Name: Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Simulation kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung schützender Mechanismen von Endothelzellen auf Kardiomyozyten bei kontrolliertem räumlichen Abstand.

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Diese Arbeit wurde zum Teil vom US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) und von institutionellen Mitteln an M.L.R.

1. Versuchsvorbereitung/-beschichtung
<ol><li>Pflegen Sie CMs und ECs gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Tauen Sie beide Zelllinien auf, wenn sie von Lieferanten ankommen. Platte in T25-Kolben nach dem Waschen mit frischen Medien. Es wird empfohlen, jedes Zellkulturmedium von den gleichen Anbietern zu kaufen, von denen die Zellen gekauft wurden. Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie zusammenfließen.</li>
		<li>Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 21% O2, 5% CO2, 74%N2 und halten Sie ihn befeuchtet. HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten primären Koronararterien-Endothelzellen der Maus werden aus Koronararterien von C57BL/6-Mäusen isoliert, und adulte Maus-Kardiomyozyten werden aus adulten C57BL/6J-Mausherzen isoliert und kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte CMs unter sterilen Bedingungen auf den Boden von 24-Well-Platten (untere Schicht). 24 h später Platte ECs in den Einsatz (oder übergeordneten Teil) des Co-Kultur-Brunnens. 24 h nach der EC-Beschichtung EC-Einsätze auf CM-Plattenböden legen, beginnend mit der Kokulturperiode. Lassen Sie die Zellen vor Gebrauch mindestens 12-24 Stunden lang kokulturieren. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich beschrieben.<ol>
<li>Schätzen Sie die Zusammenfluss von CM-Zelllinien unter einem Lichtmikroskop. Wenn Zellen in Kulturflaschen zu 90% -100% konfluent zu sein scheinen, fahren Sie mit der experimentellen Beschichtung fort.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit 3-5 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für T25-Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren, bei 37 °C für 2-5 min inkubieren und dann den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop beurteilen. Sobald sich die Zellen aufrunden, verwenden Sie einen Zellenabstreifer, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.</li>
		<li>Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem die Trypsin-/Zelllösung in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Medien für T25-Kolben gegeben wird. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120 x g für 2 Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 5 ml Medien.</li>
		<li>Um die Zellzählung durchzuführen und die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen, mischen Sie ein Aliquot von 10 μL resuspendierter Zellen und 10 μL Trypanblaufarbstoff. Zählen Sie die lebenden Zellen mithilfe eines Zellzählers. Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Die Volumina werden in Abhängigkeit von der gewünschten Samendichte und Zellkonzentration von Stammlösungen berechnet. Alle Beschichtungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
		<li>Platten-CMs mit einer Aussaatdichte von 300.000 pro Bohrloch auf dem Boden einer 24-Well-Platte, die mit extrazellulärer Matrix vorbeschichtet ist. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C mit 21%O2 und 5% CO2 gehalten.</li>
		<li>Nach 24 h Platten-ECs in Einsätze mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz (Kulturfläche beträgt 33,6 mm2) (Abbildung 1). Nach 24 Stunden EC-Beschichtung EC-Einsätze in die CM-Vertiefungen legen, um die Kokultur einzuleiten. Lassen Sie die Zellen 12-24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Durchführung der Experimente sowohl CMs als auch ECs einen Zusammenfluss von 80 % bis 90 % erreicht haben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hypoxie/Reoxygenierung zur Simulation von Ischämie/Reperfusionsverletzung in vitro
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen wie beschrieben ausgeführt werden, pausieren Sie nicht dazwischen.
<ol><li>Bereiten Sie das hypoxische Medium vor, indem Sie ~ 25 ml Medien in ein konisches 50-ml-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Erzeugen Sie ein weiteres Loch, diesmal bleibt die Pipette ungefähr 2/3 in das Medium eingetaucht.</li>
	<li>Spülen Sie das Medium mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) für 5 min bei einer Durchflussrate von 30 L/min. Dies minimiertO2, das sich im Medium löst, wenn die Hypoxie beginnt (Schritt 2.5).</li>
	<li>Entsorgen Sie die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten, und waschen Sie sie mit 100 μL/Well von 10% phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sehr vorsichtig. Danach fügen Sie 500 μL der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu. HINWEIS: Die Hypoxie in den Medien wird während dieses Schritts so kurz wie möglich unterbrochen, bevor in Schritt 2.5 eine echte Hypoxie für Zellen und Medien beginnt.<ol>
<li>Ersetzen Sie in der normoxischen Kontrollgruppe das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Befeuchten Sie die Hypoxiekammer, indem Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Kammer legen. Als nächstes legen Sie die Platten, die die hypoxischen Gruppen umfassen, in die Kammer.</li>
	<li>Spülen Sie die Hypoxiekammer mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) für 5 min bei einem Durchfluss von 30 L/min. Stellen Sie die Kammer für 24 h in den 37 °C Inkubator.</li>
	<li>Nach Hypoxie CMs und ECs unter normalen Bedingungen kultivieren. Entsorgen Sie dazu das alte Medium der Platten/Einsätze, ersetzen Sie es durch normale Medien (mit Glukose und Serum; 500 μL jeder Vertiefung/Einlage) und lagern Sie es im Inkubator unter normalen Kulturbedingungen (21% O2, 5% CO 2, 74%N2, 37 °C) für2 h, um die Reperfusion nachzuahmen.</li>
	<li>Um die Auswirkungen des Medienersatzes zu kontrollieren, wechseln Sie die Medien der normoxischen Zellen gleichzeitig mit dem Wechsel der hypoxischen Medien. HINWEIS: Abbildung 2 bietet eine schematische Übersicht über dieses Protokoll.</li>
</ol>3. Endpunktbewertung
<ol><li>Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie 200 μL Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie entsprechend gleichmäßig auf vier Vertiefungen der 96-Well-Platte. Verwenden Sie jeweils eine Platte für Normoxie versus Hypoxie versus HR.</li>
	<li>Bestimmen Sie den Grad der Zellschädigung, z. B. durch Messung der Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie den Assay in einer 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen im Assay-Protokoll durch.</li>
</ol>4. Statistiken
<ol><li>Zeigen Sie die parametrischen Daten als Mittelwert/Standardabweichung und nicht-parametrische Daten als Boxplots mit Median-/Interquartilsbereich an. Es sollten angemessene parametrische und nicht-parametrische Mehrfachvergleiche mit akzeptablen Post-hoc-Tests durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Typ-1-Fehlers zu verringern. Die Signifikanz wird typischerweise auf ein Alpha von 0,05 (zweiseitig) festgelegt.</li>
	<li>Führen Sie für alle Experimente, die in der aktuellen Studie durchgeführt wurden, mindestens drei Well-Replikationen innerhalb eines Experiments durch. Es gab drei bis sechs Wiederholungen jedes Experiments, die für die statistische Analyse verwendet wurden.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Kritische Schritte im Protokoll Zellkokulturmodelle wurden verwendet, um zelluläre Mechanismen der Kardioprotektion zu untersuchen. Wie man zwei getrennte Schichten mit einem sinnvollen Abstand zwischen ihnen schafft, ist daher entscheidend für die Entwicklung eines geeigneten Co-Kultur-Modells. Eine Herausforderung bei der Untersuchung simulierter IR-, d.h. HR-Verletzungen besteht darin, dass nicht nur Ischämie (Hypoxie) selbst, sondern auch Reperfusion (Reoxygenierung) die zelluläre Dysfunktion vers...

