Name: Rein optische Mechanobiologie Befragung von Yes-assoziiertem Protein in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Erfahren Sie die rein optische Mechanobiologie-Analyse von YAP in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen automatischen Bildgebungssystem. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Langzeitbeobachtungen.

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Dieses Projekt wird durch den Cancer Pilot Award des UF Health Cancer Center (X. T. und D. S.) und das Gatorade Award Start-up Package (X. T.) finanziell unterstützt. Die Autoren schätzen die intellektuellen Diskussionen mit und die technische Unterstützung von Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistik, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (University of Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) und das Support-Team von Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon und Jon Ekman). Die Autoren sind zutiefst dankbar für die großzügige und effektive Unterstützung aller Mitglieder der Forschungslabors von Tang, Siemann und Guan sowie aller Mitarbeiter der ABTEILUNGEN MAE & ECE & Physik & Radioonkologie, UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
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<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
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<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
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<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
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<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
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<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
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<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
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<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
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<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
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<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
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<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
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<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
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</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der Bildgebungsprozess (Schritt 6.3) ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzbilder von ausreichend guter Qualität sind, um gültige Quantifizierungsergebnisse zu liefern. Die Z-Stack-Bilder von fluoreszierenden Proteinen oder Perlen sollten einen z-Bereich haben, der groß genug ist, um die scharfen Bilder für alle Z-Positionen aufzunehmen, die die Probe umfasst. Ein weiterer kritischer Schritt ist das Sammeln der Referenzbilder von fluoreszierenden Kügelchen nach dem Auflösen der Zellen (Schritt 6.5). Da die Referenzbilder in Schritt 6.3 an den gleichen Positionen aufgenommen werden müssen, sollte keine relative Verschiebung zwischen Petrischale, Umgebungskammer und Mikroskop induziert werden. Die Forscher, die den Auflösschritt durchführen, müssen darauf achten, den Deckel der Petrischale zu entfernen und sicherzustellen, dass die angewendete mechanische Störung nicht groß genug ist, um die Position der Schale in der Umgebungskammer zu verändern.
Im Folgenden finden Sie Lösungen zum Beheben einiger Fehler, die während der Tests auftreten können. Wenn nach dem Klicken auf die Eingabetaste in Schritt 6.4 kein Makro aktiviert wird, liegt dies höchstwahrscheinlich daran, dass der linke untere Bereich des Bildschirms von einem Nicht-Element-Fenster besetzt ist. In einem solchen Fall muss der linke untere Bereich des Fensters gelöscht werden, damit Makros in Elements aktiviert werden können. Ein weiterer häufiger Fehler ist, dass die Hellfeldbilder schwarz erscheinen. Dieses Problem wird durch ein unzureichendes Zeitintervall zwischen den Aufnahmen von Fluoreszenz- und Hellfeldbildern verursacht. Leichte Verzögerungen bei der Fluoreszenzbildgebungszeitzählung können sich im Laufe der Zeit ansammeln und erhebliche Verzögerungen verursachen und die Hellfeldbildgebung stören. Eine Lösung besteht darin, die Dauer eines Bildgebungszyklus aller Positionen so einzustellen, dass sie kleiner (nicht gleich) dem Zeitintervall zwischen dem Beginn aufeinanderfolgender Bewegungen ist. Dieser Vorgang aktualisiert die Zeitzählung und eliminiert den kumulativen Fehler zu Beginn jedes Bildgebungszyklus.
Diese rein optische Abfragetechnologie unterstützt (1) eine breite Palette von Hardware / Software, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Nikon, (2) verschiedene Arten von validierten Hydrogelsystemen, einschließlich Gelatine-, PEG-, Matrigel- und Kollagen-I-Gele, und (3) die programmierbare Anpassung basierend auf unterschiedlichen Bedürfnissen der Forscher. Wenn jedoch keine der Unteren-Level-Steuerungsfunktionen von einem kommerziellen Mikroskop verfügbar ist, wird die Anpassung der Funktionen mit AMFIP zu einer Herausforderung. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die räumliche Drift der Probe sowohl in der XY- als auch in der Fokusebene (Z). Obwohl diese Einschränkung während der Nachbearbeitung der Bilder überwunden werden kann, ist es wichtig, die Autofokusfunktion zu verbessern, um die Echtzeitdrift der Proben zu korrigieren. Diese Verbesserung erhöht den Durchsatz des Bildgebungsprozesses und reduziert den potenziellen Fehler, der durch die Drift während der Experimente verursacht wird.
