Name: Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie optogenetische Phasenübergänge von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven induziert werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Konsequenzen und ALS-Pathologie in vivo.

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Diese Arbeit wurde von SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Nummern JP19K06933 (KA) und JP20H05345 (KA) unterstützt.

Alle Fischarbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungskennnummer 24-2) des National Institute of Genetics (Japan) durchgeführt, das eine Tierschutzgarantie (Assurance-Nummer A5561-01) beim Office of Laboratory Animal Welfare der National Institutes of Health (NIH, USA).
1. Aufbau von BACs zur Expression des optogenetischen TDP-43-Gens aus dem mnr2b-Promotor
<ol><li>BAC Vorbereitung<ol>
<li>Kaufen Sie einen Zebrafisch-BAC-Klon, der den Zebrafisch-mnr2b-Locus enthält (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Reinigen Sie die BAC-DNA aus einer 5-ml-LB-Kultur von DH10B Escherichia coli (E. coli) mit CH211-172N16 über Nacht, wie in Warming et al.18 beschrieben.</li>
		<li>Umwandlung von CH211-172N16 in SW102 E. coli-Zellen durch Elektroporation, wie in Warming et al.18 beschrieben. HINWEIS: Die Aufreinigung der BAC-DNA aus den E. coli am selben Tag der Elektroporation führt in der Regel zu einer höheren Erfolgsrate der BAC-Transformation18. Andernfalls wird die gereinigte BAC-DNA bis zur Verwendung bei -20 °C gehalten.</li>
		<li>Einführung der iTol2-Ampere-Kassette für die Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese19 in das Rückgrat von CH211-172N16 durch Elektroporation, wie in Asakawa et al.20 beschrieben.<ol>
<li>Herstellung eines Glycerinbestands der E. coli-Zellklone , die CH211-172N16 tragen, mit der iTol2-Ampere-Kassettenintegration (CH211-172N16-iTol2A), nachdem die homologe rekombinationsvermittelte Integration durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Ex Taq) unter Verwendung des Primerpaares Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') und pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') und der folgenden Bedingungen bestätigt wurde: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 72 °C für 1 min, wobei ein PCR-Produkt von 354 Basenpaaren (bp) verstärkt wird.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h Konstruktion<ol>
<li>Konstruieren Sie ein Plasmid, das die Expressionskassette für den menschlichen Wildtyp TDP-43/TARDBP (TDP-43h) trägt, der mit mRFP1 und CRY2olig an den N- bzw. C-Termini (im Folgenden opTDP-43h)14 markiert ist. HINWEIS: Das opTDP-43h-Fragment sollte mit der Zebrafisch-HSP70l-Genpromotorsequenz (650 bp) und der Polyadenylierungs-Signalsequenz (PolyA) flankiert werden, gefolgt von einem Kanamycin-Resistenzgen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>Amplifizieren Sie die hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette mit Primern, die hsp70l und Kan glühen und 45 bp-Sequenzen der upstream und downstream der Initiator-Codons des mnr2b-Gens enthalten, durch PCR (GXL DNA Polymerase) unter Verwendung des Primerpaares mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') und Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') mit folgenden Bedingungen: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 68 °C für 30 s, Amplifikation eines PCR-Produkts von ~5,7 bp.</li>
		<li>Trennen Sie die PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese (100 V) und reinigen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-Bande mit einer DNA-Säule. Stellen Sie die Konzentration der gereinigten hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette auf 50 ng/μL im Tris-EDTA-Puffer (TE) ein, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält.</li>
