Name: Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Implantation von Elektroden zur Erstellung eines Temporallappenepilepsie-Modells bei VGAT-Cre-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Anfallsmechanismen und die Entwicklung neuer Therapien.

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Die Autoren danken John Williamson für hilfreiche Diskussionen zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch den NIH/NINDS-Zuschuss NS112549 unterstützt.

Die Verwendung von Tieren folgte den ARRIVE12-Richtlinien und wurde vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt.
1. Herstellung von Headsets mit zwei bipolaren Elektroden (Abbildung 1)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62929/62929fig01.jpg"> Abbildung 1: Wichtige Schritte bei der Herstellung von EEG-Headsets. (A) Aussehen der Elektroden bei den verschiedenen Schritten im Protokoll (Nummern im linken Übereinstimmungsschritt). (B) Ein Bild des Endprodukts, das in einer selbstgebauten Halterung montiert ist, die in den stereotaktischen Rahmen passt. Beachten Sie, dass die Halterung mit einem Kragenstift endet, der in den Headset-Sockel passt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62929/62929fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<ol><li>Schneiden Sie 3,5 cm rostfreien Polytetrafluorethylen-beschichteten Edelstahldraht ab.</li>
	<li>Ziehen Sie an beiden Enden ca. 1 mm der Isolierschicht vom Draht ab. Lassen Sie nicht zu viel vom Draht abisolieren.</li>
	<li>Setzen Sie zwei Stifte auf einen Schraubstockhalter, wobei der untere Teil des Stifts einen längeren Schlitz nach unten hat.</li>
	<li>Tragen Sie Flussmittel auf die abisolierten Enden des Drahtes und auf die Oberseite der Stifte auf.</li>
	<li>Verzinn Sie den abisolierten Teil des Drahtes mit gerade genug Lot, um ihn zu beschichten.</li>
	<li>Fügen Sie eine minimale Menge Lot auf die Oberseite des Stifts hinzu, ohne auf die Seiten überzulaufen.</li>
	<li>Stecken Sie ein Ende der abisolierten Enden des Drahtes so tief wie möglich in den Stift, während das Lot geschmolzen ist. HINWEIS: Es gibt ein seitliches Loch, aus dem der Draht herauskommen kann - lassen Sie den Draht nicht aus dem Stift herauskommen. Der gesamte abisolierte Draht muss innerhalb des Stifts bleiben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.7 für den zweiten Pin, jetzt mit den anderen abisolierten Enden des Kabels.</li>
	<li>Lassen Sie die Stifte 30 Sekunden einwirken, entfernen Sie sie aus dem Schraubstockhalter und ziehen Sie dann daran, um sicherzustellen, dass die Verbindung zwischen dem Draht und den Stiften fest ist und hält.</li>
	<li>Spülen Sie die Stifte in kaltem Wasser ab und trocknen Sie sie dann ab.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Leitfähigkeit zwischen Pin 1 und Pin 2 mit einem Ohmmeter.</li>
	<li>Bringen Sie die Stifte an den Enden des Drahtes zusammen; Halten Sie sie parallel und dicht. Klemmen Sie einen Hämostat an die Mitte des Drahtes. Drehen Sie dann den Hämostat, so dass sich der Draht ziemlich fest um sich selbst dreht. Entfernen Sie den Hämostat.</li>
	<li>Klemmen Sie eine Pinzette auf den verdrillten Draht 2 mm unter den Stiften und biegen Sie den Draht um 90°.</li>
	<li>Schieben Sie den gleichen Draht erneut um 90° über die Pinzette zurück, um eine weitere Biegung von 1 mm von der ersten zu erzeugen.</li>
	<li>Schneiden Sie den verdrillten Draht in einem Winkel von 45° unterhalb der Biegung bei 3,5 mm mit einer kleinen scharfen Schere ab.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei dieser bipolaren (doppelpoligen verdrillten) Elektroden für jedes Headset vor (optional, zweite ist Backup bei elektrischen Problemen mit dem ersten).</li>
	<li>Bereiten Sie eine einzelne Referenzelektrode vor, indem Sie einen Draht mit an beiden Enden verlöteten Stiften in zwei Teile schneiden (Schritte 1.1-1.17, Abbildung 1A).</li>
	<li>Schneiden Sie den Draht bei 7 mm ab.</li>
	<li>Biegen Sie das Ende 1 mm unter die Spitze.</li>
	<li>Decken Sie dann die gebogene 1-mm-Spitze des Drahtes mit einer Pinzette ab und drehen Sie den Draht fest um die Pinzette, um eine kleine Schlaufe (1 mm Durchmesser) zu erzeugen.</li>
	<li>Biegen Sie die Schlaufe senkrecht zum geraden Teil des Drahtes, damit die Drahtspitze wieder nach außen zeigt.</li>
	<li>Montieren Sie die beiden bipolaren Elektroden und die einzelne Referenzelektrode so in den sechspoligen Sockel, dass die bipolaren Elektroden mit einem Abstand von 6 mm nebeneinander liegen und die Referenzelektrode im mittleren äußeren Loch platziert wird (Abbildung 1B). HINWEIS: Eine alternative Methode besteht darin, die Elektroden zu implantieren, sie zu zementieren und dann ihre Stifte in den Sockel einzuführen.</li>
</ol>2. Stereotaktische Elektrodenimplantation
<ol><li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und die sechspolige Elektrodenbaugruppe durch Autoklavieren vor der Operation. Während der Operation muss ein steriles Operationsfeld aufrechterhalten werden, und es müssen sterile OP-Handschuhe verwendet werden. Sterile Abdecktücher (z. B. Press n' Seal) werden empfohlen, um das Tier mit Ausnahme des Operationsbereichs abzudecken.</li>
