Name: Tail Vein Transection Bleeding Model bei vollnarkotisierter Hämophilie A Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Erfahren Sie das optimierte Schwanzvenen-Transections-Blutungsmodell zur Bewertung hämostatischer Therapien bei Hämophilie A Mäusen unter Vollnarkose. Diese Methode misst Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte.

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Esther Bloem und Thomas Nygaard sind für ihre Unterstützung bei Messungen von FVIII im Plasma anerkannt. Bo Alsted ist für das Zeichnen und Bearbeiten der Schablonen und Schneidblöcke anerkannt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der Tierschutzbehörde von Novo Nordisk A/S und der dänischen Tierversuchsinspektion und dem dänischen Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei genehmigt. Die optimierte 40-Minuten-Methode beinhaltet Anästhesie und Dosierungszeit im Design (Abbildung 1). Hämophile Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 10 und 16 Wochen sind für dieses Verfahren erforderlich.
1. Vorbereitungen vor der Studie
<ol><li>Bereiten Sie die Dosierlösungen in den richtigen Konzentrationen vor.</li>
	<li>Starten Sie das Wasserbad und erwärmen Sie es auf 37 ° C. Füllen Sie die 15 ml Zentrifugenröhrchen zur Blutentnahme mit Kochsalzlösung (0,9% NaCl).</li>
	<li>Legen Sie die 15 ml Kochsalzröhren mindestens 15 Minuten vor Beginn des Experiments in die Löcher in der erwärmten Grundplatte.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Mäuse und notieren Sie ihr Gewicht. Vermeiden Sie es, Mäuse mehr als nötig zu handhaben, da dies Stress verursachen und die Studie beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Bereiten Sie den Arbeitsplatz im Abzug vor, bevor Sie fortfahren, damit alles in Reichweite ist: Servietten, Schwanzhalter, Gaze, Spritzen, Skalpelle, Stoppuhren und Blutfluss-Notationspapier.</li>
	<li>Legen Sie die Heckmarkierung und die Schneidblöcke auf die Heizplatte - kalte Blöcke führen dazu, dass sich die Venen zusammenziehen und dadurch die Blutung beeinflussen.</li>
</ol>2. Anästhesie
<ol><li>Führen Sie das Isofluran-Anästhesieverfahren in einem Abzug durch.</li>
	<li>Stellen Sie den Gasverdampfer zunächst auf 5% Isofluran in 30% O 2/70% N2O in der Anästhesiekammer mit 1 L/min Durchfluss ein. Planen Sie ausreichend Zeit für die Befüllung der Anästhesiekammer ein (ca. 5 min, abhängig vom Kammervolumen und dem Gasdurchfluss). Sorgen Sie für eine schnelle Induktion (weniger als eine Minute).</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse in die Anästhesiekammer, bis sie das Bewusstsein verlieren. HINWEIS: Dies sollte innerhalb einer Minute oder weniger geschehen, wenn die Kammer ausreichend gefüllt ist.</li>