		<li>Führen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette durch Elektroporation wie in Warming et al.18 beschrieben in CH211-172N16-iTol2A ein und wählen Sie Ampicillin- und Kanamycin-resistente Transformationsmittel auf LB-Agarplatten aus. CH211-172N16-iTol2A mit der hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette wird als mnr2b-hs:opTDP-43h bezeichnet.</li>
		<li>Reinigen Sie mnr2b-hs:opTDP-43h mit einem BAC-Reinigungskit und lösen Sie es nach der Phenol/Chloroform-Extraktion bei 250 ng/μL in TE auf.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z Konstruktion<ol>
<li>Konstruieren Sie ein weiteres Plasmid, das den Zebrafisch-Wildtyp-Tardbp trägt, der mit einem verbesserten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) an seinem N-Terminus (EGFP-TDP-43z) anstelle von opTDP-43h markiert ist, aber ansonsten mit dem hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Konstrukt (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14 identisch ist. Verwenden Sie EGFP-TDP-43z als interne Kontrolle für die Lichtstimulation von opTDP-43h.</li>
		<li>Konstruieren Sie CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette im mnr2b-Locus beherbergt, wie in 1.2.1-1.2.5 beschrieben. CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette trägt, wird als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z bezeichnet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese bei Zebrafischen 
<ol><li>Die Injektionslösung enthält 40 mM KCl, Phenolrot (10 % v/v), 25 ng/μL der mnr2b-hs:opTDP-43h DNA und 25 ng/μL Tol2 Transposase mRNA19.</li>
	<li>1 nL der Injektionslösung (ein in Mineralöl kalibriertes Tröpfchen mit einem Durchmesser von ca. 123 μm) wird im Einzellstadium in das Zytosol von Wildtyp-Zebrafischembryonen injiziert. Screenen Sie den injizierten Fisch auf die Bildung von rot fluoreszierenden Protein (RFP) -positiven Aggregaten in verschiedenen embryonalen Geweben, einschließlich spinaler Motoneuronen, unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop 2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf). Heben Sie den RFP-positiven Fisch bis zum Erwachsenenalter an.</li>
	<li>Injizieren Sie die mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. EGFP-positive Fische bis ins Erwachsenenalter aufziehen.</li>
	<li>Nach einigen Monaten geschlechtsgereifte injizierte Fische und Wildtypfische paarweise in Standard-2-L-Paarungskäfige legen, um F1-Nachkommen zu erhalten. Screen F1 Fisch bei 3 dpf für RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Plan-Neofluar 5x/0,15 Objektivlinse. Typischerweise wird ein Gründerfisch aus 10-20 injizierten Fischen identifiziert (die Keimbahnübertragungsrate beträgt 5% -10%).</li>
	<li>Isolieren und vergleichen Sie mehrere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Einsätze von verschiedenen Gründerfischen, da die Intensität, aber nicht das Muster, der opTDP-43h- oder EGFP-TDP-43z-Expression zwischen den Gründerfischen aufgrund von Chromosomenpositionseffekten variieren kann.</li>
	<li>Kreuzen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Fischlinien, um Nachkommen zu erhalten, die Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fisch in einem Mendelschen Verhältnis enthalten.</li>
	<li>Den Fisch in einer Plastikschale mit 30 ml E3-Puffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Methylenblau) aufziehen und 8-10 h nach der Befruchtung (hpf) 0,003% (w/v) N-Phenylthiourea hinzufügen, um die Melanogenese zu hemmen.</li>
	<li>Die Kunststoffschale nach 30 hpf mit Alufolie abdecken.</li>
</ol>3. Vorbereitung der LED für die Blaulichtbeleuchtung