	<li>Verwenden Sie 8 Wochen alte VGAT-Cre-Mäuse (altersangepasst, sowohl männlich als auch weiblich) für Operationen 4 Wochen nach dem Absetzen. Notieren Sie das Gewicht des Tieres vor der Operation, um die Messung des postoperativen Gewichtsverlusts zu ermöglichen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen zertifizierten Isofluran-Vaporizer oder ein Low-Flow-Anästhesiesystem, das mit einer Präzisionsspritzenpumpe, einem integrierten digitalen Vaporizer und einem Feedback-Wärmekissen ausgestattet ist. HINWEIS: Low-Flow-Systeme sind in der Lage, eine Anästhesie mit niedrigen Flussraten proportional zur Größe des Tieres entweder in eine Induktionskammer oder durch einen Nasenkegel auf dem stereotaktischen Rahmen durchzuführen (70 ml/min, Isoflurankonzentration in der Luft beträgt 4% für die Induktion und 2% für die Operation). Die Verwendung einer geringeren Anästhesie kommt nicht nur dem Tier während der Operationen zugute, sondern verringert auch das Risiko, dass das Laborpersonal Isofluran ausgesetzt ist.</li>
	<li>Legen Sie das betäubte Tier auf ein auf 37 °C erwärmtes Heizkissen, um es während der Operation warm zu halten. Wenn Sie ein rückkopplungsgesteuertes Temperatursystem verwenden, führen Sie die leicht geschmierte Temperatursonde zur Temperaturüberwachung während der Operation in das Rektum des Tieres ein.</li>
	<li>Montieren Sie das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig in die Ohren und die vorderen oberen Zähne in den Schneidezahn stecken. Platzieren Sie den Nasenkegel über der Nase, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass der Kopf nivelliert und zentriert ist und bei leichter Sondierung nicht bewegt werden kann.</li>
	<li>Injizieren Sie subkutan 0,5 ml Normosol zur Hydratation.</li>
	<li>Tragen Sie Augenschmiermittel auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen des Entzugsreflexes nach dem Einklemmen eines Hinterbeins, und senken Sie dann Isofluran während der Operation auf 1,5% -2,0%.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haare am und um den Operationsbereich durch Zupfen oder mit einer Haarschneidemaschine (Rasur) oder Enthaarungscreme und desinfizieren Sie die Haut mit drei Zyklen abwechselnder Anwendung von Jod und Ethanol und beenden Sie sie mit Jod. Das Entfernen von Haaren von der Operationsstelle wird nur empfohlen, wenn an dieser Stelle Mittel zur Aufrechterhaltung der Anästhesie vorhanden sind. Verwenden Sie bei Bedarf in Alkohol getauchte Baumwollspitzenapplikatoren, um Haare aus der unmittelbaren Umgebung des Kopfes zu entfernen. Injizieren Sie 0,05 ml des lokalen Analgetikums Bupivacain (0,25%) subkutan.</li>
	<li>Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schädel und schneiden Sie dann mit einer scharfen chirurgischen Schere einen Teil der Haut heraus, um den Schädel freizulegen. Schieben Sie die Haut mit einem Wattestäbchen beiseite und reinigen Sie den Schädel von allen Muskeln und darunter liegenden Geweben, die die Sicht behindern. HINWEIS: Um versehentliche Blutungen zu stoppen, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Druck auf die Blutungsstelle aus, bis sie aufhört.</li>
	<li>Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und sterilen Wattestäbchen, um die Schädelnähte und sowohl Bregma als auch Lambda sichtbar zu machen.</li>
	<li>Trocknen Sie den Schädel gründlich ab und tragen Sie dann einen Tropfen selbstätzenden Zahnkleber mit dem Applikator auf. Bürsten Sie es in den Schädel, warten Sie 60 s und härten Sie 40 s lang mit einem zahnärztlichen UV-Licht aus. Eine glänzende Oberfläche zeigt an, dass der Klebstoff effektiv mit dem Schädel vernetzt wurde. HINWEIS: Dieser Schritt ist für die sichere Befestigung des Headsets von entscheidender Bedeutung.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 0,031-Zoll-Bohrer (0,79 mm), um zwei Gratlöcher beidseitig für die Implantation von Hippocampus-Tiefenelektroden (ca. 5.000 U/min) zu bohren. Bohren Sie ein zusätzliches Gratloch für die Referenzelektrode über dem Kleinhirn hinter dem Lambda. HINWEIS: Achten Sie beim Bohren darauf, den Bohrer langsam abzusenken und vermeiden Sie es, in das Gehirn zu bohren.</li>
	<li>Die Koordinaten für die Elektroden lauten wie folgt (von Bregma in mm): Hippocampus-Elektroden 3 mm hinter, 3 mm seitlich und 3 mm tief; und zerebelläre Referenzelektrode bei 6 mm hinterem, 0 mm seitlich und 0 mm Tiefe (subdural).</li>
	<li>Um die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden Sie einen stereotaktisch montierten Bohrer und stellen Sie die x/Y-Achse des stereotaktischen Manipulators beim Berühren von Bregma auf Null - dies ist der Bezugspunkt für die Koordinaten.</li>
	<li>Montieren Sie ein Headset, indem Sie alle Elektroden in den sechspoligen Sockel einführen und sicherstellen, dass die Stifte vollständig in den Sockel geschoben werden. Montieren Sie den Sockel im Elektrodenhalter auf einem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 1B).</li>