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung 1,2. Der Behandlungsprozess der Reperfusion kann jedoch selbst zum Tod des Kardiomyozyten führen, der als Myokardischämie / Reperfusionsverletzung (IR) bekannt ist und für die es immer noch kein wirksames Mittel gibt3. Es wurde vorgeschlagen, dass Endothelzellen (ECs) Kardiomyozyten (CMs) durch die Sekretion parakriner Signale sowie Zell-zu-Zell-Interaktionenschützen 4.
Zell-Co-Kultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle autokriner und / oder parakriner Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Unter den Kokulturmodellen ist die gemischte Kokultur die einfachste, bei der zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt innerhalb eines einzigen Kulturkompartiments mit einem gewünschten Zellverhältnisstehen 5. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind jedoch angesichts der gemischten Population nicht ohne weiteres durchführbar.
Frühere Studien zeigten, dass hypoxische und ischämische Beleidigungen die Integrität der Zellmembran signifikant schädigen, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH). Diese Verletzung wird bei der Reoxygenierung verschlimmert und ahmt die Reperfusionsverletzung 6,7,8 nach. Ziel des aktuellen Protokolls war es, die Hypothesen zu testen, dass das Vorhandensein von ECs dosisabhängig das durch Hypoxie und Reoxygenierung (HR) verursachte Zellmembranleckage von CMs abschwächen kann und dass die Schutzwirkung von ECs durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien optimiert werden kann. Daher verwendeten wir drei Arten von Zellkultureinsätzen und Maus-Primär-Koronararterien-Endothelzellen und adulte Maus-Kardiomyozyten. Die von Corning, Merck Millipore und Greiner Bio-One gebrandeten Einsätze ermöglichten es uns, drei verschiedene Zellkultur-Übersprechbedingungen mit Abständen zwischen den Zelllinien von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm zu erzeugen. Pro Einsatz wurden jeweils 100.000 ECs plattiert.
Um festzustellen, ob die Dichte von ECs in der Kokultur in diesem Modell zur Dämpfung von HR-Verletzungen beiträgt, untersuchten wir außerdem die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der EC-Konzentration und der LDH-Freisetzung durch CMs. ECs wurden mit 25.000, 50.000 bzw. 100.000 pro Einsatz im 2,0-mm-Einsatz plattiert.
Dieser Bericht bietet einen schrittweisen Ansatz für Ermittler, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