<ol><li>Schalten Sie ein LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet/Smartphone installiert ist. Setzen Sie die Sonde eines Spektrometers in einen leeren Brunnen einer 6-Well-Schüssel und stellen Sie das LED-Licht durch die Anwendung auf die Wellenlänge von ~ 456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers im leeren Brunnen und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts (~0,61 mW/cm2) ein. Die LED-Lichteinstellung kann gespeichert werden und ist in der Anwendung abrufbar.</li>
	<li>Führen Sie die Schalen-/LED-Panel-Einstellung bei 28 °C in den Inkubator ein. Beenden Sie diesen Schritt, bevor die Bildgebung von Fischen bei 48 hpf beginnt.</li>
</ol>4. Bildgebung von Zebrafischlarven, die optogenetische TDP-43 exprimieren
<ol><li>Wählen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgene Fische mindestens vor 47 hpf, basierend auf RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit dem oben beschriebenen Epifluoreszenzmikroskop-Setup.</li>
	<li>Dekreionieren Sie den doppelt transgenen Fisch Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].</li>
	<li>1% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur mit 250 μg/ml Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz bei 42 °C vorheizen.</li>
	<li>Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] doppelt transgenen Fisch bei 48 hpf in E3-Puffer, der die gleiche Konzentration an Trican enthält, kurz betäuben.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der vorgewärmten 1% niedrigen Schmelztemperatur Agarose bei Raumtemperatur auf die Glasbodenschale. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale beträgt 8-10 mm.</li>
	<li>Mit einer Pasteurpipette den betäubten Fisch zu der Agarose mit niedriger Schmelztemperatur auf der Glasbodenschale geben und dann einige Male durch Pipettieren mischen. Minimieren Sie die Menge des E3-Puffers, der der Agarose zusammen mit dem Fisch hinzugefügt wird.</li>
	<li>Halten Sie den Fisch auf der Seite, indem Sie während der Erstarrung von Agarose (typischerweise ~ 1 min) eine Spritzennadel verwenden, um sicherzustellen, dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nach der Erstarrung ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-montierten Fisch geben.</li>
	<li>Erfassen Sie serielle konfokale Z-Schnitte des Rückenmarks durch Scannen mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse mit der numerischen Apertur 1,00 ausgestattet ist, mit einer Scangeschwindigkeit von 4,0 μs pro Pixel (12 Bit pro Pixel), einer Schrittgröße von 1,0 μm pro Schicht für das Objektiv und einer Kombination aus Anregungs-/Emissionswellenlängen: Kanal 1) 473/510 nm für EGFP und Kanal 2) 559/583 nm für mRFP1. HINWEIS: Die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches ist in den Regionen von Interesse (ROI) als Referenz enthalten, was hilft, die Wirbelsäulensegmente (Ebenen 16-17) über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Fisch aus der Agarose, indem Sie die Agarose vorsichtig mit einer Spritzennadel knacken, sobald die Bildgebung abgeschlossen ist. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in die Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Agaroseeinbettung für <30 min die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.</li>
</ol>5. Lichtstimulation von opTDP-43h-exprimierenden Fischen durch Feldbeleuchtung einer blauen Leuchtdiode (LED)
<ol><li>Fügen Sie 7,5 ml E3-Puffer in das Bohrloch hinzu und platzieren Sie den abgebildeten Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgenen Fisch in den Brunnen. Platzieren Sie die Sechs-Well-Schüssel auf dem LED-Panel, indem Sie die Schüssel und das LED-Panel mit einem Abstandshalter 5 mm voneinander entfernt halten (z. B. mit fünf gestapelten Diagläsern).</li>
	<li>Schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einige der doppelt transgenen Fische Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] in einer separaten Sechs-Well-Schüssel auf, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist, wenn unilluminierte Kontrollfische erforderlich sind (d. h. bei dunklen Bedingungen)14.</li>