	<li>Stellen Sie eine ordnungsgemäße Anästhesie sicher, indem Sie keine schmerzhafte Reaktion auf den Pedalreflex (feste Zehenklemme) haben.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse auf die Heizplatte und stellen Sie sicher, dass sich die Nase im Nasenkegel befindet.</li>
	<li>Reduzieren Sie die Anästhesie auf ein Erhaltungsniveau von 2% Isofluran in 30% O 2/70% N2O und legen Sie eine Kunststoffabdeckung über die Mäuse, um den Wärmeverlust zu reduzieren. Tragen Sie eine geeignete Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.</li>
	<li>Markieren Sie das Heck mit einem Durchmesser von 2,5 mm mit dem Heckmarkierungsblock. Zwingen Sie den Schwanz nicht in den Schlitz im Block - er muss eng anliegen (Ergänzende Abbildung 1)</li>
	<li>Legen Sie den Schwanz für mindestens 5 Minuten in den Kochsalzschlauch, um eine warme Schwanzvene zu gewährleisten, die für die intravenöse (intravenöse) Dosierung optimal ist.</li>
</ol>3. Dosierung der Testlösung
<ol><li>Legen Sie eine Maus in den Schwanzhalter mit der Nase in eine Anästhesiemaske.</li>
	<li>Dosieren Sie das Tier mit der interessierenden Verbindung (in diesem Fall rFVIII) und starten Sie sofort die Stoppuhr (t = 0).</li>
	<li>Legen Sie die Maus wieder auf die Heizplatte mit dem Schwanz in das Kochsalzrohr. Wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen Mäusen.</li>
</ol>4. Durchführung der Tailvenentranssektion
<ol><li>Führen Sie die Schwanzvenentranssektion genau 5 Minuten nach der Dosierung durch. Legen Sie den Schwanz in den Schneidblock und drehen Sie ihn um 90°, um die Vene freizulegen (Ergänzende Abbildung 2).</li>
	<li>Führen Sie den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite/Vene durch, von der aus die Testlösung dosiert wurde.</li>
	<li>Ziehen Sie die #11 Skalpellklinge durch den Schlitz des Schneidblocks, der den Schwanz hält, um Blutungen zu erzeugen. Setzen Sie die Stoppuhr zurück und bringen Sie das Heck sofort zur Kochsalzlösung zurück.</li>
</ol>5. Beobachtungszeit und Herausforderungen
<ol><li>Beobachten Sie die Blutung und kommentieren Sie den Beginn und das Ende der Blutung während 40 Minuten; Kommentieren Sie es auf dem Blutfluss-Notationspapier. HINWEIS: Diese visuelle Beurteilung der Blutung kann aufgrund der Subjektivität leicht variieren.</li>
	<li>Die Primärblutung muss innerhalb von 3 Minuten nach dem Schnitt aufhören. Wenn dies nicht der Fall ist, disqualifizieren Sie die Maus, euthanasieren und ersetzen Sie sie (wenn die primäre Blutung nicht gestoppt wird, kann dies auf eine zu schwere Verletzung oder fehlende primäre Hämostase hinweisen, wie bei vWF KO-Mäusen).</li>
	<li>Wenn es nach der Verletzung 10 min, 20 min und 30 min keine Blutung gibt, fordern Sie den Schwanzschnitt wie in den Schritten 4-5 beschrieben an.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Mulltupfer, der in warmer Kochsalzlösung aus einem separaten Schlauch getränkt ist, der im Wasserbad aufbewahrt wird. Heben Sie den Schwanz aus der Kochsalzlösung und wischen Sie ihn zweimal sanft mit der nassen Gaze in distaler Richtung über den Schwanzschnitt ab.</li>
