Gemultiplexte fluoreszierende immunhistochemische Färbung von vier endometrialen Immunzelltypen bei wiederkehrenden Fehlgeburten
4. August 2021
Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.
Die derzeitige Technologie ermöglicht die Verwendung von Antikörpern, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um bis zu sieben Marker nachzuweisen. Das Verfahren wird von Loucia Chan, einem Techniker aus dem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der formalinfesten paraffininierten Glasobjektträger, die mit der Gewebeprobe montiert sind, indem Sie die Objektträger flach in einen Ofen legen, um bei 60 Grad Celsius mit dem Gewebe nach oben zu backen.
Nach einer Stunde entwachsen und rehydrieren Sie die Objektträger pro 10 Minuten mit der Reihe von Chemikalien, wie im Manuskript beschrieben. Tauchen Sie die Objektträger in tris-gepufferte Kochsalzlösung und dann in einen Kunststoff-Objektträgerkasten, der mit einer Mischung aus in Methanol verdünntem Formaldehyd gefüllt ist, um die Proben zu fixieren. Als nächstes waschen Sie die Folien zweimal in entionisiertem Wasser für zwei Minuten.
Fahren Sie mit der Epitopentnahme fort, indem Sie das Dia-Rack in eine Hitzewiderstandsbox legen, die mit Zitronensäurepuffer bei pH 6,0 gefüllt ist. Und dann legen Sie die Box in die Mikrowelle, um die Folien zuerst mit 100% Leistung für 50 Sekunden zu erhitzen, gefolgt von 20 Minuten bei 20% Leistung, um die gleiche Temperatur zu halten. Nachdem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser gespült und mit TBST gewaschen haben, tauchen Sie den Objektträger 10 Minuten lang in ein Glas mit einer Peroxidationsblockierungslösung.
Nach der Inkubation spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser ab und waschen Sie sie mit TBST, dann verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu markieren. Spülen Sie dann den Objektträger in TBST, bedecken Sie die Gewebeabschnitte mit dem Blockierenpuffer und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 15 Minuten. Um die blockierenden Reagenzien zu entfernen, inkubieren Sie zuerst die Objektträger mit dem primären Antikörper von Interesse und entfernen Sie dann den primären Antikörper, indem Sie die Objektträger dreimal mit TBST waschen, bevor Sie mit der Polymer-Meerrettichperoxidase markierten sekundären Antikörper inkubieren.
Waschen Sie nach der Inkubation die Objektträger, bevor Sie die Opalflora für die TSA-Arbeitslösung auftragen, und spülen Sie den Objektträger dann mit dem Antigen-Retrieval-Puffer ab. Führen Sie das mikrowellenbasierte Stripping durch, indem Sie die Objektträger in einem Antigen-Retrieval-Puffer in einer Mikrowelle bei 100% Leistung für 50 Sekunden erhitzen, gefolgt von 20% Leistung für 20 Minuten in den mikrowellensicheren Behältern. Nachdem die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt sind, spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und TBST ab und inkubieren Sie sie später fünf Minuten lang mit Dappy-Lösung.
Anschließend trocknen Sie den Schlitten vor der Montage mit dem entsprechenden Montagemedium an der Luft. Vor der Bebilderung der Dias werden die entsprechenden Filter in der Workstation voreingestellt. Erfassen Sie mindestens 10 Felder für die Analyse unter 200-facher Vergrößerung.
Um die Zellen zu zählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Objekte zählen in der Schrittleiste, um das Einstellungsfenster für die Objektzählung anzuzeigen. Wenn das Gewebe segmentiert wurde, wählen Sie die Gewebekategorie aus, in der die Objekte zu finden sind. Wählen Sie dann die gewünschte Signalskalierung aus automatischer Skalierung oder fester Skalierung aus.