	<li>Richten Sie die Elektroden über den entsprechenden Gratlöchern aus. Implantieren Sie stereotaktisch verdrillte bipolare Edelstahldrahtelektroden im rechten und linken Hippocampus und in der Referenzelektrode in das Kleinhirn, indem Sie das Headset langsam absenken und die Elektroden in die Gratlöcher führen.</li>
	<li>Wenn sich die Hippocampus-Drehelektrode direkt über dem Loch befindet, stellen Sie die Z-Achse auf Null und senken Sie sie langsam auf -3,0 mm ab.</li>
	<li>Decken Sie die Schädeloberfläche und die Elektroden mit Zahnzement ab und füllen Sie den Raum zwischen der Schädeloberfläche und dem Boden des Sockels aus. Die Hautränder grenzen an den Zahnzement an, so dass kein darunter liegendes Gewebe freiliegt. Warten Sie, bis der Zement getrocknet und ausgehärtet ist. Lösen Sie dann den Elektrodenhalter vom stereotaktischen Arm und entfernen Sie den Halter vom Sockel.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,1 ml Ketoprofen (1 mg/ml, SC) zur Analgesie und eine zweite Dosis von 0,5 ml Normosol (SC) zur Flüssigkeitszufuhr und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen.</li>
	<li>Legen Sie ein auf 37 °C vorgeheiztes Isothermenkissen in einen leeren Vivariumkäfig, der mit einem Papiertuch bedeckt ist. Sobald es vollständig wach ist, legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Einstreu und weichem Futter und bringen Sie es in das Vivarium zurück. Die Tiere werden ab diesem Zeitpunkt einzeln untergebracht, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig an den Headsets kauen. Drahtstangentrichter werden nicht verwendet, um zu vermeiden, dass Headsets stecken bleiben, sondern Wasserflaschen werden an der Unterseite der Käfigoberseiten befestigt, und Chow ist in der Einstreu vorhanden.</li>
	<li>Füttern Sie das Tier nach der Operation 72 Stunden lang mit weichem Futter und überwachen Sie den Gewichtsverlust und den Körperzustand. Dehydrierten Tieren können 0,5 ml Normosol subkutan verabreicht werden, wenn sie dehydriert sind (Gewichtsverlust, erhöhter Hautturgor, eingefallene Augen). Ketoprofen kann nach der Operation einmal täglich für weitere 2 Tage subkutan verabreicht werden (befolgen Sie das Analgesieschema gemäß den lokalen IACUC-Richtlinien). Lassen Sie die Tiere 4-7 Tage lang in ihren Käfigen vollständig erholen, bevor Sie sie in das EEG-Aufzeichnungssystem überführen.</li>
</ol>3. Elektrisches Anzündprotokoll
<ol><li>Schließen Sie die Mäuse mit einem flexiblen Kabel an das EEG-Aufzeichnungssystem an, das in die Buchsen des Mauskopfes und des Kommutators passt (siehe Materialtabelle ). Lassen Sie die Tiere einen Tag lang akklimatisieren, bevor Sie mit dem folgenden Elektrostimulationsprotokoll fortfahren. Überwachen Sie täglich ihren allgemeinen Gesundheitszustand und ihre Akklimatisierung und entfernen Sie sie aus dem System, wenn Anzeichen von Krankheit, Stress und/oder kontinuierlichem Körpergewichtsverlust von mehr als 25% vorliegen</li>
	<li>Verbinden Sie beide Leitungen von der Stimulationselektrode mit dem Ausgang eines Konstantstromstimulators. HINWEIS: Es ist sehr hilfreich, eine Leiterplatte zu haben, die diese Elektroden vom EEG-Rekorder weg und zum Stimulator schaltet.</li>
	<li>Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er 1 ms Impulse bei 50 Hz für eine Zugdauer von 2 s liefert.</li>
	<li>Stellen Sie den Ausgang des Stimulators auf 20 Mikroampere (μA) ein und geben Sie den 1. Impuls ab.</li>
	<li>Überwachen Sie das EEG auf eine charakteristische Nachentladung von hochfrequenten Spitzen, die den elektrischen Stimulationsimpuls überdauern.</li>
	<li>Wenn keine Entladung beobachtet wird, erhöhen Sie die eingespeiste Strommenge in Schritten von 20 μA, bis eine Nachentladung ausgelöst wird. Die erforderliche Strommenge ist die Nachentladungsschwelle (ADT).</li>
	<li>Typische ADTs sind 20-50 μA. Wenn auch nach dem Erhöhen auf 200 μA keine Entladung beobachtet wird, ist eine Fehlerbehebung bei elektrischen Verbindungen und der Verkabelung des Headsets mit einem hochempfindlichen Ohmmeter erforderlich. Wenn das Problem in der Stimulationselektrode liegt, versuchen Sie, mit den anderen Tiefenelektroden zu stimulieren.</li>
	<li>Die Tiere werden entzündet, indem sie entweder 2x oder 6x pro Tag mit einem Strom stimuliert werden, der dem 1,5-fachen des ADT-Wertes für diese Maus entspricht.</li>
	<li>Überwachen Sie die Verhaltensreaktion auf die Stimulation, die vom Zustandswechsel zu bilateralen tonisch-klonischen Anfällen mit Sturz ansteigt. Punktzahl mit einem modifizierten Racine-Klassensystem11. Um evozierte tödliche tonische Anfälle zu vermeiden, sollte das Anzünden unterbrochen werden, wenn aufeinanderfolgende Reize zu einer eskalierenden Schwere und Dauer der Anfälle bis zu einem modifizierten Racine-Score 6 (Laufen und Springen) führen</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, bei dem elektrisches Anzünden von Mäusen zu Epilepsie führt. Da sich die Stimulationselektrode im Hippocampus befindet, handelt es sich um eine fokale limbische Epilepsie, die die Temporallappenepilepsie (TLE) bei Patienten modelliert. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von VGAT-Cre-Mäusen, die aufgrund der Insertion einer IRES-Cre-Rekombinase-Kassette in das Vgat-Gen beeinträchtigte inhibitorische GABA-Ströme aufweisen11...