<table><tbody><tr><td>Kardiomyozyten (CMs) aus adulten</td> <td>MäusenCelprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Isoliert aus adultem C57BL/6J-Mausherzgewebe</td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Zellzählung zur Berechnung der Zellzahl</td></tr><tr><td>Bio-Sicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>sterile Haube</td></tr><tr><td>Zellkultur Einfriermedium</td><td>Zellbiologika Inc</td><td>6916</td><td>Wird zum Einfrieren von Zellen für die langfristige Lagerung von Zelllinien verwendet</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Zur Gewährleistung normaler Lebensbedingungen der Zellen (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°; C, befeuchtet)</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator Gastank</td><td>A-L Komprimierte Gase</td><td>UN1013</td><td>Für den Zellkultur-Inkubator benötigtes Gas&nbsp;</td></tr><tr><td>Zellkultureinsätze A (0,5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>Wird für EC-CM Co-Kultur</td></tr> verwendet <tr><td>Zellkultureinsätze B (1,0 mm)</td><td>Millicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>Wird für EC-CM Co-Kultur</td></tr> verwendet <tr><td>Zellkultureinsätze C (2,0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>Wird für EC-CM Co-Kultur</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>verwendet Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Für die Beschichtung und Passage von Zellkulturen</td></tr><tr><td>CMs Zellkulturflaschen T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>Wird für CMs normale Kultur verwendet, vom Hersteller</td></tr><tr><td>beschichtet CMs Zellkulturmedium Complete</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>CMs Kulturmedium komplett</td></tr><tr><td>CMs Zellkulturmedium komplett Phenolfrei</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>CMs Kulturmedium ohne Phenolrot wird bei der LDH-Messung verwendet</td></tr><tr><td>CMs Zellkulturplatten 96 well</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>Wird für Experimente zur LDH-Messung verwendet, beschichtet durch</td></tr><tr><td>Hersteller CMs Hypoxia Zellkulturmedium</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>CMs Zellkultur unter hypoxischen Bedingungen (glukose- und serumfrei)</td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer</td><td>Objektträger Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Zählobjektträger für den Zellzähler</td></tr><tr><td>Cyquant LDH Zytotoxizitätskit</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C20301</td><td>LDH-Messkit</td></tr><tr><td>ECs Zellkulturflaschen T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB012935</td><td>Wird für ECs reguläre</td></tr><tr><td>Kultur-ECs Zellkulturmedium Complete</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>M1168</td><td>ECs Kultur-Komplettmedium</td></tr><tr><td>ECs Cell Culture Medium Complete Phenol</td><td>Free Cell Biologics Inc</td><td>M1168PF</td><td>ECs Kulturmedium ohne Phenolrot verwendet, das bei der LDH-Messung verwendet</td></tr><tr><td>wird ECs Zellkulturplatten 96 Well</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>Wird für LDH-Experimente verwendet Messung</td></tr><tr><td>ECs Culture Beschichtungslösung auf Gelatinebasis</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td><td>Wird zur Beschichtung von Kolben und Platten für</td></tr><tr><td>ECs ECs Hypoxia Zellkulturmedium</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>ECs Zellkultur unter hypoxischen Bedingungen (glukose- und serumfrei)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>FBS-HI USDA zugelassen für Zellkultur und Wartung</td></tr><tr><td>Hypoxie-Kammer</td><td>StemCell Technologies</td><td>27310</td><td>Zur Schaffung eines hypoxischen Zustands mit 0,01 %O2 Umgebung</td></tr><tr><td>Hypoxie-Kammer-Durchflussmesser</td><td>StemCell Technologies</td><td>27311</td><td>Zum Anschluss an einen hypoxischen Gastank für eine konstante Gasdurchflussgeschwindigkeit</td></tr><tr><td>Hypoxischer Gastank (0,01 %O2 Zylinder)</td><td>A-L Komprimierte Gase</td><td>UN1956</td><td>Wird zum Spülen von hypoxischem Medium und Kammer (0,01%O2/5%CO2/94,99N2)</td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Zur Beobachtung des Zellzustands</td></tr><tr><td>Maus Primäre Koronararterien Endothelzellen (ECs)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>Isoliert aus der Koronararterien von C57BL/6 Mäusen</td></tr><tr><td>NUNC 15ML CONICONL Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td>Für Zellkulturprozesse, Experimente, Lösungsvorbereitung usw.</td></tr><tr><td>NUNC 50ML CONICL Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Für Zellkulturprozesse, Experimente, Lösungsvorbereitung etc.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Wird zum Waschen von Zellen während der Kultur oder bei Experimenten verwendet</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>BioTek Instrument</td><td>11120533</td><td>Kolorimetrische oder fluorometrische Plattenablesung</td></tr><tr><td>Reaktion 96 Well Palte (klar, kein Deckel)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>Wird für LDH-Messungen verwendet</td></tr><tr><td>Plattenlesung Trypsin/EDTA für CMs</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x steril gefiltert und gewebekulturgetestet</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA für ECs</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td><td>0,25%, zellschnittgeprüft</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines zell-co-kultur-modells zur nachahmung von kardialer ischämie/reperfusion in vitro