	<li>Stellen Sie nach der Beleuchtung (z. B. für 24 h bei 72 hpf in Abbildung 3) das Rückenmark des beleuchteten Fisches dar, indem Sie die Schritte 4.3 - 4.9 wiederholen.</li>
</ol>6. Visualisierung der zytoplasmatischen Verlagerung von optogenetischem TDP-43 in den spinalen Motoneuronen
<ol><li>Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), einem von NIH Image entwickelten Open-Source-Java-Bildverarbeitungsprogramm, das von https://imagej.net/Fiji/Downloads heruntergeladen werden kann.</li>
	<li>Verwenden Sie die Z-Bildlaufleiste, um sich durch die Fokusebenen zu bewegen. Erstellen Sie eine Maximale Intensitätsprojektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Max Intensity und Einstellung Start Slice und Stop Slice, die die Hemisegmente der spinalmotorischen Säule abdecken.</li>
	<li>Teilen Sie das Mehrkanalbild in zwei Einkanalbilder auf, indem Sie auf Bild | | Geteilte Kanäle.</li>
	<li>Verbessern Sie das EGFP-TDP-43z-Signal, um sicherzustellen, dass das zytoplasmatische EGFP-TDP-43z deutlich sichtbar ist, indem Sie auf Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast und Anpassung Minimum
</li>
	<li>Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf | analysieren klicken Werkzeuge | ROI-Manager. Finden Sie die Zellen, die in beiden Bildern bei 48 hpf und 72 hpf identifizierbar sind, basierend auf den relativen Positionen der Zellkörper. Legen Sie die ROIs fest, indem Sie die Konturen der Zellkörper einzelner spinaler Motoneuronen skizzieren, die durch das EGFP-TDP-43z-Signal mithilfe der Freihandauswahl visualisiert werden, und dann im ROI-Manager auf Hinzufügen[t] klicken.</li>
	<li>Legen Sie eine Hauptachse des Somas fest, indem Sie mit Gerade eine gerade Linie zeichnen und auf Analysieren (Analyze | Plotprofil für EGFP-TDP-43z (C1) und opTDP-43h (C2) Bilder bei 48 und 72 hpf.</li>
	<li>Normalisieren Sie das Plotprofil, indem Sie die Werte durch den größten Wert für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Signal dividieren. Zeichnen Sie die normalisierten Werte mit x-y-Koordinaten, wobei x und y die Hauptachse des Somas bzw. die relativen Fluoreszenzintensitäten darstellen, mit XY-Diagramm in einer statistischen Software.</li>
</ol>7. Ratiometrischer Vergleich zwischen opTDP-43h- und EGFP-TDP-43z-Signalen mit ImageJ/Fiji
<ol><li>Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/Fiji und legen Sie ROIs für einzelne mnr2b-positive Zellen fest, indem Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z wie in 6.1-6.5 verwenden. Fügen Sie einen ROI außerhalb des ventralen Rückenmarks hinzu (z. B. Notochord), um das Hintergrundsignal (Hintergrund-ROI) darzustellen.</li>
	<li>Erstellen Sie für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43-Bild eine Projektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Addieren Sie Slices und legen Sie Start Slice und Stop Slice fest, die die hemispinale Motorsäule abdecken.</li>
	<li>Öffnen Sie den ROI-Manager, der mit dem Projektionsbild der maximalen Intensität erstellt wurde. Zeigen Sie die ROIs auf dem Image Sum Slices an, indem Sie das Image-Fenster für EGFP-TDP-43z auswählen und dann im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um Mittelwerte für jeden ROI zu erhalten.</li>
	<li>Erfassen Sie die Mittelwerte für opTDP-43h nach dem gleichen Verfahren wie in 7.3.</li>
	<li>Dividieren Sie für jeden ROI nach Abzug des Mittelwerts für den Hintergrund-ROI den subtrahierten Mittelwert für opTDP-43h durch den subtrahierten Mittelwert für EGFP-TDP-43z, um den ratiometrischen Wert zu erhalten. Die ratiometrischen Werte können zwischen verschiedenen Zeitpunkten verglichen und mithilfe des Säulendiagramms in der Prism-Software dargestellt werden.</li>
</ol>