	<li>Tauchen Sie nach jeder Herausforderung sofort wieder in das Kochsalzrohr ein.</li>
	<li>Stoppen Sie bei t = 40 min die Blutentnahme, indem Sie den Schwanz aus der Kochsalzröhre entfernen.</li>
</ol>6. Blutentnahme
<ol><li>Nach t = 40 min erhalten Sie Blutproben aus der supraorbitalen Vene.</li>
</ol>7. Euthanasie
<ol><li>Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixdislokation, während sie noch unter Vollnarkose stehen.</li>
</ol>8. Behandlung von Proben
<ol><li>Die 15 ml Blutentnahmeröhrchen mit Kochsalzlösung bei 4000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand aus den 15-ml-Röhrchen, suspendieren Sie das Pellet in 2-14 ml Erythrozyten-Lysinglösung (RBC) und verdünnen Sie es dann, bis es eine helle Kaffeefarbe erreicht.</li>
	<li>Beachten Sie das Gesamtvolumen (Blutvolumen + Volumen der Erythrozyten (RBC) Lysinglösung, die unter Verwendung der Graduierungsmarkierungen auf der Tube hinzugefügt wird).</li>
	<li>Geben Sie 2 ml der Verdünnung in ein Hämoglobinröhrchen und kühlen Sie es bis zur Hämoglobinanalyse.</li>
	<li>Bestimmen Sie den Blutverlust, indem Sie die Hämoglobinkonzentration in der Kochsalzlösung messen. Messen Sie die Absorption bei 550 nm an einem Mikroplattenleser (Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Wandeln Sie die Absorption in nmol-Hämoglobin um, indem Sie eine Standardkurve verwenden, die aus menschlichem Hämoglobin (Materialverzeichnis) hergestellt wird, und korrigieren Sie die Verdünnung mit RBC-Lysinglösung.</li>
</ol>9. Statistische Auswertungen
<ol><li>Analysieren Sie die Daten mit entsprechender Software. Hier wurde die GraphPad Prism Software verwendet. In einer Reihe von Studien wurde festgestellt, dass die folgenden statistischen Methoden gut funktionieren. HINWEIS: Zur Analyse von Blutverlust, Blutungszeit, Exposition, Thrombozytenzahl und Hämatokrit; Der Brown-Forsythe- und Welch ANOVA-Test wurde verwendet (da die Daten kontinuierlich, aber ohne Varianzhomogenität der Residuen waren), wobei Dunnetts Test angewendet wurde, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. Ein Pearson-Test wurde verwendet, um auf Korrelationen zwischen Blutungszeit, Blutverlust und Dosen zu testen. Um die ED50-Werte zu bestimmen, wurde eine Vier-Parameter-Inverse Log-Wirkungsgleichung (Dosis) an Blutungs- und Blutverlustdaten angepasst. Um den Gender-Effekt zu analysieren, wurde ein Zwei-Wege-ANOVA-Test verwendet, bei dem die Bonferroni-Korrektur angewendet wurde, um mehrere Vergleiche zu ermöglichen. Das Signifikanzniveau wurde als P < 0,05 definiert. Daten werden als Mittel ± REM angezeigt.</li>
</ol>