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung. Reperfusion verursacht zusätzliche Verletzungen über die Ischämie hinaus. Endothelzellen (ECs) können Kardiomyozyten (CMs) durch Zell-Zell-Interaktionen vor Reperfusionsverletzungen schützen. Kokulturen können helfen, die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Eine gemischte Kokultur ist der einfachste Ansatz, aber begrenzt, da isolierte Behandlungen und nachgelagerte Analysen einzelner Zelltypen nicht möglich sind. Um zu untersuchen, ob ECs dosisabhängig CM-Zellschäden abschwächen können und ob dieser Schutz durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien weiter optimiert werden kann, haben wir Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells und Adult Mouse Cardiomyocytes verwendet, um drei Arten von Zellkultureinsätzen zu testen, die in ihrem Abstand zwischen den Zellschichten bei 0,5 variierten. 1,0 bzw. 2,0 mm. Nur bei CMs nahm die Zellschädigung, wie sie durch die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) beurteilt wurde, während der Hypoxie und weiter bei der Reoxygenierung signifikant zu, wenn der Abstand 2,0 mm im Vergleich zu 0,5 und 1,0 mm betrug. Wenn ECs und CMs in nahezu direktem Kontakt standen (0,5 mm), gab es nur eine leichte Abschwächung der Reoxygenierungsverletzung von CMs nach Hypoxie. Diese Dämpfung war signifikant erhöht, wenn der räumliche Abstand 1,0 mm betrug. Mit einem Abstand von 2,0 mm schwächten ECs die CM-Verletzung sowohl während der Hypoxie als auch der Hypoxie/Reoxygenierung ab, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende Kulturdistanzierung notwendig ist, damit ECs mit CMs übersprechen können, so dass sezernierte Signalmoleküle zirkulieren und Schutzwege vollständig stimulieren können. Unsere Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der EC/CM-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von ECs beim CM-Schutz gegen simulierte Ischämie/Reperfusionsverletzung bereitzustellen. Ziel dieses Berichts ist es, den Ermittlern einen schrittweisen Ansatz zu bieten, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