Mechanotransducer wie YAP können als neue therapeutische Ziele für die Entwicklung vielversprechender Krebstherapien dienen25,26,27. Neue Daten deuten darauf hin, dass YAP die Proliferation und Invasion von Krebszellen fördert. Die mechanisch induzierte YAP-Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern aktiviert die Transkription von Genen im Zusammenhang mit Zellmigration, Proliferation, Invasion und Apoptose, was zu abweichendem Zellverhalten führt28,29,30,31. Diese Arbeit zielte darauf ab, die mögliche Korrelation des YAP-N/C-Verhältnisses und der Zellmechanik in zwei typischen menschlichen Lungenkrebs- und normalen Zelllinien zu untersuchen. Während der 10-stündigen Zellstreuung zeigen PC9-Zellen ähnliche YAP-Konzentrationen im Zellkern und zytoplasma (Abbildung 3D und Abbildung 5A). B2B-Zellen zeigen eine höhere YAP-Konzentration im Zellkern als im Zytoplasma (Abbildung 3C und Abbildung 5A). Diese Beziehung, die während des frühen Ausbreitungsstadiums gefunden wurde, unterscheidet sich von der Mehrheit der veröffentlichten Ergebnisse, die die YAP-Konzentration im Zellkern zwischen normalen und Krebszellen vergleichen. Obwohl nicht unbedingt im frühen Ausbreitungsstadium, zeigen die meisten veröffentlichten Ergebnisse, dass YAP im Kern von Krebszellen konzentrierter ist als im Kern normaler Zellen27,28. Nur eine Studie zu Brustkrebs berichtete über eine Ausnahme32, die zeigt, dass YAP stärker im Zytoplasma konzentriert ist, was mit unseren aktuellen Beobachtungen in Lungenkrebs-PC9-Zellen übereinstimmt. Nach bestem Wissen und Gewissen der Autoren ist diese Arbeit die erste, die ein niedrigeres YAP-N/C-Verhältnis in einer menschlichen Lungenkrebszelllinie zeigt. Die Autoren vermuten, dass der Grund für ein stabiles YAP-N/C-Verhältnis in PC9-Zellen auf die geringe Variation im Zell-/Zellkern-Ausbreitungsbereich und die Traktion in PC9-Zellen im frühen Ausbreitungsstadium zurückzuführen sein könnte. Die Dissektion der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen des niedrigen YAP-N/C-Verhältnisses in PC9- und B2B-Zellen ist im Gange.
Während der ersten 10 h der Ausbreitung zeigen diese beiden Zelllinien eine deutliche Beziehung zwischen dem YAP-N/C-Verhältnis, der Zelltraktion und der Ausbreitungsfläche (Abbildung 5). Für B2B-Zellen korreliert ein höheres YAP-N/C-Verhältnis mit einer höheren Zell- und Zellkernausbreitungsfläche (Abbildung 6A,B), was mit den berichteten Daten anderer normaler Zellen übereinstimmt33. Interessanterweise werden, obwohl der Entwicklungstrend dieser Beziehung im Allgemeinen in allen aufgezeichneten B2B-Zellen zu finden ist, zwei verschiedene Grade (hoch und niedrig) dieser Beziehung gefunden. B2B-Zellen, die sich gleichzeitig ausbreiten und migrieren, zeigen eine geringere Traktion und eine höhere Zell- und Zellkernausbreitungsfläche mit einem höheren YAP-N/C-Verhältnis (2,05 ± 0,32). Für B2B-Zellen, die sich ausbreiten und am selben Ort verbleiben, zeigen sie eine höhere Traktion und eine geringere Zell- und Zellkernausbreitungsfläche mit einem niedrigeren YAP-N/C-Verhältnis (1,74 ± 0,21). Diese beiden Grade von Beziehungen werden in den gegabelten verstreuten Datengruppen demonstriert (Abbildung 6C,D). Wie in der Literatur berichtet, haben stationäre normale Zellen, wie embryonale Fibroblasten NIH 3T3-Zellen, eine höhere Traktion als wandernde Zellen34. Die in diesem Papier berichteten Daten deuten darauf hin, dass die sich ausbreitenden und nicht migrierenden B2B-Zellen eine höhere Traktion aufwiesen als sich ausbreitende und migrierende B2B-Zellen, was wahrscheinlich darauf hindeutet, dass eine hohe Traktion für nicht migrierende Zellen erforderlich ist, um sich auf dem Substrat zu stabilisieren.
Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass stationäre normale B2B-Zellen eine höhere perinukleäre Kraft erzeugen, während frühere Forschungen anderer Forscher nur eine höhere Zelltraktion an der Peripherie stationärer Zellen berichteten34,35,36,37. Die Autoren glauben, dass der Unterschied in der intrinsischen Tendenz der Migration in den Experimenten diese widersprüchlichen Ergebnisse verursachen könnte. In den veröffentlichten Experimenten wurde quadratische Mikrostrukturierung verwendet, um einzelne Zellen von der Ausbreitung abzuhalten und die Migration zu hemmen; Ob die Zellen die Tendenz zur Migration hatten, ist unbekannt. Da wandernde Zellen oft eine hohe Zugkraft an der Peripherie der Zellen aufweisen38, ist es wahrscheinlich, dass Zellen mit der Neigung zur Migration immer noch eine hohe periphere Traktion beibehalten, obwohl ihre Migration begrenzt ist. In dieser vorliegenden Studie sind die stationären Zellen nicht durch ein Mikromuster eingeschränkt, wandern aber nicht, was darauf hindeutet, dass die Zellen dazu neigen, ihren nicht migrierenden Zustand beizubehalten. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die durch das Mikromuster definierte Zellform die Verteilung der fokalen Adhäsionen und Zugkräfte beeinflussen kann39. Die Ergebnisse dieser Studie wurden ohne einschränkende Mikrostrukturierung generiert und stellen die Kraftverteilung stationärer Zellen in ihrer ursprünglichen Form dar.
Nach bestem Wissen der Autoren berichtete bisher nur eine Publikation speziell über den Nachweis perinukleärer Kräfte in normalen Zellen (embryonalen Fibroblasten der Maus), die möglicherweise durch die Aktinkappe verursacht werden, die sich über den Kern erstreckt40. Die YAP-Zytoplasma-zu-Kern-Translokation korreliert mit dem Anstieg der perinukleären Kraft40. Eine gründliche Recherche in der einschlägigen Literatur ergab keine Publikationen, die über eine perinukleäre Kraft oder die Aktinkappe in Krebszellen berichten. Eine indirekte Studie an Melanom-Krebszellen zeigte, dass der Aktinrand (eine weitere perinukleäre Aktinorganisation, die sich um den Kern herum befindet, aber nicht bedeckt) die Zellmigrationsraten41 reduziert, was indirekt auf die Existenz einer perinukleären Kraft hindeutet. Es werden jedoch keine direkten experimentellen Daten gemeldet. In dieser Studie fanden die Autoren heraus, dass sowohl PC9- als auch B2B-Zellen eine perinukleäre Verschiebung und Traktion aufweisen. Die Mechanismen der Erzeugung der perinuklearen Kräfte und ihre Auswirkungen bleiben umstritten. In normalen Zellen wurde berichtet, dass die Aktinkappe eine Rolle bei der Regulierung der Zellkernmorphologie und der Chromatinorganisation42 spielt, mechanische Signale von fokalen Adhäsionen in den Zellkern durch Linker von Nukleoskelett und Zytoskelettkomplex (LINC)43 überträgt und die Zellmigration44 reguliert. Lamin A/C steht im Zusammenhang mit der Bildung und Störung des Aktin cap40,41,42,43,44. Der Bericht, in dem behauptet wurde, dass die Aktinkappe eine perinukleare Kraft erzeugt, berücksichtigte jedoch nicht die mögliche Rolle des Aktinrandes40. In Krebszellen erleichtert die Überexpression von Lamin A die Bildung eines Aktinrandes und schränkt die Migration von Krebszellen ein. Die Überexpression von Lamin B reduziert die Aktinrandbildung und fördert die Migration. Die perinukleare Kraft könnte aufgrund der Existenz einer perinukleären Aktinorganisation und der Wirkung von Lamin A an diesem Prozess beteiligt sein. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten jedoch keine Hinweise auf gemessene perinukleare Kräfte oder das Verhalten der Aktinkappe. Daher ist die Entdeckung von perinukleären Kräften in PC9-Zellen in dieser vorliegenden Studie der erste Bericht, der perinukleäre Kräfte und Verschiebungen in Lungenkrebszellen zeigt. Die Autoren untersuchen derzeit die molekularen Mechanismen und Funktionen perinukleärer Kräfte in CRISPR/Cas9-konstruierten PC9- und B2B-Zellen.