Epilepsie ist eine schwere neurologische Erkrankung mit erheblichen wirtschaftlichen und menschlichen Belastungen. NINDS schätzt, dass es 3 Millionen Amerikaner mit Epilepsie gibt. Etwa 0,6 Millionen dieser Patienten leiden an Temporallappenepilepsie (TLE)1. Leider scheitert die medikamentöse Behandlung von TLE bei einem Drittel der Patienten aufgrund von Unwirksamkeit, Entwicklung von Arzneimittelresistenzen oder Unverträglichkeit gegenüber Nebenwirkungen2. Es besteht eindeutig ein erheblicher Bedarf, neuartige Therapien für TLE zu entwickeln, eine Schlussfolgerung, die vom Basic Science Committee der American Epilepsy Society, der International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery und dem National Advisory Neurological Disorders and Stroke Councilgeteilt wird 3,4.
Aktuelle Tiermodelle der Temporallappenepilepsie verwenden entweder Chemokonvulsiva (z. B. Kainat, Pilocarpin) oder eine verlängerte elektrische Stimulation, um einen lang anhaltenden Status epilepticus zu induzieren 5,6,7. Viele Tiere sterben während des Eingriffs (10%-30% bei Ratten, bis zu 90% bei Mäusen8). Tiere, die überleben und Epilepsie entwickeln, zeigen einen ausgedehnten neuronalen Tod im gesamten Gehirn 9,10. Dieser Tod löst eine Kaskade von Reaktionen aus, beginnend mit der Aktivierung von Mikroglia, Astrozyten und infiltrierenden Monozyten. Zu den neuronalen Reaktionen gehören die Reorganisation von Schaltkreisen (z. B. das Keimen moosiger Fasern), die Geburt neuer Neuronen, die sich nicht richtig in Schaltkreise integrieren (z. B. ektopische Körnerzellen), und intrinsische Veränderungen, die zu Übererregbarkeit führen (z. B. Hochregulierung von Na+-Kanälen). Ein Epilepsiemodell ohne signifikanten neuronalen Tod wird die Suche nach neuen Antiepileptika erleichtern.
Beim Testen der GABA-Hypothese der Epilepsie wurde entdeckt, dass die Behandlung von VGAT-Cre-Mäusen mit einem milden elektrischen Anzündprotokoll zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte11. Im Allgemeinen führt das elektrische Anzünden von Nagetieren nicht zu spontanen Anfällen, die Epilepsie definieren, obwohl dies bei übermäßigem Anzünden der Fall sein kann11. VGAT-Cre-Mäuse exprimieren die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Gens (VGAT), das spezifisch in GABAergen inhibitorischen Neuronen exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass die Insertion von Cre die Expression von VGAT auf mRNA- und Proteinebene stört und somit die GABAerge synaptische Übertragung im Hippocampus beeinträchtigt. Es wurde der Schluss gezogen, dass entzündete VGAT-Cre-Mäuse nützlich sein könnten, um die Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen und neue Therapeutika zu untersuchen11. Der vorliegende Bericht beschreibt die Methoden, die bei der Erstellung des Modells verwendet werden, im Detail.