Alle drei Arten von Einsätzen (A, B, C), die in diesem Experiment verwendet wurden, haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm betragen (Abbildung 3) und dass sie von verschiedenen Anbietern stammen (Details siehe Materialtabelle).
Um ein In-vitro-Co-Kulturmodell mit separaten ...

Die räumliche Entfernung ist ein Schlüsselparameter bei der Beurteilung von Hypoxie- / Reoxygenierungsverletzungen in einem Kokulturmodell separater Endothel- und Kardiomyozytenzellschichten, was zum ersten Mal darauf hindeutet, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von Endothelzellen beim Schutz von Kardiomyozyten bereitzustellen.

Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Unser Ergebnis legt nahe, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Endothelzell-Kardiomyozyten-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Untersuchung der Rolle von Endothelzellen beim Kardiomyozytenschutz gegen simulierte Ischämie-Reproduktionsverletzungen bereitzustellen. Zell-Kokultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind in der gemischten Kokultur jedoch nicht ohne weiteres durchführbar.Die aktuelle Studie zielte darauf ab, zwei separate Zellschichten mit einem signifikanten Abstand zwischen ihnen zu schaffen, wo man eine Hypoxie-Reproduktionsverletzung induzieren und das Ergebnis und die Auswirkungen auf einen einzelnen Zelltyp untersuchen kann. Beginnen Sie die Vorbereitung, indem Sie beide Zelllinien auftauen. Beschichten Sie die Zellen in T25-Kolben, nachdem Sie sie mit frischen Medien gewaschen haben.Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie konfluent sind. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 21% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 74% Stickstoff. Halten Sie es befeuchtet.Schätzen Sie den Zusammenfluss der Kardiomyozytenzelllinie unter einem Lichtmikroskop. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit drei bis fünf Millilitern Trypsin-EDTA pro Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren und bei 37 Grad Celsius zwei bis fünf Minuten inkubieren.Danach beurteilen Sie den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem das Trysin oder die Zelllösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medien pro T25-Kolben gegeben wird. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 120 x g für zwei Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern eines Mediums. Führen Sie als Nächstes die Zellzählung durch und bestätigen Sie die Zelllebensfähigkeit. Mischen und aliquot von 10 Mikrolitern resuspendierten Zellen und 10 Mikrolitern trypanblauem Farbstoff, dann zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Zellzähler.Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Nehmen Sie eine 24-Well-Platte vorbeschichtet mit extrazellulärer Matrix und Plattenkardiomyozyten bei Aussaatdichten von 300.000 pro Vertiefung auf den Boden der Platte. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht.Nach 24 Stunden werden Endothelzellen mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz in Einsätze gesteckt. Platzieren Sie nach 24 Stunden Endothelzellplattierung Endothelzelleinsätze in den Kardiomyozytenvertiefungen und initiieren Sie die Kokultur. Lassen Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.Bereiten Sie die hypoxischen Medien vor, indem Sie etwa 25 Milliliter Medien in ein konisches 50-Milliliter-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Danach erzeugen Sie ein weiteres Loch und lassen Sie etwa 2/3 der Pipetten in das Medium eingetaucht.Spülen Sie das Medium fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einer Durchflussrate von 30 Litern pro Minute und entsorgen Sie dann die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten. Waschen Sie sie sehr vorsichtig mit 100 Mikrolitern von 10% PBS pro Well, fügen Sie 500 Mikroliter der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu. Ersetzen Sie das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum in der normoxischen Kontrollgruppe