Über die rein optische mechanotische Abfrage hinaus, die in diesem Artikel demonstriert wird, kann das integrierte multifunktionale System angewendet werden, um eine Vielzahl anderer essentieller physiologischer und pathologischer Signale in lebenden Systemen optisch zu untersuchen. Zum Beispiel hat das Labor der Autoren kürzlich mehrere stabil transduzierte menschliche Krebszelllinien etabliert, die drei lichtempfindliche Membranproteine koexprimieren: Membranspannungsindikator QuasAr2 (Anregung: 640 nm; Emission: 660 nm-740 nm), Membranspannungsentpolarizer CheRiff (Anregung: 488 nm) und Membranspannungshyperpolarizer eNpHR3 (Anregung: 590 nm). Diese drei funktionellen Proteine können durch spektralorthogonale Laserlinien übersprechfrei aktiviert werden, was eine rein optische Zwei-Wege-Signalkommunikation (Auslesen und Steuern) der Membranelektrophysiologie ermöglicht. Mit einem integrierten optoelektronischen System und einer manuellen Patch-Clamp haben die Autoren die rein optische Kontrolle und Auslesung der Membranspannung (Vm) in einzelnen menschlichen Krebszellen und mehrzelligen Tumorsphäroiden validiert. Die rein optische elektrophysiologische Abfrage eröffnet die Möglichkeit für detaillierte Erkundungen der bisher unzugänglichen Bioelektrizität in Krebszellen, die dazu beitragen können, die Tumorbiologie von einer neuen Achse aus voranzutreiben.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine rein optische multifunktionale Bildgebung und Analyse lebender Zellen zu ermöglichen. Ein All-in-One-Bildgebungsprogramm, das die automatische Koordination multifunktionaler optoelektronischer Geräte ermöglicht, reduziert arbeitsintensive und fehleranfällige manuelle Operationen und ist für Forscher unerlässlich, um eine langfristige Lebendzellbildgebung durchzuführen1,2,3,4. Die meisten bestehenden öffentlichen Programme in der biomedizinischen Forschungsgemeinschaft gelten jedoch entweder nur für begrenzte optoelektronische Geräte oder erfordern zusätzliche Hardware für die Koordination verschiedener Geräte5,6,7,8,9. Vor kurzem wurde ein Open-Source- und Software-basiertes Programm mit dem Titel "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)" entwickelt, das Multi-Channel- und Zeitraffer-Imaging ermöglicht. Basierend auf der Java-Sprache und der Anwendungsprogrammierschnittstelle (API) von μManager11,12 wurde AMFIP als Plugin in μManager entwickelt, das benutzerdefinierte Java-Skripte ausführt, um die softwarebasierte Kommunikation mehrerer optoelektronischer Hardware- und Softwareplattformen zu ermöglichen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die von Nikon. Die Etablierung von AMFIP eröffnet die Möglichkeit zur programmierbaren und multifunktionalen Abfrage von Zellverhalten. In dieser Arbeit wird ein integriertes experimentelles und computergestütztes System entwickelt, das AMFIP mit digitaler Bildgebungsanalyse und Zelltraktionskraftmikroskopie kombiniert. Das System ermöglicht die Aufklärung der ausgeprägten YAP-Mechanobiologie in CRISPR/Cas9-manipulierten normalen B2B- (Abbildung 1) und Lungenkrebs-PC9- (Abbildung 2) Zelllinien. Das System bietet der wissenschaftlichen Gemeinschaft eine umfassende Lösung, die die Notwendigkeit vermeidet, zusätzliche Kontrollgeräte zu kaufen, die möglicherweise nicht für jedes Bildgebungssystem verfügbar und / oder kompatibel sind.
