Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Das Gebiet gilt als Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials, das diese Kultur gebildet hat. Wir haben unsere Verkapselungsstrategie beschrieben, die zur reproduzierbaren Bildung von humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden führt. Nach der Verkapselung sind diese Stammzellsphäroide für die Kultivierung geeignet, entweder in Multi-Well-Platten oder in gerührten Bioreaktoren.

Unsere Verkapselungsstrategie besteht darin, die Überlebensfähigkeit der Pest und die hohe Effizienz der Sphäroidbildung zu optimieren. Verkapselte Sphäroide sind gegen Scherung oder mechanische Energie geschützt, die mit Rühren oder Schaukeln verbunden sind. Die Entwicklung von Stammzellen, die aus der Zelltherapie stammen, hängt zum Teil von der Fähigkeit ab, das gewünschte Zellprodukt skalierbar, effizient und kostengünstig zu erzeugen.

Die hier beschriebene Verkapselungstechnologie stellt einen Schritt in diese Richtung dar. Die hier beschriebene Verkapselungstechnologie wird wahrscheinlich auf die 3D-Kultivierung verschiedener Zelltypen von anderen Zellen bis hin zu anderen pluripotenten Stammzellen anwendbar sein. Beginnen Sie mit der Herstellung von 30 Millilitern zweifacher Kernmateriallösung, indem Sie 4,8 Gramm 35 Kilodalton PEG, 10,2 Milliliter Dichtegradientenmedien und 19,8 Milliliter DMEM / F-12-Medien mischen.

Filtern Sie dann diese Kernlösung mit einem 0,22 Mikrometer langen Spritzenfilter. Als nächstes bereiten Sie 50 Milliliter Mineralöl mit 3 Prozent Tensid vor, indem Sie 48,5 Milliliter Mineralöl und 1,5 Milliliter Tensid mischen. Dann sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,22 Mikrometer langen Spritzenfilter führen.

Als nächstes bereiten Sie 1 molare DTT-, 1 molare TEA und 1 Prozent PF127-Lösungen vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie dann eine Vernetzeremulsion vor, indem Sie 4,5 Milliliter Mineralöl mit 3 Prozent Tensid und 300 Mikroliter 1 molaren DTT mischen. Nachdem Sie die Lösung zwei Minuten lang besprüht haben, beschallen Sie 45 bis 60 Minuten in einem Ultraschallbad bei 20 Grad Celsius und laden Sie es mit einer 27-Gauge-Nadel auf eine 5-Milliliter-Spritze.

Als nächstes bereiten Sie Abschirmöllösung vor, indem Sie das Mineralöl mit 0,5 Prozent Tensid in eine 5-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel laden. Um die Schalenlösung vorzubereiten, fügen Sie 32 Milligramm PEG4-Maleimid in 400 Mikroliter DPBS hinzu. Dann fügen Sie 6 Mikroliter 1 molaren TEA hinzu.

Wirbeln Sie die Lösung für 2 Minuten und zentrifugieren Sie sie durch einen Spinfilter. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln 30 Minuten lang auf der Wippe auf, bevor Sie sie mit einer 27-Gauge-Nadel in eine 1-Milliliter-Spritze laden. Bereiten Sie schließlich die endgültige Kernlösung vor, indem Sie 20 Millionen hPSCs in 200-Mikroliter-Medien erneut suspendieren und mit 30 Mikrolitern 1 Prozent PF127 und 200 Mikrolitern 2X-Kernlösung mischen.

Führen Sie eine kleine Rührstange in eine 1-Milliliter-Spritze ein. Dann laden Sie die Zelle, die die Kernlösung enthält, mit einer 27-Gauge-Nadel in die Spritze. Beginnen Sie damit, das geklebte PDMS-Tröpfchengerät, 4 Stück 20 Zentimeter lang und 1 Stück 5 Zentimeter lange Einlassmikroröhrchen, 1 Stück 10 Zentimeter Auslassrohr und 6 Stück 0,5 Zentimeter Montagerohre für 30 Minuten zur Sterilisation unter die keimtötende Lichtquelle zu legen.

Passen Sie nun die 4 Stück 20 Zentimeter langer Einlassmikroröhrchen mit einer Pinzette in die Schale, das Öl, die Vernetzeremulsion und die Einlässe der Dissoziationsvorrichtung. Führen Sie dann das gegenüberliegende Ende der Schläuche mit der entsprechenden Lösung in die Spritzennadel ein. Verbinden Sie in der Zwischenzeit den Kerneingang der mikrofluidischen Geräte und den Auslass der Dissoziationsgeräte mit einem 5 Zentimeter großen Mikroröhrchen.