Wählen Sie für die Objektsegmentierung die Hauptkomponente aus der Dropdown-Liste aus. Um Objekte zu erkennen, die andere Objekte berühren, als einzelne und nicht kombinierte Objekte, aktivieren Sie das Kontrollkästchen maximale Größe und Pixel und entscheiden Sie sich dann für die verfeinerte Aufteilung. Als nächstes zählen Sie alle Stromazellen in den Immunzellen separat, um die Daten als Prozentsatz der Immunzellen relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen für jedes aufgenommene Bild auszudrücken.
Geben Sie später die endgültige Zellanzahl als Durchschnitt aller Felder an. Untersuchen Sie mit dem Ansichtseditor die resultierenden Datentabellen nach der Verarbeitung und exportieren Sie dann die Zähldatentabelle. In der repräsentativen Analyse werden wir vier Immunzelltypen in der Endometriumprobe differenziert.
Das bearbeitete Bild zeigt die Gewebesegmentierung als Epithel- und Stromakompartimente. Das Multiplex-Immunostaining wurde an den Endometriumbiopsien einer fruchtbaren Kontrollfrau und einer Frau mit unerklärlichen rezidivierenden Fehlgeburten durchgeführt, wobei ein einziger Boden für uns, der CD3, CD56, CD68 und CD20 darstellt, in der Immunfärbung aufgedeckt wurde. Sobald der Immunschall identifiziert wurde, kann eine weitere Färbung unter dem Zytokin helfen, ihre Interaktion und ihren Mechanismus für den Implantationserfolg zu adressieren.
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Übersicht
Diese Studie behandelt die Herausforderungen, Dichte und Aggregation der wichtigsten Immunzellen im Endometrium gleichzeitig mittels multiplex Immunhistochemie und multispektraler Bildgebung zu charakterisieren. Ein ausführliches Färbeprotokoll wird beschrieben, um die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium durchzuführen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Immunologie
- Endometriobiologie
- Multiplex-Bildgebungsverfahren
Hintergrund
- Bedeutung der Charakterisierung von Immunzellen in der Fortpflanzungsbiologie.
- Herausforderungen bei herkömmlichen Färbemethoden.
- Fortschritte in der Bildgebungstechnologie.
Verwendete Methoden
- Multiplex-Immunhistochemie
- Formalinfixierte, paraffin-eingebettete Gewebeproben
- Multispektrale Bildgebung
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung von vier Immunzelltypen (CD3, CD56, CD68, CD20) im Endometrium.
- Visualisierung der Verteilung und Aggregation von Immunzellen.
- Bereitstellung von Protokollverbesserungen für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine zuverlässige Methode zur Analyse von Immunzellen im Endometrium.
- Dies hat Auswirkungen auf das Verständnis der Fortpflanzungsgesundheit und des Erfolgs der Implantation.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels multiplexierter fluoreszenter immunhistochemischer Färbung lässt sich die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Immunzellpopulationen innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts durchführen und damit eine entscheidende Lücke in der Forschung zur reproduktiven Immunologie schließen. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung von Hypothesen zum endometrialen Mikromilieu, indem er räumlich aufgelöste, multiplexfähige Immunprofildaten direkt aus patientenstammenden Proben bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung von Zielstrukturen im Zusammenhang mit Implantationsversagen und rezidivierenden Fehlgeburten, da ein direkter Vergleich der Dichte und der Clusterbildung von Immunzellen zwischen fruchtbaren und pathologischen Zuständen ermöglicht wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die immunzelluläre Interaktionen im Endometrium betreffen, durch simultane Detektion der Marker CD3, CD56, CD68 und CD20.
- Operativer Wert: Verringert den Bedarf an seriellen Schnitten und Färbungen, schont wertvolle klinische Proben und erhöht gleichzeitig die Datenmenge pro Gewebeschnitt.