Die in diesem Dokument vorgestellten Protokolle stellen vor, wie (1) AMFIP angewendet werden kann, um eine automatische Langzeitbildgebung für beide CRISPR/Cas9-Zelllinien durchzuführen, die mNEonGreen2-markiertes YAP exprimieren; und (2) Fidschi ImageJ, MATLAB und Origin für die quantitative Analyse des YAP-Kern-/Zytoplasma-Verhältnisses (N/C) basierend auf ihrer Fluoreszenzintensität (Abbildung 3 und Abbildung 4), dem zellulären Verschiebungsfeld (Abbildung 1C und Abbildung 2C) und dem zellulären Traktionsfeld (Abbildung 1D und Abbildung 2D) kombinieren ). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) während der ersten 10 h der Zellausbreitung auf den Substraten mit physiologisch relevanter mechanischer Steifigkeit13,14,15,16,17,18 das YAP-N/C-Verhältnis einzelner B2B-Zellen im Vergleich zu einzelnen PC9-Zellen eine deutlichere zeitabhängige Variation und Fluktuation aufweist (Abbildung 5 und Abbildung 6 ); und (2) PC9-Krebszellen erzeugen eine spürbare Traktion in ihren perinukleären Regionen (Abbildung 7). Das integrierte System und die methoden, die in diesem Protokoll beschrieben werden, gehen über die spezifischen Zelltypen und optogenetischen Moleküle hinaus. Forscher können die Protokolle anwenden, um ihre spezifischen Live-Cell-Interrogationsexperimente anzupassen und facettenreiche Signaldynamiken im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie aufzuklären.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Tischzentrifuge</td><td>Thermo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>A1R konfokales System</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-aldrich</td><td>695092</td><td>glazial, ACS-Reagenz &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>BEAS-2B (B2B) Zellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95102433</td><td>menschlichen Epithelzellen aus Lungengewebe</td></tr><tr><td>Carboxylat-modifizierte Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Kulturmedium (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093 Desktop-Computer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>2018</td><td>mit Windows 10 Betriebssystem</td></tr><tr><td>Klimakammer TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Menschliches Protein, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi ImageJ</td><td>National Institutes of Health und das Labor für optische und computergestützte Instrumentierung</td><td>1,53k</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES gepuffert Kochsalzlösung</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazinhydratlösung</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Java-Entwicklungsplattform</td></tr><tr><td>Java Development Kit</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monochrom&nbsp; Kamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenbisacrylamid Lösung</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Softwareplattform</td><td>Nikon</td><td>4.50</td><td>Softwareplattform</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab OriginPro</td><td>2017 (Learning Edition)</td><td>Datenanalyse und Grafiksoftware</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PC9-Zellen</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>menschlichen Adenokarzinomzellen&nbsp; aus Lungengewebe</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Scotch-Klebeband</td><td>Scotch-Klebeband</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat-Lösung</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td> Gorilla-Cyanacrylat-Kleber <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Motorisierter Tisch mit Encoder</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager</td><td></td><td>Version 2.0</td><td>Open-Source-Mikroskopie-Software für Gamma (https://micro-manager.org/)</td></tr></tbody></table>

rein optische mechanobiologie befragung von yes-assoziiertem protein in menschlichen krebs- und normalen zellen mit einem multifunktionalen system

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Die langfristige multifunktionale Bildgebung und Analyse lebender Zellen erfordert eine optimierte, funktionale Koordination verschiedener Hard- und Softwareplattformen. Die manuelle Steuerung verschiedener Geräte verschiedener Hersteller ist jedoch arbeits- und zeitaufwändig, was die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Qualität der erfassten Daten beeinträchtigen kann. Daher kann ein All-in-One- und benutzerprogrammierbares System, das eine automatische, multifunktionale und langfristige Bilderfassung ermöglicht und mit den meisten fluoreszierenden Mikroskopieplattformen kompatibel ist, der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugute kommen. In diesem Dokument werden die vollständigen Betriebsprotokolle für die Verwendung eines neuartigen integrierten Softwaresystems vorgestellt, das aus (1) einem selbst entwickelten Softwareprogramm mit dem Titel "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)" besteht, das eine automatische Mehrkanal-Bildgebungserfassung ermöglicht, und (2) einer Reihe von quantitativen Bildgebungsanalyse- und Zelltraktionsberechnungspaketen. 