Die Autoren sind oder waren Mitarbeiter und/oder Aktionäre von Novo Nordisk A/S zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Studie.

Diese optimierte Methode der Schwanzvenentransektion (TVT) hat mehrere Vorteile gegenüber der TVT-Überlebensmethode. Die Tiere werden während der gesamten Studiendauer vollständig betäubt, was die Handhabung der Maus erleichtert und das Wohlbefinden der Tiere erhöht. Darüber hinaus ist im Gegensatz zum TVT-Überlebensmodell keine Beobachtung über Nacht erforderlich, und dieses optimierte Modell bietet die Möglichkeit, den Blutverlust zu messen und die genaue Blutungszeit über 40 Minuten zu beobachten. Auch längere Blutung...

Tiermodelle sind unerlässlich, um die Pathogenese der Hämophilie zu verstehen und Behandlungsschemata und Therapien zu entwickeln und zu testen. Die Faktor-VIII-Knock-out-Maus (F8-KO) ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung von Hämophilie A 1,2. Diese Mäuse rekapitulieren Schlüsselmerkmale der Krankheit und wurden häufig für die Entwicklung von Behandlungen wie rekombinanten FVIII-Produkten 3,4,5 und Gentherapiestrategien 6,7 verwendet.
Es gibt verschiedene Blutungsverletzungsmodelle zur Bewertung der pharmakologischen Wirkungen verschiedener hämostatischer Verbindungen in vivo. Eines dieser Gerinnungsmodelle ist das Überlebensmodell der Schwanzvenentransektion bei Mäusen 8,9,10,11,12,13,14, das die Fähigkeit hämophiler Mäuse misst, Exsanguination nach Schwanztransektion zu überleben. Diese Methode wurde vor mehr als vier Jahrzehnten 15 eingeführt und wird immernoch 9,16,17 verwendet. Das Modell nutzt jedoch das Überleben als Endpunkt und erfordert die Beobachtung der Tiere über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden, in dem die Tiere bei Bewusstsein sind und daher Schmerzen und Leiden erfahren können.
Blutungsmodelle mit kürzerer Dauer und unter Vollnarkose wurden bereits beschrieben, wie das Heckclip-Modell (auch bekannt als Schwanzspitze)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Für eine vollständige Normalisierung des Blutverlustes nach der Blutungsherausforderung erfordern diese Modelle jedoch Dosen von Prokoagulanzien (z. B. FVIII), die weit höher sind als die klinischverabreichten 29. Ein anderes Verletzungsmodell unter Narkose, die Vena-Saphena-Blutungsmethode, ist empfindlich gegenüber niedrigeren Dosen von Prokoagulanzienverbindungen30, erfordert jedoch ein hohes Maß an Experimentatorintervention, da die Gerinnsel häufig gestört werden müssen (im Gegensatz zu 3 Mal im vorgestellten Modell).
Die Standardisierung hin zu einem gemeinsamen Protokoll zur Prüfung neuer Prokoagulanzienverbindungen würde den Datenvergleich zwischen Laboratorienerheblich erleichtern 31,32,33. In TVT-Modellen gibt es noch keine gemeinsame Übereinstimmung über die untersuchten Endpunkte (Blutverlust 7,26, Blutungszeit9,34 und Überlebensrate35,36), und die experimentelle Länge variiert zwischen den Studien13.
Unser primäres Ziel ist es, ein optimiertes Modell mit hoher Reproduzierbarkeit, der Möglichkeit, On-Demand sowie eine prophylaktische Behandlung zu untersuchen, der Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Interventionen, die dem Überlebensmodell entsprechen, zu beschreiben und zu charakterisieren, jedoch nicht den Tod oder den Nahtod als Endpunkte zu verwenden. Um Schmerzen und Leiden zu lindern, sollten die Tiere während der Blutung nicht bei Bewusstsein sein und ein ethischerer Endpunkt muss implementiertwerden 37.
Heckclip-Modelle werden im Allgemeinen in einer von zwei Varianten durchgeführt, entweder mit Amputation der Schwanzspitze, z. B. Amputation von 1-5 mm18,19,20,21,23,24 oder, in einer schwereren Variante, bei einem Heckdurchmesser um 1-3 mm 8,22,25 . Dies verursacht eine kombinierte arteriovenöse Blutung, da die lateralen und dorsalen Venen und die ventrale Arterie normalerweise durchtrennt sind, und im Allgemeinen gilt: Je größer die Amputation, desto geringer ist die Empfindlichkeit gegenüber einer Prokoagulansverbindung. Da die Schwanzspitze amputiert ist, ist die arteriovenöse Verletzung ohne Gegengewebe freigelegt; Daher ist es, zumindest in der Theorie, den häufigsten hämophilen Blutungen unähnlich.
Wie der Name schon sagt, wird nur die Vene bei Schwanzvenentranssektionsmodellen, wie sie in dieser Arbeit beschrieben sind, verletzt, was zu einer ausschließlich venösen Blutung führt. Da das Gefäß nicht vollständig durchtrennt ist, wird erwartet, dass die Verletzung kleiner ist als bei den Amputationsmodellen, und das Gewebe um den Schnitt, an dem ein Gerinnsel haften kann, bleibt erhalten. Darüber hinaus gibt es einen niedrigeren Blutdruck in der Vene im Gegensatz zur Arterie. Diese Faktoren tragen zu einer erhöhten Sensitivität im Vergleich zu Amputationsmodellen bei, so dass eine Normalisierung der Blutung mit klinisch relevanten Dosen der Ersatztherapie erreicht werden kann, z. B. mit rFVIII bei Hämophilie A, was für die Beurteilung des Ausmaßes und der Haltbarkeit der Wirkungen der Prokoagulanzienbehandlungnützlich ist 26,38,39.