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<li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
</ol>

KA und KK sind die Erfinder des in diesem Manuskript beschriebenen geistigen Eigentums und vorläufige Patente wurden vom Nationalen Institut für Genetik eingereicht.

Die mnr2b-BAC-vermittelte Expression von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z im Zebrafisch bietet eine einzigartige Möglichkeit für die Live-Bildgebung des TDP-43-Phasenübergangs in den spinalen Motoneuronen. Die optische Transparenz des Körpergewebes von Zebrafischlarven ermöglicht die einfache und nichtinvasive optogenetische Stimulation von opTDP-43h. Vergleiche zwischen einzelnen spinalen Motoneuronen im Laufe der Zeit zeigten, dass die lichtabhängige Oligomerisierung von opTDP-43h seine zytoplasmatische Clusterbildu...

Ribonukleoprotein (RNP)-Granula steuern eine Vielzahl von zellulären Aktivitäten im Zellkern und Zytoplasma, indem sie membranlose Trennwände über Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) zusammensetzen, ein Phänomen, bei dem eine homogene Flüssigkeit in zwei verschiedene flüssige Phasen zerlegt1,2. Das dysregulierte LLPS von RNA-bindenden Proteinen, die normalerweise als RNP-Granulatkomponenten fungieren, fördert einen abnormalen Phasenübergang, der zur Proteinaggregation führt. Dieser Prozess wurde mit neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht3,4,5. Die genaue Bewertung eines kausalen Zusammenhangs zwischen aberrantem LLPS von RNA-bindenden Proteinen und der Krankheitspathogenese ist entscheidend dafür, ob und wie LLPS als wirksames therapeutisches Ziel genutzt werden kann. LLPS von RNA-bindenden Proteinen ist relativ einfach in vitro und in einzelligen Modellen zu untersuchen, ist aber in mehrzelligen Organismen, insbesondere bei Wirbeltieren, schwierig. Eine kritische Voraussetzung für die Analyse eines solchen LLPS in einzelnen Zellen innerhalb einer Gewebeumgebung besteht darin, eine Sonde für die Bildgebung und Manipulation von LLPS in einem krankheitsgefährdeten Zelltyp von Interesse stabil auszudrücken.
Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine letztlich tödliche neurologische Erkrankung, bei der Motoneuronen des Gehirns und des Rückenmarks durch Degeneration selektiv und progressiv verloren gehen. Bis heute wurden Mutationen in mehr als 25 Genen mit der vererbbaren (oder familiären) Form von ALS in Verbindung gebracht, die 5% -10% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, und einige dieser ALS-verursachenden Gene kodieren RNA-bindende Proteine, die aus RNPs bestehen, wie hnRNPA1, TDP-43 und FUS6,7. Darüber hinaus ist die sporadische Form von ALS, die 90% -95% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, durch die zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 gekennzeichnet, die in degenerierenden Motoneuronen abgelagert wird. Ein Hauptmerkmal dieser ALS-assoziierten RNA-bindenden Proteine sind ihre intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) oder Domänen mit geringer Komplexität, denen geordnete dreidimensionale Strukturen fehlen und die schwache Protein-Protein-Interaktionen mit vielen verschiedenen Proteinen vermitteln, die LLPS antreiben7,8. Die Tatsache, dass ALS-verursachende Mutationen häufig in den IDRs auftreten, hat zu der Idee geführt, dass aberrantes LLPS und Phasenübergang dieser ALS-verwandten Proteine der ALS-Pathogenese zugrunde liegen könnten9,10.
Vor kurzem wurde die optoDroplet-Methode, eine Cryptochrome 2-basierte optogenetische Technik, die die Modulation von Protein-Protein-Interaktionen durch Licht ermöglicht, entwickelt, um den Phasenübergang von Proteinen mit IDRs11 zu induzieren. Da diese Technik erfolgreich auf TDP-43 ausgeweitet wurde, hat sie begonnen, die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Phasenübergang von TDP-43 und der damit verbundenen Zytotoxizität zugrunde liegen12,13,14,15. In diesem Protokoll skizzieren wir eine genetische Methode zur Abgabe eines optogenetischen TDP-43 an ALS-gefährdete Zelltypen, nämlich spinale Motoneuronen im Zebrafisch unter Verwendung des BAC für das mnr2b/mnx2b-Gen, das für ein homöodomänes Protein für die Motoneuronspezifikation kodiert16,17. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht eine einfache, nichtinvasive Lichtstimulation des optogenetischen TDP-43, die seinen Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen auslöst. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow für die Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und die Bildanalyse mit der frei verfügbaren Fiji/ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtstimulation zu charakterisieren. Diese Methoden ermöglichen eine Untersuchung des TDP-43-Phasenübergangs in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung und sollten dazu beitragen, seine pathologischen Folgen auf zellulärer und Verhaltensebene zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>LED-Panel</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&fach;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Sensor</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrote Lösung 0,5%</td><td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Well-Schale</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometersonde BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch BAC Klon CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetischer phasenübergang von tdp-43 in spinalen motoneuronen von zebrafischlarven