Dieses integrierte System wird angewendet, um die bisher unbekannte Beziehung zwischen der räumlich-zeitlichen Verteilung des mechanosensitiven Yes-assoziierten Proteins (YAP) und der Zellmechanik, einschließlich Zellstreuung und Traktion, in CRISPR/Cas9-konstruierten menschlichen Normalzellen (B2B) und Lungenkrebszellen (PC9) aufzudecken. Durch die Nutzung der Fähigkeit dieses Systems zur Mehrkanalsteuerung und -auslesung zeigt das Ergebnis: (1) B2B-Normalzellen und PC9-Krebszellen zeigen eine deutliche Beziehung zwischen YAP-Expression, Traktion und Zelldynamik während der Zellausbreitung und Migrationsprozesse; und (2) PC9-Krebszellen üben spürbare perinukleäre Kräfte auf Substrate aus. Zusammenfassend stellt dieses Dokument ein detailliertes schrittweises Protokoll zur Verwendung eines integrierten benutzerprogrammierbaren Systems vor, das eine automatische multifunktionale Bildgebung und Analyse zur Aufklärung der YAP-Mechano-Empfindlichkeit ermöglicht. Diese Werkzeuge eröffnen die Möglichkeit für detaillierte Erkundungen vielfältiger Signaldynamiken im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie.

Dieser Artikel stellt ein detailliertes schrittweises Protokoll zur Verwendung eines integrierten multifunktionalen und benutzerprogrammierbaren Systems vor, das eine automatische Mehrkanalbildgebung und mechanobiologische Analyse ermöglicht, um die Mechanosensitivität des Yes-assoziierten Proteins (YAP) aufzuklären.

Rein optische Mechanobiologie Befragung von Yes-assoziiertem Protein in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen System

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Diese Methode wird helfen, molekulare Mechanismen eines facettenreichen biologischen Phänomens zu veranschaulichen. Wie die Mechanobiologie, die optische Elektrophysiologie und die hochauflösende DNA/RNA-Protein-Bildgebung mit automatischen Live-Cell-Imaging-Techniken. Dieses Protokoll ermöglicht automatische, multifunktionale, hochdurchsatzreiche, selbstdriftkorrigierende und langfristige Bilderfassung.Es ist kompatibel mit den meisten fluoreszierenden mikroskopischen Plattformen wie NYCOM. Jeder, der diese Technik zum ersten Mal ausprobiert, sollte die Funktion jedes Schritts verstehen, anstatt nur dem Protokoll streng zu folgen, um ein erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Beginnen Sie, indem Sie die Umgebungskammer auf die motorisierte Stufe des inversen Mikroskops stellen.Stellen Sie den CO2-Durchfluss auf 160 Milliliter pro Minute ein und stellen Sie die Temperatur der Kammer ein. Dann fügen Sie 40 Milliliter gereinigtes Wasser in das Bad der Kammer hinzu. Nehmen Sie die Glasboden-Petrischale mit Zellen aus dem Inkubator heraus und stellen Sie sie in die Umgebungskammer.Schalten Sie den konfokalen Controller und das inverse Mikroskop ein. Schalten Sie den Lichtweg nach rechts. Beobachten Sie die Zellen, die sich mit Micro Manager verbinden.Wenn genügend Zellen an das Gel gebunden wurden, übertragen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator. Wenn nicht, setzen Sie die Zellinkubation für weitere 30 Minuten für B2B und 60 Minuten für Lungenkrebs oder PC-9-Zellen fort. Schneiden Sie 2 kleine Stücke Klebeband und kleben Sie sie auf die Kammer um das kreisförmige Loch.Tragen Sie dann etwas Klebstoff auf den Bereich des Klebebandes auf, den die Petrischale abdecken wird. Nehmen Sie die Petrischale aus dem Inkubator heraus. Legen Sie die Petrischale langsam in die Kammer und lassen Sie den Boden der Schale mit dem Kleber in Kontakt kommen.Drücken Sie den Deckel der Petrischale für 1 Minute, damit der Kleber vollen Kontakt mit der Petrischale aufnehmen und erstarren kann. Schieben Sie die Petrischale vorsichtig horizontal, um sicherzustellen, dass der Klebstoff erstarrt ist und sich die Petrischale nicht bewegt. Schließen Sie dann den Deckel der Kammer.Öffnen Sie IntelliJ, und legen Sie einen Parameter T1 in Zeile 93 der Datei elements_script.java fest. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert größer ist als die Laufzeit des Makros und der Elemente, die für die konfokale Darstellung eines Sichtfelds verwendet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um das AMFIP IntelliJ-Projekt zu starten.Klicken Sie auf der Hauptoberfläche von Micro Manager auf die Schaltfläche "Live- und Multi-Dequisition" und schalten Sie dann den Lichtweg des inversen Mikroskops nach rechts, um hellfeldbildende Bilder zu erhalten. Schalten Sie zum 10-fachen Objektiv und öffnen Sie das LED-Licht mit der auf 5% eingestellten Intensität Klicken Sie auf das Lichtweg-Mikroskopobjektiv und die LED-Lampentaste im TI2-Panel der Elemente. Stellen Sie den XY-Joystick und den Knopf der Z-Ebene ein, um die richtige Position und die Fokusebene des Gels auf der Petrischale zu finden.Verwenden Sie das 10-fache Ziel, um die geeigneten Sichtfelder mehrerer einzelner Zellen zu finden, die an das Gel gebunden sind. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen mehrere Positionen XY im mehrdimensionalen Erfassungsfenster. Klicken Sie auf die Schaltfläche Positionsliste bearbeiten und beobachten Sie das angezeigte Fenster der Bühnenpositionsliste.Ändern Sie das Ziel auf das 40-fache, erhöhen Sie die Intensität des LED-Lichts auf 15% Stellen Sie die motorisierte XY-Bühne neu ein, um die Sichtfelder zu lokalisieren und die Koordinaten aufzuzeichnen, indem Sie auf die Markierungsschaltfläche im Fenster der Bühnenpositionsliste klicken. Zeichnen Sie 6 bis 7 gewünschte Sichtfelder auf. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern unter im Fenster der Bühnenpositionsliste, um die Koordinaten aufzuzeichnen und T1 als Zeitintervallabschnitt der Bildgebungserfassung in T1 im Zeitpunktabschnitt im mehrdimensionalen Erfassungsfenster einzugeben.Öffnen Sie Elemente, ändern Sie den Lichtweg nach rechts für konfokale Bildgebung und schalten Sie das LED-Licht aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Interlock entfernen und schalten Sie den FITC-Laserkanal für YAP-Bildgebung ein, indem Sie das FITC-Kontrollkästchen aktivieren. Nachdem Sie die Scangeschwindigkeit auf 1 Bild pro 2 Sekunden eingestellt haben, drehen Sie den Knopf der Z-Ebene, um die Z-Position der angeschlossenen Zellen schnell zu finden.Notieren Sie die unteren und oberen Grenzwerte für den Z-Stack. Klicken Sie im oberen Menüband auf Makro, wählen Sie Makro-Editor unter dem Makro-Dropdown-Menü und geben Sie die untere und obere Grenze für den Z-Stack in eine Makrodatei ein. Schalten Sie den DAPI-Laserkanal für die Perlenbildgebung ein, indem Sie das DAPI-Kontrollkästchen aktivieren, um die fokussierte Z-Position von Perlen zu finden und aufzuzeichnen.Gehen Sie zum Makro-Editor und geben Sie die aufgezeichneten Werte in die Makrodatei ein. Um die Aufgabe festzulegen, die motorisierte Bühne mit AMFIP zu bewegen, gehen Sie zu Micro Manager, klicken Sie auf Plug-Ins Automatisierung, um die grafische Benutzeroberfläche von AMFIP zu öffnen. Klicken Sie dann auf die Schaltflächen Punkt hinzufügen oder Punkt entfernen, um die genaue Anzahl der ausgewählten Ansichtsfelder zu ermitteln.Geben Sie die aufgezeichneten Koordinaten der Sichtfelder in das Koordinatenbedienfeld ein. Definieren Sie die Gesamtversuchszeit im Textfeld Gesamtversuchszeit. Klicken Sie auf die zusätzliche Zeitkonfigurationsschaltfläche und definieren Sie das Zeitintervall T2 für das Verschieben der motorisierten Stufe zu jedem Sichtfeld.Maximieren Sie die Fenstergröße der Elemente und ziehen Sie die GUI von AMFIP auf die rechte Seite des Bildschirms, um zu vermeiden, dass die GUI die automatischen Operationen des Cursors stört, und klicken Sie dann auf die Eingabetaste. Nachdem das erste Makro abgeschlossen ist. Klicken Sie im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche Erfassen.Beenden Sie nach Abschluss der Langzeitbildgebung die AMFIP-Aufgabe, indem Sie im Fenster des Automatisierungs-Plug-Ins auf die Schaltfläche Pause und im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche Stopp klicken. Öffnen Sie Elemente und legen Sie die Z-Stack-Bildgebung fest, indem Sie im ND-Erfassungsfenster auf die oberen und unteren Schaltflächen klicken. Schalten Sie den Lichtweg nach rechts und öffnen Sie das LED-Licht.Entfernen Sie langsam und vorsichtig die Deckel der Kammer und der Petrischale, während Sie die helle Feldansicht auf ein Driften des Sichtfeldes überwachen. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um 0,5 Milliliter SDS-Lösung aufzunehmen. Halten Sie die Kunststoffpipette vorsichtig etwas oberhalb des Kulturmediums in der Petrischale und geben Sie 1 bis 2 Tröpfchen der SDS-Lösung in das Kulturmedium.Sobald die Zellen und die helle Feldansicht aufgelöst sind, schließen Sie das LED-Licht, schalten Sie den Lichtpfad nach links, klicken Sie auf die Schaltfläche Interlock entfernen. Führen Sie das Z-Stack-Imaging aus und speichern Sie den Image-Stack als reference_N, wobei N die Sequenznummer jedes Sichtfelds ist. Klicken Sie im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche XY mit mehreren Positionen.Wählen Sie dann das nächste Sichtfeld aus und klicken Sie auf die Go-to-Schaltfläche, um die motorisierte Stufe zum zweiten Sichtfeld zu bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Sichtfeld. Die Kernlokalisation ist von Ja-assoziiertem Protein oder YAP in B2B-Ellen mit zunehmender Substratsteifigkeit erhöht, während PC-9-Zellen eine ähnliche YAP-Konzentration im Zellkern und Zytoplasma auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit zeigten.Die B2B-Zelle vergrößerte monoton die Ausbreitungsfläche im Laufe der Zeit, zusammen mit einer Abnahme des YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses, während die PC-9-Zelle während des gesamten 10-stündigen Ausbreitungsprozesses eine vergleichsweise unveränderliche Zellausbreitungsfläche, Orientierung und YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis beibehielt. Während der 10-stündigen Dauer der frühen Ausbreitung verformte die repräsentative B2B-Zelle konstitutiv die Substratoberfläche und legte Zeit auf, um die Zelltraktion über den gesamten Zellbereich zu entwickeln. Im Gegensatz dazu entwickelte die repräsentative PC-9-Zelle nur an den 2 Enden des Zellkörpers Verschiebung und Traktion, und ihre Traktion nahm nach 7,5 Stunden ab.Das YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und die Dipoltraktion von B2B-Zellen schienen zwei unterschiedlichen Trends zu folgen, was darauf hindeutet, dass es zwei Gruppen von B2B-Zellen gegeben haben könnte, die im Experiment koexistierten. In der ersten Gruppe nahmen das YAP-Kern-zytoplasmatische Verhältnis und die Dipoltraktion zusammen mit der Vergrößerung der Zellausbreitungsfläche zu und erreichten ihre Maxima bei etwa 1.000 Quadratmikrometern. In der zweiten Gruppe nahmen das YAP-Kern-zytoplasmatische Verhältnis und die Dipoltraktion mit der Vergrößerung des Zellausbreitungsbereichs langsamer zu und hielten nahezu konstante Werte aufrecht, wenn die Zellausbreitungsfläche weiter zunahm.Die Z-Stack-Bereiche für alle Laserkanäle müssen sorgfältig bestimmt werden, um die potenzielle Drift des Sichtfeldes während der Bühnenbewegung in der Langzeitbildgebung zu überwinden. Diese neuartige Technik ermöglicht eine automatische, nicht-invasive Langzeit- und Multipositionsbildgebung und kann dazu beitragen, den molekularbiologischen Mechanismus aufzuklären, der eine zeitliche und räumliche Verfolgung von Zellen und Organellen erfordert.

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Forschung

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Biotechnik

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Rein optische Mechanobiologie Befragung von Yes-assoziiertem Protein in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen System (Video) | JoVE Journal

Rein optische Mechanobiologie Befragung von Yes-assoziiertem Protein in menschlichen Krebs- und normalen Zellen mit einem multifunktionalen System

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