<table><tbody><tr><td>#11 Skalpellklinge</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One, Österreich</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>30 G Nadeln verbunden mit 300 & micro; L Präzisionsspritzen (Insulin) zur Dosierung</td><td>BD Micro-Fine + U-100 Insulinspritze</td><td>320830</td><td></td></tr><tr><td>Advate</td><td>Takeda, Japan</td><td></td><td>Rekombinante Faktor-VIII-Ersatztherapie (rFVIII)</td></tr><tr><td>Alkohol-Pads 70% Ethanol</td><td>Hartmann, Soft-Zellin</td><td>999 979</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneidschablone (Edelstahl)</td><td>Selbst hergestellt, können Sie sich gerne an die Autoren wenden, um die genauen Zeichnungen</td><td></td> zu erhalten<td>. Ergänzende Abbildung 2: Größenangaben: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Nut: 3 mm Tiefe und 3 mm Breite; Radius 1,5 mm</td></tr><tr><td>Erythrozyten (RBC) Lyselösung</td><td>Lysebio, ABX Diagnostics</td><td>906012</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämatologisches Analysegerät</td><td>Sysmex</td><td>CT-2000iv</td><td></td></tr><tr><td>Heizlampe auf Stativ</td><td>Phillips</td><td>IR250</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen mit Thermostat</td><td>CMA</td><td>Modell 150</td><td></td></tr><tr><td>Hämoglobinstandards und -kontrollen - 8,81 mmol / l chargenabhängiger</td><td>HemoCue-Kalibrator</td><td>, dänischer HemoCue-Kalibrator, 707037</td><td>Standards und Kontrollen werden aus 2 verschiedenen Gläsern des HemoCue-Kalibrators hergestellt. Der Wert wird anhand der Internationalen Referenzmethode für Hämoglobin (ICSH) bestimmt.</td></tr><tr><td>Isofluoran-Anästhesiesystem komplett mit Schläuchen, Masken und Induktionsbox</td><td>Sigma Delta Dameca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Lupe mit Leuchten</td><td>Eschenbach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Messschablone (Aluminium)</td><td>Selbst hergestellt, für die genauen Zeichnungen</td><td></td> <td>können Sie sich gerne an die Autoren wendenErgänzende Abbildung 1: Größenangaben: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Nut: 2,5 mm Tiefe und 2,5 mm Breite; Radius 1,25 mm</td></tr><tr><td>Mikropipetten + Spitzen</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>Molecular Devices Corporation, CA, USA</td><td>SpectraMax 340 Photometer</td><td></td></tr><tr><td>Prism Software</td><td>GraphPad, San Diego, CA, USA</td><td>Version 9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung 0,9% NaCl</td><td>Fresenius Kabi, Schweden</td><td>883264</td><td></td></tr><tr><td>Spezieller Schwanzmarkierungsblock für TVT Schwanzschnitt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heckhalter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Flüssigkeitsabsaugung</td><td>Vacusafe comfort, IBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad und Thermostat</td><td>TYP 3/8 Julabo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tail vein transection bleeding model bei vollnarkotisierter hämophilie a mäuse

