Tail Vein Transection Bleeding Model bei vollnarkotisierter Hämophilie A Mäuse

Schwanzblutungsmodelle können wichtige Werkzeuge sein, um pharmakologische Wirkungen von hämostatischen Verbindungen in vivo zu bewerten, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten sicherzustellen. Im Vergleich zu anderen empfindlichen Blutungsmodellen verwendet unser Modell Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte anstelle des Überlebens. Außerdem wird das Modell unter Narkose durchgeführt, wodurch Schmerzen und Ängste für die Tiere reduziert werden.

Diese Technik ist besonders nützlich für die präklinische Untersuchung von Hämophilie und anderen Gerinnungsstörungen, da sie die Fähigkeit des Blutes misst, nach einer Verletzung zu gerinnen und eine Blutung zu stoppen. Wir haben dieses Modell ausgiebig verwendet und prokoagulantische Verbindungen in unserer Arbeit getestet, um neuartige Hämophilie-Therapien mit Hämophilie-A-Mäusen zu entwickeln. Es können jedoch auch andere hämophile Mausstämme oder Mäuse verwendet werden, bei denen Hämophilie mit einem Anti-Faktor-VIII-Antikörper induziert wird.

Das Experiment wird Sarah und Dennis demonstrieren, die erfahrene Techniker in meinem Labor sind. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, legen Sie sie auf eine Heizplatte und stellen Sie sicher, dass sich die Nase im Nasenkegel befindet. Tragen Sie eine geeignete Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.

Markieren Sie den Schwanz mit einem Durchmesser von 2,5 Millimetern mit dem Heckmarkierungsblock, achten Sie darauf, den Schwanz nicht in den Schlitz zu drücken und sicherzustellen, dass er eng anliegt. Legen Sie dann den Schwanz für mindestens fünf Minuten in den Kochsalzschlauch, um eine warme Schwanzvene zu gewährleisten, die für die intravenöse Dosierung optimal ist. Bei Bedarf kann die IV-Dosierung nach fünf Minuten durchgeführt werden.

Legen Sie dann eine Kunststoffabdeckung über die Maus, um den Wärmeverlust zu reduzieren. Lassen Sie die Schwänze nach der Dosierung der Testlösung fünf Minuten lang unter Wasser und führen Sie dann die Durchtrennung der Heckvene durch, indem Sie den Schwanz in den Schneidblock legen und um 90 Grad drehen, um die Vene freizulegen. Machen Sie den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite, von wo aus die Testlösung dosiert wurde.

Ziehen Sie die Skalpellklinge Nummer 11 durch den Schlitz des Schneidblocks und halten Sie den Schwanz fest, um Blutungen zu erzeugen. Bringen Sie dann sofort das Heck zur Kochsalzlösung zurück und setzen Sie die Stoppuhr zurück. Blutungen sollten sofort sichtbar sein.

Das Eintauchen des Schwanzes in Kochsalzlösung ist wichtig für eine gleichmäßige Blutung, da er in freier Luft schnell zum Stillstand kommen würde. Beobachten Sie die Blutung und kommentieren Sie den Beginn und das Ende der Blutung während 40 Minuten auf dem Blutfluss-Notationspapier. Disqualifizieren und ersetzen Sie die Maus, wenn die primäre Blutung nicht innerhalb von drei Minuten nach dem Schnitt aufhört, was darauf hindeuten kann, dass der Schnitt zu tief ist oder dass die Maus einen Mangel an primärer Hämostase aufweist.

Fordern Sie den Schwanzschnitt an, wenn es keine Blutungen gibt, 10, 20 und 30 Minuten nach der Verletzung. Heben Sie den Schwanz mit einem mit einem Mulltupfer getränkten und warmen Kochsalzlösung aus der Kochsalzlösung und wischen Sie ihn zweimal sanft, aber fest mit der nassen Gaze in distaler Richtung über den Schwanzschnitt ab. Tauchen Sie den Schwanz nach jeder Herausforderung sofort wieder in das Kochsalzrohr ein.

Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie den Schwanz von der Kochsalzlösung, sammeln Sie auf Wunsch Blutproben und euthanasieren Sie die Mäuse, während Sie noch unter Vollnarkose sind. Die 15-Milliliter-Blutentnahmeröhrchen mit Kochsalzlösung bei 4.000 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand aus den Röhren.