- Vorhersagegenauigkeit: Liefert quantitative, räumlich aufgelöste Metriken für Immunzellen, die die biologische Entschärfung von Zielstrukturen unterstützen, die an der Kommunikation zwischen Endometrium und Immunsystem während der Implantation beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare fluoreszierende Messwerte, die für High-Content-Imaging-Plattformen und automatisierte Bildanalyse-Workflows geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben aus Biobanken, wodurch retrospektive Analysen großer Kohorten für die Biomarker-Entdeckung ermöglicht werden.
- Multiplex-Optimierung: Behebt Fluorophor-Interferenzen durch sequenzielle Färbungs- und Abtragungsschritte und gewährleistet so die Signifikanzspezifität für jeden Marker für Immunzellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinisch relevantes System: Direkt anwendbar auf humane Endometrium-Biopsien und bietet damit ein klinisch relevantes Modell zur Untersuchung einer immunologischen Dysregulation bei rezidivierenden Fehlgeburten.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsorientierte Immunprofillierung mit der präklinischen Validierung, indem eine konsistente Immunphänotypisierung über verschiedene Probenarten hinweg ermöglicht wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Unterstützt die Untersuchung zytokinvermittelter Interaktionen zwischen Immunzellen nach der initialen Identifizierung von Zelltypen und erleichtert so die Validierung von Zielstrukturen auf Ebene der Signalwege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungsbiologiephase ein und unterstützt insbesondere die Validierung immunologischer Zielstrukturen und phänotypische Screening-Ansätze in Programmen zur reproduktiven Immunologie.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen zur Zusammensetzung und räumlichen Organisation von Immunzellen im Endometrium während des Implantationsfensters.
- Screening: Erzeugt quantitative immunfluoreszenzbasierte Ergebnisse, die den Vergleich der Dichten und Clustermuster von Immunzellen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Liefert multiplexe Fluoreszenzintensitäts- und Ko-Lokalisationsdaten, die zur Phänotypisierung von Immunzellen und zur Ableitung ihres funktionellen Zustands beitragen.
- Translationale Forschung: Gewährleistet einen nahtlosen Übergang von der Analyse humaner Proben zu mechanistischen Folgestudien, indem validierte Marker für Immunzellen für nachgeschaltete funktionelle Assays bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Immunfärbungsplattform, die auf verschiedene Immunprofiling-Studien im Endometrium sowie in anderen Geweben anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem direkte, multiplexe Vergleiche von Immunzellpopulationen in erkranktem Gewebe im Vergleich zu Kontrollgewebe ermöglicht werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reagentien-Effizienz und verringert die Variabilität durch optimierte sequenzielle Färbungs- und Entfernungssprotokolle an einzelnen Objektträgern.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in der reproduktiven Therapieentwicklung, indem der Einfluss des immunologischen Mikroumfelds auf den Erfolg oder Misserfolg der Implantation geklärt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Dichte von Immunzellen, deren Aggregation sowie räumlicher Korrelation mit epithelialen oder stromalen Kompartimenten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunhistochemie, Fluoreszenzmikroskopie und multiskaliger Bildanalyse für die genaue Detektion und Quantifizierung von Signalen.
- Setzt den Zugang zu mikrowellenbasierten Antigen-Retrieval-Systemen, fluoreszenzfähigen Objektträgerscannern und validierten Opal-Fluorophor-Kits für die multiplexe Zyklierung voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Blockier-, Antikörperinkubations- und Abbaubedingungen über verschiedene Labore hinweg, um die Reproduzierbarkeit der Multiplex-Ergebnisse sicherzustellen.
- Erfordert die Anpassung von Antikörperriegeln und Validierungsschritten, wenn die Methode auf andere Gewebetypen oder Immunzellenmarker außer CD3, CD56, CD68 und CD20 angewendet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche Fluorophor-Überlagerungen und die Notwendigkeit einer sorgfältigen spektralen Trennung während der Bildaufnahme, was durch sequenziellen Abtrag und validierte Filtereinstellungen berücksichtigt wird.