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

Schwanzblutungsmodelle sind wichtige Werkzeuge in der Hämophilieforschung, insbesondere für die Beurteilung von Prokoagulanzienwirkungen. Das Überlebensmodell der Tail Vein Transection (TVT) wurde in vielen Umgebungen aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber klinisch relevanten Dosen von FVIII bevorzugt, während andere etablierte Modelle, wie das Tail-Clip-Modell, höhere Konzentrationen von Prokoagulanzienverbindungen erfordern. Um zu vermeiden, dass das Überleben als Endpunkt verwendet wird, haben wir ein TVT-Modell entwickelt, das Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte und Vollnarkose während des gesamten Experiments festlegt. Kurz gesagt, anästhesierte Mäuse werden mit dem Schwanz in gemäßigte Kochsalzlösung (37 ° C) eingetaucht positioniert und mit der Testverbindung in der rechten lateralen Schwanzvene dosiert. Nach 5 Minuten wird die linke seitliche Schwanzvene mit einer Schablonenführung durchblutet, der Schwanz wird zur Kochsalzlösung zurückgeführt und alle Blutungsepisoden werden überwacht und für 40 Minuten aufgezeichnet, während das Blut gesammelt wird. Wenn nach der Verletzung 10 min, 20 min oder 30 min keine Blutung auftritt, wird das Gerinnsel sanft herausgefordert, indem der Schnitt zweimal mit einem nassen Mulltupfer abgewischt wird. Nach 40 min wird der Blutverlust durch die Menge an Hämoglobin quantifiziert, die in die Kochsalzlösung blutet. Dieses schnelle und relativ einfache Verfahren führt zu konsistenten und reproduzierbaren Blutungen. Im Vergleich zum TVT-Überlebensmodell verwendet es ein humaneres Verfahren, ohne die Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Eingriffen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist es möglich, beide Geschlechter zu verwenden, wodurch die Gesamtzahl der Tiere, die gezüchtet werden müssen, unter Einhaltung der Prinzipien von 3R reduziert wird. Eine mögliche Einschränkung bei Blutungsmodellen ist die stochastische Natur der Hämostase, die die Reproduzierbarkeit des Modells verringern kann. Um dem entgegenzuwirken, stellt die manuelle Gerinnselstörung sicher, dass das Gerinnsel während der Überwachung herausgefordert wird, wodurch verhindert wird, dass die primäre (Thrombozyten-) Hämostase die Blutung stoppt. Diese Ergänzung des Katalogs der Blutungsverletzungsmodelle bietet die Möglichkeit, prokoagulantische Effekte auf standardisierte und humane Weise zu charakterisieren.

Um die Anwendbarkeit des optimierten Modells zu beurteilen, wurde eine Studie an F8-KO-Mäusen (C57BL genetischer Hintergrund) durchgeführt, denen eine kommerziell erhältliche rekombinante Faktor-VIII-Ersatztherapie (rFVIII) verabreicht wurde. Vier verschiedene Dosen wurden getestet: 1 IE/kg, 5 I.E./kg, 10 I.E./kg und 20 I.E./kg. Darüber hinaus testeten wir die entsprechende Fahrzeugsteuerung (Negativ) in F8-KO-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (WT) mit C57BL-Mäusen als Positivkontrollgruppe, um den Ansprechbereich im Modell zu b...

Das verfeinerte Tail Vein Transection (TVT) Blutungsmodell bei anästhesierten Mäusen ist eine sensitive in vivo Methode zur Beurteilung hämophiler Blutungen. Dieses optimierte TVT-Blutungsmodell verwendet Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte, verfeinert andere Modelle und vermeidet den Tod als Endpunkt.