<table><tbody><tr><td>16-Kanal-extrazellulärer differenzieller AC-Verstärker (115 V / 60 Hz)</td> <td>AD Instruments</td><td>AM3500-115-60</td><td>Alternativer EEG-Verstärker</td></tr><tr><td>363/CP-STECKERKRAGEN, STIFTHÜLSE</td><td>P1 Technologies</td><td>363SLEEVPIN0NL</td><td>Für Elektrodenhalter</td></tr><tr><td>Kabel, 363-363 5CM - 100CM W / MESH 6TCM</td><td>P1 Technologies</td><td>363363XXXXCM004</td><td>Maus-zu-Kommutator-Kabel</td></tr><tr><td>CCTV-Kameras Qcwox HD Sony IR LED</td><td>Sony</td><td>QC-SP316</td><td></td></tr><tr><td>Kommutator SL6C/SB (Einzelbürste)</td><td>P1 Technologies</td><td>8BSL6CSBC0MT</td><td>ehemals Plastics One, Inc.</td></tr><tr><td>Stromverstärker</td><td>A-M Systems</td><td>Modell 2100</td><td></td></tr><tr><td>Dentalzement</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer, #75, OD&nbsp; 0.310" LOC 130 PT</td><td>Kyocera</td><td>105-0210.310</td><td></td></tr><tr><td>E363/0 BUCHSE KONTAKT SKEWED</td><td>P1 Technologies</td><td>8IE3630XXXXE</td><td>Pins für Steckverbinder</td></tr><tr><td>iBond Self Etch Kleber</td><td>Kulzer</td><td>CE0197</td><td></td></tr><tr><td>MS363 SOCKEL 2298 6 PIN WEISS</td><td>P1 Technologies</td><td>8K000229801F</td><td>EEG-Headset-Anschluss</td></tr><tr><td>Ohmeter</td><td>Simpson</td><td>260</td><td>Hochempfindliche</td></tr><tr><td>PowerLab 16/35 und LabChart Pro</td><td>AD Instruments</td><td>PL3516/P</td><td>Alternative EEG-Software</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>SS-01</td><td>Anästhesieeinheit & RightTemp-Überwachung</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Bohrer und Mikromotor-Kit</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 940</td><td></td></tr><tr><td>Teflonbeschichteter Draht für Tiefenelektrode, OD 0,008'A-M</td> <td>Systems</td><td>791400</td><td></td></tr><tr><td>VGAT-Cre Mäuse auf kongenem C57BL/6J Hintergrund</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