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormale Proteinaggregation und selektive neuronale Vulnerabilität sind zwei Hauptmerkmale neurodegenerativer Erkrankungen. Kausale Zusammenhänge zwischen diesen Merkmalen können durch die Kontrolle des Phasenübergangs eines krankheitsassoziierten Proteins in einem anfälligen Zelltyp abgefragt werden, obwohl dieser experimentelle Ansatz bisher begrenzt war. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des RNA/DNA-bindenden Proteins TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven zur Modellierung der zytoplasmatischen Aggregation von TDP-43, die in degenerierenden Motoneuronen bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) auftritt. Wir beschreiben eine auf einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) basierende genetische Methode, um eine optogenetische TDP-43-Variante selektiv an spinale Motoneuronen von Zebrafischen abzugeben. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht den Phasenübergang des optogenetischen TDP-43 in den spinalen Motoneuronen durch eine einfache äußere Beleuchtung mittels einer Leuchtdiode (LED) gegen hemmungslose Fische. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow der Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und der Bildanalyse mit frei verfügbarer Fiji / ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtbeleuchtung zu charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des TDP-43-Phasenübergangs und der Aggregatbildung in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung, was eine Untersuchung seiner zellulären und Verhaltensfolgen erleichtern sollte.

Live-Bildgebung von optogenetischen und nicht-optogenetischen TDP-43-Proteinen in den mnr2b+ spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven Um den TDP-43-Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen im Zebrafisch zu induzieren, wurde ein menschliches TDP-43h, das mit mRFP1 bzw. CRY2olig22 an den N- bzw. C-Termini markiert ist, konstruiert und als opTDP-43h14 bezeichnet (Abbildung 1A). Da...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 (TDP-43) durch Licht in den spinalen Motoneuronen am Beispiel des Zebrafisches.

Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns also, pathologische Phasenübergänge von TDP-43 zu induzieren und ihre zellulären Folgen in den spinalen Motoneuronen in vivo zu adressieren, was für das Verständnis relevant ist, warum Motoneuronen bei ALS degenerieren. Durch die hohe Transparenz der Zebrafischlarven sind die Motoneuronen im Rückenmark direkt sichtbar. So kann man das dynamische Verhalten von TDP-43 visualisieren, das Phasenübergänge in einzelnen spinalen Motoneuronen durchläuft.Diese Methode bietet ein neuartiges Tiermodell von ALS. Wir glauben, dass jede Methode, die den lichtinduzierten TDP-43-Phasenübergang und die Aggregation in diesem ALS-Modell verhindern kann, ein potenzieller Kandidat für die ALS-Therapie sein könnte. Andere ALS-bezogene Proteine mit intrinsisch gestörten Regionen können exprimiert werden, um die Neurotoxizität zu untersuchen, die mit den abnormalen Phasenübergängen verbunden ist.Der Schlüssel zum Erfolg bei diesem Ansatz liegt darin, das optogenetische TDP-43 in den spinalen Motoneuronen auf ungiftiger Ebene zu exprimieren. Bac-Transgenese ist ein zeitaufwendiger Schritt, aber sobald Sie einen richtigen transgenen Fisch erzeugt haben, sind die folgenden Schritte relativ einfacher und unkomplizierter. Schalten Sie zunächst die Leuchtdiode oder das LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet oder Smartphone installiert ist.Als nächstes legen Sie die Spektrometersonde in einen leeren Brunnen einer 6-Well-Schüssel. Stellen Sie dann mit der Anwendung das LED-Licht auf eine Wellenlänge von 456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers in der leeren Vertiefung und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts ein.Stellen Sie dann die Schüssel mit der LED-Panel-Einstellung bei 28 ° C in einen Inkubator.Für die Bildgebung der Zebrafischlarven, die optogenetische TDP-43 exprimieren, dekreionieren Sie die doppelt transgenen Fische und betäuben Sie sie in einem E3-Puffer, der 250 g / ml Trican enthält. Als nächstes 1% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die 250 g / ml Ethyl-3-Aminobenzoat-Methansulfonat enthält, bei 42 ° C vorheizen.Dann einen Tropfen der Agarose auf die Glasgrundschale geben. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale sollte 8 bis 10 mm betragen.Als nächstes geben Sie mit einer Pasteur-Pipette den betäubten Fisch zur Agarose auf der Glasschale. Minimieren Sie die Menge an E3-Puffer, die der Agarose zusammen mit dem Fisch hinzugefügt wird. Mischen Sie dann einige Male durch Pipettieren.Halten Sie den Fisch während der Erstarrung der Agarose mit einer Spritzennadel auf der Seite, so dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nachdem die Agarose erstarrt ist, fügen Sie ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-montierten Fisch hinzu. Mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse ausgestattet ist, erfassen Sie serielle konfokale Z-Abschnitte des Rückenmarks.Fügen Sie die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches in den interessierenden Regionen als Referenz hinzu, um die Wirbelsäulensegmente über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Spritzennadel, um die Agarose vorsichtig zu knacken und den Fisch aus der Agarose zu entfernen. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in die Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Einbettung von Agarose für weniger als 30 Minuten die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.Fügen Sie 7,5 ml E3-Puffer in einen Brunnen einer 6-Well-Schüssel hinzu und legen Sie den abgebildeten doppelt transgenen Fisch in diesen Brunnen. Platzieren Sie dann die Schüssel auf dem LED-Panel, halten Sie die Schüssel und das LED-Panel mit einem Abstandshalter 5 mm voneinander entfernt und schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einige doppelt transgene Fische in einer separaten 6-Well-Schüssel auf, die mit Aluminiumfolie für unbeleuchtete Kontrollfische bedeckt ist.Nach der gewünschten Beleuchtungszeit wurde das Rückenmark des beleuchteten Fisches wie zuvor gezeigt abgebildet. Die zytoplasmatische Verlagerung des opTDP-43h in einzelnen spinalen Motoneuronen wurde durch Trennung der bei 48 aufgenommenen Bilder der z-Serie visualisiert. und 72 Stunden nach der Befruchtung in jeden EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Kanal.Aus Projektionsbildern mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z, einem einzelnen isolierten Spinalneuron, das bei beiden 48 identifizierbar ist. und 72 Stunden nach der Befruchtung wurde ausgewählt. Regionen von Interesse, die die Somas der Motoneuronen abdecken, wurden festgelegt, indem der Rand des EGFP-Signals bei 48 verfolgt wurde.und 72 Stunden nach der Befruchtung. Die normalisierte Fluoreszenzintensität entlang der Hauptachse des Somas wurde aufgetragen. Und 48 Stunden nach der Befruchtung überlappten sich die Muster beider Signale weitgehend.Im Gegensatz dazu wurde der Peak für das opTDP-43h-Signal nach 72 Stunden in der Region gefunden, in der das EGFP-TDP-43z-Signal niedrig war, was auf die zytoplasmatische Verlagerung von opTDP-43h hinweist. Um die OpTDP-43h- und EGFP-TDP-43z-Signale vor und nach der Blaulichtstimulation zu quantifizieren, wurden bei 48 einige Slices-Projektionsbilder für jeden Kanal der gleichen Z-Serie-Bilder erzeugt. und 72 Stunden nach der Befruchtung.Von den vier untersuchten mnr2b+-Zellen zeigte Zelle 1 insbesondere ein gesättigtes EGFP-TDP-43z-Signal. Die relativen Mengen von opTDP-43h zu EGFP-TDP-43z wurden berechnet, indem der RFP-Wert durch den GFP-Wert dividiert wurde. Die Zellen 2 bis 4 zeigten nach blauer Lichtbeleuchtung abnehmende opTDP-43h-Werte an.Es ist wichtig, die Zeit zu minimieren, in der die Fische in die Agarose eingebettet sind, um sie gesund zu halten. Durch die Anpassung der Intensität und Dauer der LED-Beleuchtung steuern wir den TDP-43-Phasenübergang auf temporär regulierte Weise, was dazu beitragen kann, das Fortschreiten des pathologischen TDP-43-Phasenübergangs im Motoneuron zu sezieren.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt optogenetische Techniken, indem genetisch veränderte somatosensorische Neuronen aktiviert und die hervorgerufene Verhaltensreaktion mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet werden.