Stecken Sie 1 Auslassrohr in den Fluidic-Auslassanschluss und legen Sie das gegenüberliegende Ende in einen Auffangbehälter. Als nächstes stellen Sie das Gerät auf eine Mikroskopstufe und befestigen Sie den Schlauch, um jede Bewegung zu vermeiden. Richten und fokussieren Sie das Mikroskop zur Durchflusskontrolle auf die Gerätedüse.

Legen Sie jede Spritze auf verschiedene Spritzenpumpen und befestigen Sie sie ordnungsgemäß. Programmieren Sie jede Pumpe nach den Protokollen des Herstellers auf die im Textmanuskript genannten Durchflussraten und starten Sie den Durchfluss in allen Pumpen. Warten Sie, bis jede Flüssigkeit in das Gerät gelangt ist, und füllen Sie die Kanäle auf, während Sie die verbleibende Luft herausdrücken.

Wenn die Kapselbildung stabilisiert ist, legen Sie das gegenüberliegende Ende des Auffangrohrs in ein neues konisches Röhrchen, das 5 Milliliter mTeSR-Medien enthält. Sobald genügend Kapseln gesammelt sind, inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Die Kapseln, die sich in der Ölphase befinden, befinden sich oben auf der Röhre, die sich beim sanften Klopfen der Röhre nach unten sedimentiert.

Um die Kapseln zu entnehmen, entfernen Sie zunächst Öl aus dem Auffangrohr. Legen Sie die Kapseln dann auf ein porengroßes Zellsieb von 100 Mikrometern und waschen Sie das Sieb mit reichlich Medien. Drehen Sie den Filter auf einer Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte um und sammeln Sie die Mikrokapseln, indem Sie 2 Milliliter Medien durch den Filter leiten.

Inkubieren Sie die Stammzellkapseln in einer 6-Well-Kulturschale bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Kapseln auf einem Zellsiebfilter sammeln, mit überschüssigen Medien waschen und sie in 6-Well-Platten mit 2-Milliliter-Medien wieder an einem neuen Vertiefungsfach aufhängen. Führen Sie einen Rentabilitätstest durch, indem Sie 4 Mikroliter der 2 mikromolaren Ethidium Homodimer-1 und 1 Mikroliter der 4 mikromolaren Calcein-AM-Lösungen zu 2 Milliliter sterilem DPBS hinzufügen.

Vortex, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Sammeln Sie etwa 100 Mikrokapseln auf einem Zellsieb und spülen Sie sie mit sterilem DPBS ab, damit das Medium aus den Kapseln heraus diffundieren kann. Sammeln Sie sie erneut in einer 12-Well-Kulturplatte mit 1 Milliliter der vorbereiteten Lösung, die Ethidium Homodimer-1 und Calcein AM enthält, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.

Visualisieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die optimalen und suboptimalen Mikrokapseln, die unter Verwendung der mikrofluidischen Tröpfchenerzeugung hergestellt wurden, zeigten Unterschiede in der Kapselmorphologie in Abhängigkeit vom PEG4-Maleimidgehalt in der Schale. Glatte Kapseln mit hellen Kanten sind mit der gewünschten mechanischen Integrität verbunden.

Die Aggregation von Perlen in der Mitte der Kapseln zeigt an, dass der Kern wässrig war und die Perlen sich frei bewegen konnten. Der fluoreszierende Ring zeigte das Vorhandensein einer Hydrogelhülle an und wurde verwendet, um die Schalendicke zu bestimmen. Lebende oder tote Färbungen 6 Stunden nach der Verkapselung von H9-Zellen zeigten, dass die Zellen während der Verkapselungsläufe routinemäßig mehr als 95 Prozent Lebensfähigkeit erreichten.

Beim Vergleich der Wachstumsrate und des Differenzierungspotenzials von verkapselten und unverkapselten Sphäroiden Es wurde festgestellt, dass der Prozess der Verkapselung keine nachteiligen Auswirkungen auf hPS hat. Bitte denken Sie daran, dass es wichtig ist, ein optimales Durchflussverhältnis zwischen der Kernschale und den Ölströmen festzulegen.

Wenn Sie dies nicht tun, kann dies zu Kapseln führen, die mechanisch nicht stark sind und während der Handhabung reißen können. Wir möchten darauf hinweisen, dass diese Verkapselungstechnik für andere Zelltypen als humane pluripotente Stammzellen gedacht war. Wir haben Krebszelllinien und mesenchymale Stammzellen mit einer ähnlichen Strategie gekapselt, hauptsächlich hypothetisch.

Derzeit entwickelt unser Team die nächste Generation von Mikrofängen. Diese Mikrofänge sind bioaktiv und können mit Kreuzfaktoren für die verkapselte Differenzierung von Stammzellen belastet sein.