präparation und implantation von elektroden für elektrisch anzündende vgat-cre-mäuse zur erstellung eines modells für temporallappenepilepsie

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

Es wurde entdeckt, dass das elektrische Anzünden von VGAT-Cre-Mäusen zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte. Eine kürzlich erschienene Arbeit konzentrierte sich darauf, wie einzigartige VGAT-Cre-Mäuse bei der Entwicklung spontan wiederkehrender Anfälle (SRS) nach dem Anzünden verwendet wurden, und ein wahrscheinlicher Mechanismus - die Insertion von Cre in das VGAT-Gen - störte seine Expression und reduzierte den GABAergen Tonus. Die vorliegende Studie dehnt diese Beobachtungen auf eine größere Kohorte von Mäusen aus und konzentriert sich auf Schlüsselfragen wie die Dauer des SRS nach dem Anzünden und die Auswirkungen des Geschlechts und des Alters des Tieres. Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die folgenden wichtigen Schritte: Herstellung von Headsets mit Hippocampus-Tiefenelektroden zur elektrischen Stimulation und zum Lesen des Elektroenzephalogramms; Operation, um das Headset sicher am Schädel der Maus zu befestigen, damit es nicht herunterfällt; und wichtige Details des elektrischen Anzündprotokolls wie Dauer des Impulses, Frequenz des Zuges, Dauer des Zuges und Menge des eingespeisten Stroms. Das Anzündprotokoll ist insofern robust, als es bei den meisten VGAT-Cre-Mäusen zuverlässig zu Epilepsie führt und ein neues Modell zum Testen auf neuartige Antiepileptogene Medikamente darstellt.

Tiere Das Modell wurde ursprünglich mit VGAT-Cre-Mäusen (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 auf einem gemischten Hintergrund entwickelt. Es wurde jedoch auch auf den VGAT-Cre-Stamm angewendet, der mit C57BL/6J kongen ist. Bei der Epilepsie, die sich zwischen den Stämmen entwickelt, wurde kein Unterschied beobachtet. Beide Stämme exprimieren die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Promotors. Diese Mäuse wurden durch Einklopfen einer IRES-Cre-Kas...

Dieser Bericht beschreibt die Methoden zur Erstellung eines Modells der Temporallappenepilepsie, das auf dem elektrischen Anzünden transgener VGAT-Cre-Mäuse basiert. Entzündete VGAT-Cre-Mäuse können nützlich sein, um die Ursachen von Epilepsie zu bestimmen und neue Therapien zu untersuchen.

Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Dieses Protokoll generiert ein neues Modell für die Temporallappenepilepsie, bei der Mäuse spontane Anfälle entwickelten, und es war sehr nützlich, um die Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen und auch neue Therapien zu untersuchen. Dieses Verfahren bei VGAT-Cre-Mäusen führt zuverlässig zu spontan wiederkehrenden elektrographischen und motorischen und motorischen Kompositanfällen, ohne dass es zu einem ausgedehnten Hippocampus-Zelltod kommt, der häufig nach einem Status epilepticus auftritt, der durch Chemokonvulsiva oder kontinuierliche elektrische Stimulation ausgelöst wird. Um mit der Herstellung von Headsets zu beginnen, schneiden Sie einen 3,5 Zentimeter langen Polytetrafluorethylen-beschichteten Edelstahldraht ab und streifen Sie etwa einen Millimeter der Isolierschicht von beiden Enden des Drahtes ab.Setzen Sie zwei Stifte auf einen Schraubstockhalter, wobei der untere Teil des Stifts einen längeren Schlitz nach unten hat. Tragen Sie dann Flussmittel auf die abisolierten Enden des Drahtes und die Oberseite der Stifte auf. Verzinnen Sie den abisolierten Teil des Drahtes und die Oberseite der Stifte mit gerade genug Löt, um ihn zu beschichten, ohne auf die Seiten überzulaufen.Stecken Sie eines der abisolierten Enden des Drahtes so tief wie möglich in den Stift, während das Lot schmilzt. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Pin mit dem anderen abisolierten Ende des Kabels. Nachdem Sie die Stifte abgekühlt und 10 Sekunden lang gelötet haben, entfernen Sie die Stifte aus dem Schraubstockhalter und ziehen Sie dann an den Stiften, um sicherzustellen, dass die Verbindung zwischen dem Draht und den Stiften fest ist und hält.Spülen Sie die Stifte in kaltem Wasser ab und trocknen Sie sie anschließend. Verwenden Sie später ein Ohmmeter, um die Leitfähigkeit zwischen Pin eins und Pin zwei zu überprüfen. Bringen Sie die Stifte am Ende des Drahtes zusammen, um sie parallel und nahe beieinander zu halten.Klemmen Sie einen Hämostat an die Mitte des Drahtes und drehen Sie den Hämostat, um den Draht fest um sich selbst zu drehen. Nachdem Sie den Hämostat entfernt haben, klemmen Sie die Pinzette zwei Millimeter unterhalb der Stifte auf den verdrillten Draht, um den Draht um 90 Grad zu biegen. Schieben Sie den Draht um 90 Grad zurück über die Pinzette und erzeugen Sie eine weitere Biegung um einen Millimeter von der ersten.Verwenden Sie eine kleine, scharfe Schere, um den verdrillten Draht in einem Winkel von 45 Grad und 3,5 Millimetern unter der Biegung zu schneiden. Bereiten Sie für jedes Headset zwei bipolare oder doppelpolige verdrillte Elektroden vor. Um eine Referenzelektrode herzustellen, schneiden Sie einen Draht mit einem an beiden Enden gelöteten Stift in zwei Teile.Schneiden Sie dann den Draht bei sieben Millimetern ab und biegen Sie das Ende des Drahtes einen Millimeter unterhalb der Spitze. Decken Sie die gebogene Ein-Millimeter-Spitze des Drahtes mit einer Pinzette ab und drehen Sie den Draht fest um die Pinzette, um eine kleine Schlaufe mit einem Durchmesser von einem Millimeter zu erzeugen. Biegen Sie dann die Schlaufe senkrecht zum geraden Teil des Drahtes, damit die Drahtspitze wieder nach außen zeigt.Montieren Sie alle Elektroden nebeneinander in den sechspoligen Sockel mit einem Abstand von sechs Millimetern zwischen den beiden bipolaren Elektroden. Platzieren Sie die Referenzelektrode in der mittleren äußeren Bohrung. Bevor Sie mit der Operation fortfahren, notieren Sie das Gewicht der acht Wochen alten VGAT-Cre-Mäuse.Legen Sie das Tier dann in eine Induktionskammer, um eine Anästhesie einzuleiten. Legen Sie die betäubte Maus bei 37 Grad Celsius auf ein Heizkissen. Wenn Sie ein rückkopplungsgesteuertes Temperatursystem verwenden, führen Sie die Temperatursonde zur Temperaturüberwachung während der Operation in das Rektum des Tieres ein.Um die Operation zu beginnen, leiten Sie den Inhalationsanästhesiefluss zum Nasenkegel um und montieren Sie das Tier im stereotaktischen Rahmen, indem Sie die vorderen oberen Zähne vorsichtig in den Schneidezahn legen und den Kegel auf die Nase bewegen. Setzen Sie dann die Ohrbügel in die Ohren ein und befestigen Sie sie am stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres waagerecht und zentriert ist und bei leichter Sondierung nicht bewegt werden kann.Sobald das Tier montiert ist, injizieren Sie den Mäusen 0,5 Milliliter Normosol zur Flüssigkeitszufuhr und tragen Sie Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Pfote der Hinterbeine kneifen. Wenn der Rückzugsreflex beim Tier fehlt, entfernen Sie die Kopfhaare der Maus um den Operationsbereich herum.Wenn Sie fertig sind, desinfizieren Sie den sauberen Hautbereich dreimal mit einer abwechselnden Anwendung von Ethanol und Jod, schließen Sie mit Jod ab und injizieren Sie 0,05 Milliliter 0,25% Bupivacain subkutan. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schädel und schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen Teil der Haut heraus, wodurch der Schädel freigelegt wird. Schieben Sie die Haut beiseite, bevor Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen von allen darunter liegenden Geweben reinigen.Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid mit sterilen Wattestäbchen und machen Sie die Schädelnähte, Bregma und Lambda sichtbar. Bewegen Sie mit dem stereotaktisch montierten Bohrer die Bohrspitze in null X-, Y- und Z-Koordinaten auf Bregma. Heben Sie dann den Bohrer an und bewegen Sie ihn auf Lambda, um seine Koordinaten zu bestimmen und festzustellen, ob der Kopf waagerecht ist.Nachdem Sie den Schädel gründlich getrocknet haben, tragen Sie mit dem Applikator einen Tropfen selbstätzenden Zahnkleber auf. Warten Sie 60 Sekunden, bevor Sie den Zahnkleber 40 Sekunden lang mit einem zahnärztlichen UV-Licht aushärten. Eine glänzende Oberfläche zeigt an, dass der Klebstoff effektiv mit dem Schädel vernetzt wurde.Bohren Sie mit Hilfe eines 0,031-Zoll-Bohrers vorsichtig zwei Gratlöcher beidseitig mit 5.000 Umdrehungen pro Minute (U / min) in den Schädel, um ein Bohren in das Gehirn zu vermeiden. Tragen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf, um das Bohren der Gratlöcher zu verbessern. Für die Implantation von Elektroden mit Hippocampustiefe bohren Sie drei Millimeter hinterher und drei Millimeter seitlich von Bregma.Bohren Sie ein Bohrloch für die Referenzelektrode über dem Kleinhirn hinter dem Lambda sechs Millimeter hinter und null Millimeter seitlich von Bregma. Als nächstes montieren Sie den sechspoligen Sockel mit montierten Elektroden in den Elektrodenhalter auf dem stereotaktischen Rahmen. Indem Sie die Elektroden über den entsprechenden Gratlöchern ausrichten, senken Sie das Headset langsam ab und navigieren Sie es, um die beiden bipolaren Elektrodenspitzen direkt über den linken und rechten Hippocampus-Gratlöchern zu lokalisieren, und stellen Sie die Referenzelektrode bei Bedarf so ein, dass sie über dem Loch über dem Kleinhirn schwebt.Wenn sich die Hippocampus-Drehelektroden direkt über den Löchern befinden, stellen Sie die Z-Achse auf Null und senken Sie die Elektrode langsam auf minus drei Millimeter in den rechten und linken Hippocampus ab und führen Sie die Referenzelektrode in das Loch über dem Kleinhirn. Bereiten Sie den Zahnzement vor, indem Sie das Pulver und die Flüssigkeit in einer Rührschüssel mischen. Decken Sie dann die Schädeloberfläche, die Elektroden und den Raum zwischen der Schädeloberfläche und der Unterseite des Sockels mit Zahnzement ab.Sobald der Zement getrocknet und ausgehärtet ist, lösen Sie den Elektrodenhalter vom stereotaktischen Arm, heben Sie den Arm an und entfernen Sie den Halter vom Sockel. Nachdem Sie der Maus Ketoprofen und Normosol subkutan verabreicht haben, entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, um das Tier auf das beheizte Pad im Vivariumkäfig zu bewegen. Sobald Sie vollständig wach sind, bringen Sie das einzelne Tier in den Vivariumkäfig zurück, füttern Sie das Tier mit weichem Futter und überwachen Sie den Gewichtsverlust täglich bis zu 72 Stunden nach der Operation.Im repräsentativen Geigendiagramm wird die Anzahl der Stimulationen gezeigt, die Mäuse für das Kriterium des entzündeten Zustands benötigen. Die Mäuse erreichten typischerweise den entzündeten Zustand oder erlitten nach 15 Stimulationen fünf bilaterale tonisch-klonische motorische Anfälle. Die Latenz zu spontan wiederkehrenden Anfällen (SRS) betrug 10,7, und die durchschnittliche Häufigkeit der Anfälle betrug 1,3 Anfälle pro Tag.Die zuverlässige SRS-Verteilung zeigte, dass die Mäuse etwa 23 Tage lang epileptisch waren. In den repräsentativen Bildern ist die Anzahl der Anti-NeuN-positiven Neuronen oder neuronalen Todesfälle in verschiedenen Teilbereichen des Hippocampus und des entorhinalen Kortex zu sehen. Es ist wichtig, dass die beiden bipolaren Elektroden reibungslos in die beiden Gratlöcher eindringen, daher müssen sie sich direkt über den Gratlöchern befinden.Außerdem ist es wichtig, den Zahnzement sorgfältig aufzutragen und vollständig aushärten zu lassen, bevor der Elektrodenhalter entfernt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, epileptische Mäuse zu erzeugen und sie gleichzeitig kontinuierlich mit EEG-Aufzeichnung und Videoaufzeichnung zu überwachen. Und mit den Experimenten, die wir durchführen, können wir dann neuartige Behandlungsstrategien wie Gentherapie testen, um die Häufigkeit, Dauer und Schwere der Anfälle zu reduzieren.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Teilweise isoliert Cortex ("unterboten") ist ein effizientes Tiermodell der posttraumatischen Epileptogenese. Hier zeigen wir, wie eine neuartige chirurgische Gerät zu machen und es verwenden, um genauere und konsistente Läsionen zu machen, um dieses Modell zu generieren.