Zebrafisch-Optogenetik: Aktivierung genetisch veränderter somatosensorischer Neuronen zur Untersuchung von Verhaltensreaktionen von Larven

In diesem Video beschreiben wir einen Phasentrennungsassay, bei dem intrazelluläre Proteine, die intrinsisch ungeordnete Regionen umfassen, die mit einer lichtempfindlichen Oligomerisierungsdomäne fusioniert sind, durch Blaulicht-Exposition dazu gebracht werden, sich selbst in membranlose flüssigkeitsähnliche Kondensate zu assoziieren.

Protein-Phasentrennungs-Assay: Eine optogenetische Methode zur Mutanten-RNA-bindenden Protein-Phasentrennung in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Dieses Video zeigt einen nicht-invasiven Assay zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen. Bei der Messung des Schwanzcoilings in den Embryonen als Folge der spontanen Depolarisation der Motoneuronen des Rückenmarks wird ein Natriumkanalblocker angewendet, um die Windungsfrequenz zu reduzieren. Anschließend werden die Embryonen in Agarose immobilisiert und unter ein Fluoreszenzmikroskop gelegt. Die gentechnisch veränderten Motoneuronen exprimieren einen...

Ein nicht-invasiver Ansatz zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen

Optogenetische Techniken haben es ermöglicht, den Beitrag der spezifischen Neuronen zu studieren. Wir beschreiben ein Verfahren in larvalen Zebrafisch zur Aktivierung einzelner somatosensorischen Neuronen Ausdruck einer Channelrhodopsin Variante (Chef) mit einem diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS-Laser) und Aufzeichnung der ausgelöste Verhalten mit einem High-Speed-Video-Kamera.

Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen. Dieses Protokoll zeigt, wie eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen mit dem blaulichtempfindlichen TAEL/C120-System erreicht werden kann.

Lichtinduzierte GFP-Expression in Zebrafischembryonen mit dem optogenetischen TAEL/C120-System

Die optogenetische Manipulation von Signalwegen kann eine leistungsfähige Strategie sein, um zu untersuchen, wie Signale in der Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit entschlüsselt werden. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung von Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensordomänen-basierten Knoten- und knochenmorphogenen Protein-Signalaktivatoren (BMP) im frühen Zebrafischembryo.

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll etabliert ein verhaltensbezogenes Phänotypisierungsparadigma bei mit MPTP behandelten Zebrafischlarven, um Parkinson-ähnliche motorische und nicht-motorische Defizite zu bewerten.

Phänotypisches Profilieren von MPTP-induzierten, Parkinson-ähnlichen Verhaltensphänotypen bei Zebrafischlarven basierend auf Verhaltensexperimenten

Erfahren Sie, wie optogenetische Phasenübergänge von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven induziert werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Konsequenzen und ALS-Pathologie in vivo.

Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

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