Resuspendiert das Pellet in zwei Milliliter Erythrozyten-Lyselösung. Dann verdünnen Sie es mit bis zu 12 zusätzlichen Millilitern Lysinglösung, bis es eine helle Kaffeefarbe erreicht. Notieren Sie sich das Gesamtvolumen und übertragen Sie zwei Milliliter der Verdünnung auf ein Hämoglobinröhrchen.

Kühlen Sie es bis zur Hämoglobinanalyse. Eine signifikante Verringerung des Blutverlustes für rekombinante Gerinnungsfaktor-VIII-Behandlungsgruppen wurde unter Verwendung des optimierten Protokolls beobachtet. Eine Dosis von 20 internationalen Einheiten pro Kilogramm normalisierte die Blutung vollständig, und 10 IE pro Kilogramm verursachten einen signifikanten Effekt, der den Blutverlust fast bis zur oberen Grenze des Wildtypbereichs reduzierte.

Ähnliche Ergebnisse wurden für die Blutungszeit beobachtet. Eine Reduktion wurde in 5, 10 und 20 IE pro Kilogramm-Gruppe beobachtet, wobei in der 20-IE-pro-Kilogramm-Gruppe vollständig normalisiert wurde. Bei Wildtyp-Mäusen lag der Gesamtblutverlust zwischen 200 und 840 Nanomol Hämoglobin und bei Fahrzeugmäusen zwischen 5.300 und 7.100 Nanomol Hämoglobin.

Die mittlere Blutung betrug 5.200 Nanomol bei fahrzeugbehandelten Mäusen und 720 Nanomol in der Gruppe von 20 IE pro Kilogramm. Die Blutungszeit von Wildtyp-Mäusen reichte von ein bis neun Minuten und Dosisstufen von 10 und 20 IE pro Kilogramm reduzierten die Blutungszeit auf diesen Bereich. In den kombinierten Daten wurde eine starke Korrelation zwischen Blutverlust und Blutungszeit beobachtet.

Alle aufgezeichneten Blutungsepisoden wurden aufgezeichnet, um eine Visualisierung der Länge und Anzahl der Blutungen für jede einzelne Maus zu liefern. Beachten Sie, dass in der Fahrzeuggruppe nach der zweiten Herausforderung die meisten Tiere bis zum Ende des Experiments weiter bluten. Die Messung der Plasmafaktor-VIII-Konzentration bestätigte, dass der beobachtete Effekt bei der Verringerung des Blutverlustes und der Blutungszeit rekombinant faktor-VIII-konzentrationsabhängig war.

Die Thrombozytenzahl wurde nicht merklich beeinflusst und die Hämatokritspiegel lagen im normalen Bereich bei Tieren, die moderate und höhere rekombinante Faktor-VIII-Dosen erhielten, aber signifikant niedriger bei Tieren, die stark bluteten, wie im Vehikel und einer IE pro Kilogramm-Gruppe. Bei Tieren mit starken Blutungen kann ein geringer Einfluss auf das Blutbild, insbesondere auf das Gesamthämoglobin oder Hämatokrit, auftreten. Um die Wirkung des Geschlechts in diesem optimierten Modell zu bewerten, wurden sowohl die Ergebnisse des Blutverlusts als auch der Blutungszeit einer bidirektionalen ANOVA-Analyse unterzogen, wobei Geschlecht und Dosis als Faktoren verwendet wurden.

Diese Ergebnisse zeigten, dass sich das Ansprechen auf die Behandlung nicht zwischen den Geschlechtern unterschied. Die korrekte Markierung des Schwanzes und das Erstellen des Schnitts sind wesentliche Schritte, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Technik zu gewährleisten, ebenso wie die Herausforderung, wenn es keine Blutungen gibt. Darüber hinaus ist eine gute Anästhesieinduktion und Aufrechterhaltung der tierischen Körpertemperatur besonders relevant.

Wir haben dieses Modell auch verwendet, um das Stoppen etablierter Blutungen in einer eher bedarfsgerechten Umgebung zu untersuchen, indem wir 10 Minuten nach der Induktion der Blutung mit Faktor VIIA behandeln.