Vorbereitung Undercut Modell Posttraumatische Epileptogenese in Nagetiere

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Implantation einer Elektrodenanordnung in ein Mäusegehirn. Die Anordnung enthält bipolare Elektroden zur Aufzeichnung der Aktivität aus dem Hippocampus und eine Referenzelektrode zur Ermittlung der Basisaktivität aus dem Kleinhirn. Eine anästhesierte Maus wird auf einen stereotaktischen Rahmen gelegt, und die Elektrodenanordnung wird in die Zielregion des Gehirns implantiert. Das Tier kann sich dann erholen, bevor es eine elektrophysiologische...

Implantation einer Elektrodenanordnung in ein Mäusegehirn zur elektrophysiologischen Aufzeichnung

Studien haben gezeigt, dass die kathodale transkranielle Gleichstromstimulation suppressive Effekte auf arzneimittelresistente Anfälle haben kann. In dieser Studie wurde ein in vitro Versuchsaufbau entwickelt, in dem die Gleichstromstimulation und die Aufzeichnung der anfallsähnlichen Aktivität durch Multielektrodenarrays bei der Präparation von Hirnschnitten von Mäusen evaluiert wurden. Die Gleichstrom-Stimulationsparameter wurden ausgewertet.

Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Diese Arbeit demonstriert die Leistung von Akupunktur, Epilepsiemodellen und der Analyse des Schlafes bei Nagetieren. Das Verfahren der Akupunktur und die Identifizierung von Akupunkturpunkten werden beschrieben. Pilocarpin oder Pentylentetrazol (PTZ) wird verwendet, um Epilepsie zu induzieren. Für die Schlafanalyse werden Elektrokortikogramm (ECoG), Elektromyogramm (EMG), Gehirntemperatur und Bewegungsaktivitätsaufzeichnungen verwendet.

Manipulation von Epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) und Schlaf bei Ratten und Mäusen durch Akupunktur

Dieses ausführliche Protokoll beschreibt Transkranielle Stimulation Elektrode Platzierung auf dem Felsenbein um die kurz- und langfristigen Auswirkungen der transkraniellen Elektrostimulation im frei beweglichen Ratten zu untersuchen.

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode des Verursachens Status Epilepticus durch systemische Pilocarpin Injektion und spontane wiederkehrende Anfälle mit lebenden Tieren, die mit einem drahtlosen Telemetrie video und Elektroenzephalogramm System zu überwachen. Dieses Protokoll kann genutzt werden, für das Studium der pathophysiologische Mechanismen der chronischen Epilepsie, Epileptogenesis und akute Anfälle.

Das Pilocarpin Modell der Temporallappen-Epilepsie und EEG Monitoring mittels Radiotelemetrie System bei Mäusen

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Die Herausforderung der Epilepsie-Forschung besteht darin, neuartige Therapien für Patienten zu entwickeln, bei denen die klassische Therapie unzureichend ist. Mit Hilfe eines neuen Protokolls — mit Hilfe eines implantierbaren Arzneimittelliefersystems — sind wir in der Lage, Anfälle bei anästhesierten Mäusen durch die elektrophoretische Lieferung von GABA in den epileptischen Fokus zu steuern.

Elektrophoretische Lieferung von, in der Aminobutyrische Säure (GABA) in den Epileptischen Focus verhindert die Beschlagnahmungen in Mäusen

Die Amygdala spielt eine Schlüsselrolle bei der Temporallappenepilepsie, die in dieser Struktur entsteht und sich von ihr ausbreitet. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von Tiefenhirnelektroden mit Aufzeichnungs- und Stimulationsfunktionen. Es stellt ein Modell der medialen Temporallappenepilepsie vor, das von der Amygdala ausgeht.

Verwendung einer bipolaren Elektrode zur Erstellung eines Temporallappen-Epilepsie-Mausmodells durch elektrisches Anzünden der Amygdala

Lernen Sie die Präparation und Implantation von Elektroden zur Erstellung eines Temporallappenepilepsie-Modells bei VGAT-Cre-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Anfallsmechanismen und die Entwicklung neuer Therapien.

Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie (Video) | JoVE Journal

Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie

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