enthalten.Legen Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Hypoxiekammer, um die Kammer zu befeuchten. Legen Sie dann die Platten mit den hypoxischen Gruppen in die Kammer. Spülen Sie die Hypoxiekammer fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einem Durchfluss von 30 Litern pro Minute.Danach stellen Sie die Kammer für 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Hypoxie entsorgen Sie das alte Medium der Platten oder Einsätze und fügen Sie 500 Mikroliter normaler Medien hinzu, die Glukose und Serum enthalten, zu jeder Wand der Platten, dann lagern Sie die Platten in einem Inkubator unter normalen Kulturbedingungen für zwei Stunden, um die Reperfusion nachzuahmen. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte, nehmen Sie dann 200 Mikroliter Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig auf vier Wells der 96-Well-Platte.Messen Sie die Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit in einer 96-Well-Platte und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Grad der Zellverletzung zu bestimmen. In dieser Studie wurden drei Arten von Einsätzen evaluiert. Alle drei Einsätze hatten die gleiche Porengröße von 0,4 Mikrometern.Der einzige Unterschied zwischen ihnen war der Einsatz zur Basishöhe, so dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 und 2,0 Millimeter betragen konnten. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden die Zellen unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert und dann in zwei Gruppen aufgeteilt, eine normoxische Kontrollgruppe und die Hypoxiegruppe. Nach 24 Stunden wurden beide Gruppen mit Medien aufgefrischt und unter normalen Sauerstoffbedingungen für weitere zwei Stunden kultiviert, bevor die Endpunktassays durchgeführt wurden.Ein Vergleich der drei Arten von Kultureinsätzen bei der Beurteilung der Laktatdehydrogenasefreisetzung für Kardiomyozyten allein, Endothelzellen allein und Kokultur von Kardiomyozyten mit Endothelzellen wird hier unter normoxischen, nur Hypoxie- und Hypoxie-Reoxygenierungsbedingungen gezeigt. Bei einem Abstand von 0,5 Millimetern zwischen den Zellschichten führte die Hypoxie zu einer signifikant erhöhten LDH-Freisetzung im Vergleich zur Normoxie, wenn Kardiomyozyten allein kultiviert wurden. LDH war jedoch in der Hypoxie-Reoxygenierungsgruppe im Vergleich zur reinen Hypoxie-Gruppe nur geringfügig erhöht.Wenn Endothelzellen und Kardiomyozyten zusammen kultiviert wurden, wurde der Anstieg der LDH-Freisetzung unter den reinen Hypoxie-Bedingungen nicht abgeschwächt. Dies deutet darauf hin, dass die Endothelzellen im Vergleich zur Gruppe der Kardiomyozyten allein unter den Hypoxie-Bedingungen keine schützende Wirkung hatten. Endothelzellen übten jedoch während der HR einen milden, aber signifikanten Schutz auf Kardiomyozyten aus. Wenn der Abstand zwischen den Zellschichten einen Millimeter betrug, war die LDH-Freisetzung auch in Kardiomyozyten nur unter der Nur-Hypoxie-Bedingung signifikant erhöht.Im Gegensatz zum 0,5-Millimeter-Einsatz wurde der LDH-Anstieg der Kardiomyozyten jedoch nur durch HR gegenüber Hypoxie-Bedingungen potenziert. Dieser Anstieg war mit dem Zwei-Millimeter-Einsatz noch ausgeprägter. Die Konzentration der Endothelzellen, die in Zwei-Millimeter-Einsätzen plattiert waren, wurde auf 25.000, 50.000 bzw. 100.000 Zellen pro Einsatz titriert.Es wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der Endothelzellintensität in der Kokultur zu einer dosisabhängigen Abschwächung der LDH-Freisetzung durch HR führte. Unter normoxischen Bedingungen wurde jedoch kein solcher Effekt beobachtet. Diese Co-Kultur-Methodik ist nicht auf Endothelzellen und Kardiomyozyten beschränkt. Diese Methoden sollten eine Untersuchung spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zwischen verschiedenen Zelllinien über mehrere interessante Organe hinweg unterstützen.

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Research

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Biology

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