Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

Dieses Verfahren ist hochsensibel und ermöglicht eine Visualisierung mehrerer Transkripte mit minimalem Hintergrund. Diese Methode kann genaue Abbildungen des Transkriptionsprofils von hochheterogenen Zelltypen erzeugen. Das Verfahren werden von mir und Johnson Bob-manuel, einem Forschungstechniker im Labor, demonstriert.

Beginnen Sie damit, die gesamte vagale ganglionäre Masse von der acht Wochen alten Maus von jeder Seite mit Hilfe eines Sezierfernrohrs und chirurgischer Instrumente zu sammeln. Nach der Enthauptung der Maus verwenden Sie eine kleine Pinzette, um das Sternohyoid und die omohyoiden Muskeln seitlich zur Luftröhre zu entfernen, um den Okzipitalknochen freizulegen. Reinigen Sie die gesamte Region von Muskeln und Geweben, bis die Halsschlagader, der Vagus und der Nervus hypoglossus sowie das Foramen magnum sichtbar sind.

Schneiden Sie dann den gesamten Hypoglossusnerv mit einer kleinen Federschere ab. Suchen Sie für das Knotenganglion als durchscheinende Masse in der Nähe des Foramen magnum. Mit einer kleinen Schere den Hinterhauptbein vorsichtig brechen.

Um das Jugularganglion weiter freizulegen, lokalisieren Sie schwarze Melanozyten an der Oberfläche des Jugulars als visuelle Landmarke. Wenn die Ganglien gefunden sind, schneiden Sie die Nervenanhänge zwischen der vagalen ganglionischen Masse ab und ziehen Sie sanft am peripheren Ende des Vagusnervs, während Sie gleichzeitig das Jugularganglion mit einer kleinen Federschere in Richtung Hirnstamm schneiden, um die gesamte Ganglionmasse zu extrahieren. Entfernen Sie das Bindegewebe, die ganglionäre Masse und das Fett, das am Vagusnerv haftet.

Halten Sie etwa einen halben Zentimeter des Vagusnervs, um die Handhabung und Lokalisierung von Proben zu erleichtern. Legen Sie die Entfernung mit Hilfe einer feinen Pinzette in 1,5 Millimeter Mikrozentrifugenröhrchen auf Ganglien. Und bei vier Grad Celsius in Formalin für 24 Stunden inkubieren.

Und dann mit 30% Saccharose für 24 Stunden. Nach der Inkubation positionieren Sie die Ganglien in einem Tropfen von vier Millimeter Durchmesser eines optimalen Schnitttemperaturmediums auf einem Stück Aluminiumfolie. Und formulieren Sie die Probe auf einem Bett aus Trockeneis.

Schneiden Sie die gefrorenen Proben mit einem Kryostaten in Abschnitte von 14 Mikrometer Dicke bei minus 20 Grad Celsius und sammeln Sie die geschnittenen Abschnitte auf den Glasmikroskopobjektträgern im Abstand von drei Serien im Abstand von 42 Mikrometern. Spülen Sie die Objektträger mit Gewebeschnitten in PBS. Und 30 Minuten bei 60 Grad Celsius im Backofen backen.

Dann fixieren Sie die Folien in 4% Formalin für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Die Objektträger in 50%70% und 100% Ethanol für jeweils fünf Minuten seriell dehydrieren. Und tragen Sie Wasserstoffperoxidlösung für 10 Minuten auf die Proben auf, bevor Sie in doppelt destilliertem Wasser spülen.

Für die In-situ-Hybridisierung (ISH) behandeln Sie die Proben fünf Minuten lang mit dem Zielentnahmereagenz. Anschließend werden die Proben nacheinander in doppelt destilliertem Wasser und 100% Ethanol gespült, gefolgt von einer Lufttrocknung. Erzeugen Sie mit einem hydrophoben Pen eine Barriere um die Proben.

Während die Proben 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius und einem Hybridisierungsofen mit Protease behandelt werden, sollten die Sonden bei 40 Grad Celsius vorgewärmt und vor Gebrauch bei Raumtemperatur abgekühlt werden. Nach dem Verlassen des Ofens inkubieren Sie die Objektträger mit der gewünschten Kombination von Zielsonden für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen. Inkubieren Sie Negativkontrollgewebe mit der Dihydrodipicolinatreduktase oder DapB, Ziel-C1-Sonde für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius.

