozyten-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Untersuchung der Rolle von Endothelzellen beim Kardiomyozytenschutz gegen simulierte Ischämie-Reproduktionsverletzungen bereitzustellen. Zell-Kokultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind in der gemischten Kokultur jedoch nicht ohne weiteres durchführbar.

Die aktuelle Studie zielte darauf ab, zwei separate Zellschichten mit einem signifikanten Abstand zwischen ihnen zu schaffen, wo man eine Hypoxie-Reproduktionsverletzung induzieren und das Ergebnis und die Auswirkungen auf einen einzelnen Zelltyp untersuchen kann. Beginnen Sie die Vorbereitung, indem Sie beide Zelllinien auftauen. Beschichten Sie die Zellen in T25-Kolben, nachdem Sie sie mit frischen Medien gewaschen haben.

Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie konfluent sind. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 21% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 74% Stickstoff. Halten Sie es befeuchtet.

Schätzen Sie den Zusammenfluss der Kardiomyozytenzelllinie unter einem Lichtmikroskop. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit drei bis fünf Millilitern Trypsin-EDTA pro Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren und bei 37 Grad Celsius zwei bis fünf Minuten inkubieren.

Danach beurteilen Sie den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem das Trysin oder die Zelllösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medien pro T25-Kolben gegeben wird. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 120 x g für zwei Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern eines Mediums. Führen Sie als Nächstes die Zellzählung durch und bestätigen Sie die Zelllebensfähigkeit. Mischen und aliquot von 10 Mikrolitern resuspendierten Zellen und 10 Mikrolitern trypanblauem Farbstoff, dann zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Zellzähler.

Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Nehmen Sie eine 24-Well-Platte vorbeschichtet mit extrazellulärer Matrix und Plattenkardiomyozyten bei Aussaatdichten von 300.000 pro Vertiefung auf den Boden der Platte. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht.

Nach 24 Stunden werden Endothelzellen mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz in Einsätze gesteckt. Platzieren Sie nach 24 Stunden Endothelzellplattierung Endothelzelleinsätze in den Kardiomyozytenvertiefungen und initiieren Sie die Kokultur. Lassen Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.

Bereiten Sie die hypoxischen Medien vor, indem Sie etwa 25 Milliliter Medien in ein konisches 50-Milliliter-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Danach erzeugen Sie ein weiteres Loch und lassen Sie etwa 2/3 der Pipetten in das Medium eingetaucht.

Spülen Sie das Medium fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einer Durchflussrate von 30 Litern pro Minute und entsorgen Sie dann die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten. Waschen Sie sie sehr vorsichtig mit 100 Mikrolitern von 10% PBS pro Well, fügen Sie 500 Mikroliter der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu. Ersetzen Sie das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum in der normoxischen Kontrollgruppe enthalten.

Legen Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Hypoxiekammer, um die Kammer zu befeuchten. Legen Sie dann die Platten mit den hypoxischen Gruppen in die Kammer. Spülen Sie die Hypoxiekammer fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einem Durchfluss von 30 Litern pro Minute.

Danach stellen Sie die Kammer für 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Hypoxie entsorgen Sie das alte Medium der Platten oder Einsätze und fügen Sie 500 Mikroliter normaler Medien hinzu, die Glukose und Serum enthalten, zu jeder Wand der Platten, dann lagern Sie die Platten in einem Inkubator unter normalen Kulturbedingungen für zwei Stunden, um die Reperfusion nachzuahmen. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte, nehmen Sie dann 200 Mikroliter Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig auf vier Wells der 96-Well-Platte.

Messen Sie die Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit in einer 96-Well-Platte und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Grad der Zellverletzung zu bestimmen. In dieser Studie wurden drei Arten von Einsätzen evaluiert. Alle drei Einsätze hatten die gleiche Porengröße von 0,4 Mikrometern.

Der einzige Unterschied zwischen ihnen war der Einsatz zur Basishöhe, so dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 und 2,0 Millimeter betragen konnten. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden die Zellen unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert und dann in zwei Gruppen aufgeteilt, eine normoxische Kontrollgruppe und die Hypoxiegruppe. Nach 24 Stunden wurden beide Gruppen mit Medien aufgefrischt und unter normalen Sauerstoffbedingungen für weitere zwei Stunden kultiviert, bevor die Endpunktassays durchgeführt wurden.

Ein Vergleich der drei Arten von Kultureinsätzen bei der Beurteilung der Laktatdehydrogenasefreisetzung für Kardiomyozyten allein, Endothelzellen allein und Kokultur von Kardiomyozyten mit Endothelzellen wird hier unter normoxischen, nur Hypoxie- und Hypoxie-Reoxygenierungsbedingungen gezeigt. Bei einem Abstand von 0,5 Millimetern zwischen den Zellschichten führte die Hypoxie zu einer signifikant erhöhten LDH-Freisetzung im Vergleich zur Normoxie, wenn Kardiomyozyten allein kultiviert wurden. LDH war jedoch in der Hypoxie-Reoxygenierungsgruppe im Vergleich zur reinen Hypoxie-Gruppe nur geringfügig erhöht.

Wenn Endothelzellen und Kardiomyozyten zusammen kultiviert wurden, wurde der Anstieg der LDH-Freisetzung unter den reinen Hypoxie-Bedingungen nicht abgeschwächt. Dies deutet darauf hin, dass die Endothelzellen im Vergleich zur Gruppe der Kardiomyozyten allein unter den Hypoxie-Bedingungen keine schützende Wirkung hatten. Endothelzellen übten jedoch während der HR einen milden, aber signifikanten Schutz auf Kardiomyozyten aus. Wenn der Abstand zwischen den Zellschichten einen Millimeter betrug, war die LDH-Freisetzung auch in Kardiomyozyten nur unter der Nur-Hypoxie-Bedingung signifikant erhöht.

Im Gegensatz zum 0,5-Millimeter-Einsatz wurde der LDH-Anstieg der Kardiomyozyten jedoch nur durch HR gegenüber Hypoxie-Bedingungen potenziert. Dieser Anstieg war mit dem Zwei-Millimeter-Einsatz noch ausgeprägter. Die Konzentration der Endothelzellen, die in Zwei-Millimeter-Einsätzen plattiert waren, wurde auf 25.000, 50.000 bzw. 100.000 Zellen pro Einsatz titriert.

Es wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der Endothelzellintensität in der Kokultur zu einer dosisabhängigen Abschwächung der LDH-Freisetzung durch HR führte. Unter normoxischen Bedingungen wurde jedoch kein solcher Effekt beobachtet. Diese Co-Kultur-Methodik ist nicht auf Endothelzellen und Kardiomyozyten beschränkt. Diese Methoden sollten eine Untersuchung spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zwischen verschiedenen Zelllinien über mehrere interessante Organe hinweg unterstützen.