Tail Vein Transection Bleeding Model bei vollnarkotisierter Hämophilie A Mäuse

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

Schwanzblutungsmodelle können wichtige Werkzeuge sein, um pharmakologische Wirkungen von hämostatischen Verbindungen in vivo zu bewerten, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten sicherzustellen. Im Vergleich zu anderen empfindlichen Blutungsmodellen verwendet unser Modell Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte anstelle des Überlebens. Außerdem wird das Modell unter Narkose durchgeführt, wodurch Schmerzen und Ängste für die Tiere reduziert werden.Diese Technik ist besonders nützlich für die präklinische Untersuchung von Hämophilie und anderen Gerinnungsstörungen, da sie die Fähigkeit des Blutes misst, nach einer Verletzung zu gerinnen und eine Blutung zu stoppen. Wir haben dieses Modell ausgiebig verwendet und prokoagulantische Verbindungen in unserer Arbeit getestet, um neuartige Hämophilie-Therapien mit Hämophilie-A-Mäusen zu entwickeln. Es können jedoch auch andere hämophile Mausstämme oder Mäuse verwendet werden, bei denen Hämophilie mit einem Anti-Faktor-VIII-Antikörper induziert wird.Das Experiment wird Sarah und Dennis demonstrieren, die erfahrene Techniker in meinem Labor sind. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, legen Sie sie auf eine Heizplatte und stellen Sie sicher, dass sich die Nase im Nasenkegel befindet. Tragen Sie eine geeignete Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.Markieren Sie den Schwanz mit einem Durchmesser von 2,5 Millimetern mit dem Heckmarkierungsblock, achten Sie darauf, den Schwanz nicht in den Schlitz zu drücken und sicherzustellen, dass er eng anliegt. Legen Sie dann den Schwanz für mindestens fünf Minuten in den Kochsalzschlauch, um eine warme Schwanzvene zu gewährleisten, die für die intravenöse Dosierung optimal ist. Bei Bedarf kann die IV-Dosierung nach fünf Minuten durchgeführt werden.Legen Sie dann eine Kunststoffabdeckung über die Maus, um den Wärmeverlust zu reduzieren. Lassen Sie die Schwänze nach der Dosierung der Testlösung fünf Minuten lang unter Wasser und führen Sie dann die Durchtrennung der Heckvene durch, indem Sie den Schwanz in den Schneidblock legen und um 90 Grad drehen, um die Vene freizulegen. Machen Sie den Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite, von wo aus die Testlösung dosiert wurde.Ziehen Sie die Skalpellklinge Nummer 11 durch den Schlitz des Schneidblocks und halten Sie den Schwanz fest, um Blutungen zu erzeugen. Bringen Sie dann sofort das Heck zur Kochsalzlösung zurück und setzen Sie die Stoppuhr zurück. Blutungen sollten sofort sichtbar sein.Das Eintauchen des Schwanzes in Kochsalzlösung ist wichtig für eine gleichmäßige Blutung, da er in freier Luft schnell zum Stillstand kommen würde. Beobachten Sie die Blutung und kommentieren Sie den Beginn und das Ende der Blutung während 40 Minuten auf dem Blutfluss-Notationspapier. Disqualifizieren und ersetzen Sie die Maus, wenn die primäre Blutung nicht innerhalb von drei Minuten nach dem Schnitt aufhört, was darauf hindeuten kann, dass der Schnitt zu tief ist oder dass die Maus einen Mangel an primärer Hämostase aufweist.Fordern Sie den Schwanzschnitt an, wenn es keine Blutungen gibt, 10, 20 und 30 Minuten nach der Verletzung. Heben Sie den Schwanz mit einem mit einem Mulltupfer getränkten und warmen Kochsalzlösung aus der Kochsalzlösung und wischen Sie ihn zweimal sanft, aber fest mit der nassen Gaze in distaler Richtung über den Schwanzschnitt ab. Tauchen Sie den Schwanz nach jeder Herausforderung sofort wieder in das Kochsalzrohr ein.Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie den Schwanz von der Kochsalzlösung, sammeln Sie auf Wunsch Blutproben und euthanasieren Sie die Mäuse, während Sie noch unter Vollnarkose sind. Die 15-Milliliter-Blutentnahmeröhrchen mit Kochsalzlösung bei 4.000 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand aus den Röhren.Resuspendiert das Pellet in zwei Milliliter Erythrozyten-Lyselösung. Dann verdünnen Sie es mit bis zu 12 zusätzlichen Millilitern Lysinglösung, bis es eine helle Kaffeefarbe erreicht. Notieren Sie sich das Gesamtvolumen und übertragen Sie zwei Milliliter der Verdünnung auf ein Hämoglobinröhrchen.Kühlen Sie es bis zur Hämoglobinanalyse. Eine signifikante Verringerung des Blutverlustes für rekombinante Gerinnungsfaktor-VIII-Behandlungsgruppen wurde unter Verwendung des optimierten Protokolls beobachtet. Eine Dosis von 20 internationalen Einheiten pro Kilogramm normalisierte die Blutung vollständig, und 10 IE pro Kilogramm verursachten einen signifikanten Effekt, der den Blutverlust fast bis zur oberen Grenze des Wildtypbereichs reduzierte.Ähnliche Ergebnisse wurden für die Blutungszeit beobachtet. Eine Reduktion wurde in 5, 10 und 20 IE pro Kilogramm-Gruppe beobachtet, wobei in der 20-IE-pro-Kilogramm-Gruppe vollständig normalisiert wurde. Bei Wildtyp-Mäusen lag der Gesamtblutverlust zwischen 200 und 840 Nanomol Hämoglobin und bei Fahrzeugmäusen zwischen 5.300 und 7.100 Nanomol Hämoglobin.Die mittlere Blutung betrug 5.200 Nanomol bei fahrzeugbehandelten Mäusen und 720 Nanomol in der Gruppe von 20 IE pro Kilogramm. Die Blutungszeit von Wildtyp-Mäusen reichte von ein bis neun Minuten und Dosisstufen von 10 und 20 IE pro Kilogramm reduzierten die Blutungszeit auf diesen Bereich. In den kombinierten Daten wurde eine starke Korrelation zwischen Blutverlust und Blutungszeit beobachtet.Alle aufgezeichneten Blutungsepisoden wurden aufgezeichnet, um eine Visualisierung der Länge und Anzahl der Blutungen für jede einzelne Maus zu liefern. Beachten Sie, dass in der Fahrzeuggruppe nach der zweiten Herausforderung die meisten Tiere bis zum Ende des Experiments weiter bluten. Die Messung der Plasmafaktor-VIII-Konzentration bestätigte, dass der beobachtete Effekt bei der Verringerung des Blutverlustes und der Blutungszeit rekombinant faktor-VIII-konzentrationsabhängig war.Die Thrombozytenzahl wurde nicht merklich beeinflusst und die Hämatokritspiegel lagen im normalen Bereich bei Tieren, die moderate und höhere rekombinante Faktor-VIII-Dosen erhielten, aber signifikant niedriger bei Tieren, die stark bluteten, wie im Vehikel und einer IE pro Kilogramm-Gruppe. Bei Tieren mit starken Blutungen kann ein geringer Einfluss auf das Blutbild, insbesondere auf das Gesamthämoglobin oder Hämatokrit, auftreten. Um die Wirkung des Geschlechts in diesem optimierten Modell zu bewerten, wurden sowohl die Ergebnisse des Blutverlusts als auch der Blutungszeit einer bidirektionalen ANOVA-Analyse unterzogen, wobei Geschlecht und Dosis als Faktoren verwendet wurden.Diese Ergebnisse zeigten, dass sich das Ansprechen auf die Behandlung nicht zwischen den Geschlechtern unterschied. Die korrekte Markierung des Schwanzes und das Erstellen des Schnitts sind wesentliche Schritte, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Technik zu gewährleisten, ebenso wie die Herausforderung, wenn es keine Blutungen gibt. Darüber hinaus ist eine gute Anästhesieinduktion und Aufrechterhaltung der tierischen Körpertemperatur besonders relevant.Wir haben dieses Modell auch verwendet, um das Stoppen etablierter Blutungen in einer eher bedarfsgerechten Umgebung zu untersuchen, indem wir 10 Minuten nach der Induktion der Blutung mit Faktor VIIA behandeln.

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Biologie

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Erfahren Sie das optimierte Schwanzvenen-Transections-Blutungsmodell zur Bewertung hämostatischer Therapien bei Hämophilie A Mäusen unter Vollnarkose. Diese Methode misst Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte.

Tail Vein Transection Bleeding Model bei vollnarkotisierter Hämophilie A Mäuse

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