Spülen Sie die Objektträger in Waschpuffer und lagern Sie sie über Nacht in fünfmal salzhaltigem Natriumcitrat bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag spülen Sie die Objektträger vor der Inkubation mit Amplifikationsreagenzien mit Waschpuffer ab. Und behandeln Sie mit kanalspezifischen Reagenzien, wie im Manuskript beschrieben.

Waschen Sie die Objektträger mit anschließender Behandlung mit DapB für 30 Sekunden. Tragen Sie dann sofort das Befestigungsmedium auf jeden Objektträger auf und legen Sie einen Abdeckschlitten über den Gewebeabschnitt. Halten Sie die Gewebe horizontal in einem Objektträgerhalter bei vier Grad Celsius, bis sie sich abbilden.

Bereiten Sie ein konfokales Mikroskop für die Bildgebung vor, indem Sie die erforderlichen Parameter einstellen. Erfassen Sie die Bilder mit einer Liniendurchschnittsgröße von vier und einer Pixelgröße von mindestens 1024 x 1024, um die Qualität der Bilder zu verbessern. Sobald Sie mit den Aufnahmeparametern zufrieden sind, beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder mit den gleichen Einstellungen.

Weisen Sie jedem Kanal falsche Farben zu, um die Visualisierung zu erleichtern. Führen Sie mithilfe der digitalen Bilder eine Zellzählung durch, indem Sie die Umrisse positiver RNA-Scope-Profile mit einem Kern identifizieren, der leicht mit DapB gefärbt ist. Berechnen Sie den Prozentsatz der positiven RNA-Scope-Profile, die jedes Transkript exprimieren.

Die optimalen Erfassungsparameter wurden für jeden Laser basierend auf der unspezifischen Fluoreszenz im Negativkontrollgewebe ausgewählt. Die endogene Fluoreszenz im Knotenganglion einer jungen erwachsenen Maus ist minimal. Und die Inkubation mit einer DapB-Sonde führte nicht zu Signalen.

Bei erhöhter Leistung Laser und Verstärkung mit dem 488-Nanometer-Laser erscheinen unerwünschte Hintergrund- und zufällige fluoreszierende Punkte. Die RNA-Scope-Technik wurde angewendet, um drei Gene in Gewebeabschnitten der vagalen ganglionären Masse nachzuweisen. Das Gewebeprofil war positiv für GHSR und CCK1R.

Das Profil umfasste sowohl Phox2b- als auch CCK1R-Transkripte im rostralen Teil des Nodose Ganglion. Als Folge des Multiplex-ISH in nodose afferenten Neuronen akkumulierten phox2b-Signale spezifisch in afferenten Neuronen, die sich im Nodose-Ganglion befinden. CCK1R-Signale markierten intensiv viele Neuronen im Knotenganglion.

Bei geringer Vergrößerung konnten Zellen, die niedrige CCK1R- oder GSHR-Signale exprimierten, nicht leicht beobachtet werden. DapB half, das Gewebe zu visualisieren und vagale afferente Neuronen mit einem großen und leicht gefärbten Kern zu identifizieren. Bei hoher Vergrößerung sind Phox2b-positive Profile erkennbar.

Die Profile zwei und drei sind Phox2b-Zellen mit hohen und moderaten CCK1R-Signalen. Profil vier drückte sowohl GHSR als auch CCK1R aus. Als Ergebnis des Multiplex-ISH der jugulären afferenten Neuronen konnte das PRDM12-Transkript spezifisch in afferenten Neuronen im Jugularganglion akkumuliert werden.

Bei hoher Vergrößerung wurden moderate Signale für CCK1R in den Profilen eins und zwei nachgewiesen. Profil drei ist ein Vertreter von PRDM12-Zellen, die negativ für CCK1R oder GHSR sind. Die Konsistenz der Dissektion ist ein wichtiger Faktor.

Ebenso wichtig ist es sicherzustellen, dass die Bilderfassungsparameter keine unerwünschten Hintergrundsignale erzeugen. Die Multiplex-In-situ-Hybridisierung hat sich zum Goldstandard in molekularen Bereichen entwickelt, insbesondere auf dem Gebiet der Neuroanatomie. Diese Methode kann leicht mit der Immunhistochemie kombiniert werden.