Name: Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Lernen Sie die zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Analyse von Membranrezeptordynamik in lebenden CHO-Zellen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen.

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Dieses Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, Projektnummer 374031971, Projekt INF) an J.B. und K.G.H.
Wir danken dem Rudolf Virchow Center für die finanzielle Unterstützung und der Core Unit Fluorescence Imaging für die technische Unterstützung. Darüber hinaus danken wir Ashwin Balakrishnan für das gründliche Korrekturlesen.

1. Versuchsprotokoll
<ol><li>Probenvorbereitung HINWEIS: Führen Sie die Zellsaat und Transfektion unter sterilen Bedingungen durch.<ol>
<li>Legen Sie einen gereinigten Deckglas pro Vertiefung in eine 6-Well-Kulturplatte und waschen Sie ihn dreimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). ANMERKUNG: Das Deckglasreinigungsprotokoll ist in der Ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben.</li>
		<li>Zu jeder Vertiefung werden 2 ml des gesamten Zellkulturmediums mit Phenolrot (ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) gegeben und die Platte beiseite gehalten.</li>
		<li>Kultivieren Sie die CHO-Zellen in demselben Medium, das Phenolrot bei 37 °C und 5%CO2 enthält. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, um die toten Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Verdünnen Sie die abgelösten Zellen mit 8 ml phenolrothaltigem Medium und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer und säen Sie mit einer Dichte von 1,5 x 105 Zellen/Well in der 6-Well-Zellkulturplatte, die die Deckgläser enthält (hergestellt in Schritt 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen 24 h in einem Inkubator (37 °C,5%CO2) wachsen, um eine Konfluenz von ca. 80% zu erreichen.</li>
		<li>Verdünnen Sie 2 μg der gewünschten Vektor-DNA (z. B. CT-SNAP oder NT-SNAP) und 6 μL des Transfektionsreagenzes in zwei separaten Röhrchen, die jeweils 500 μl des reduzierten Serummediums für jede Vertiefung enthalten, und inkubieren Sie für 5 min bei RT.</li>
		<li>Mischen Sie die beiden Lösungen miteinander, um die Transfektionsmischung zu erhalten, und inkubieren Sie sie für 20 minuten bei RT.</li>
		<li>Waschen Sie in der Zwischenzeit die ausgesäten CHO-Zellen einmalig mit sterilem PBS.</li>
		<li>Ersetzen Sie das PBS durch 1 ml / Well phenolrotfreies Medium, das mit 10% FBS ohne Antibiotika ergänzt wird.</li>
		<li>Die gesamte 1 ml Transfektionsmischung tropfenweise in jede Vertiefung geben und die Zellen über Nacht bei 37 °C in 5%CO2inkubieren.</li>
		<li>Zur Markierung des SNAP-Konstrukts verdünnen Sie die geeignete SNAP-Substratstammlösung in 1 mL des Mediums, ergänzt mit 10% FBS, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erhalten.</li>
		<li>Waschen Sie die transfizierten Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung 1 μM SNAP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min bei 37 °C in 5%CO2.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit phenolrotfreiem Medium und fügen Sie 2 ml pro Well phenolrotfreies Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 °C in 5%CO2.</li>
		<li>Die Deckgläser aller Proben anschließend in die Bildgebungskammer überführen und mit 500 μL Bildpuffer waschen. Fügen Sie 500 μL Imaging-Puffer hinzu, bevor Sie zum FRET-FCS-Setup wechseln.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibriermessungen HINWEIS: Das FRET-FCS-Setup ist mit einem konfokalen Mikroskop-Wasserobjektiv, zwei Laserlinien, einem TCSPC-System (Time-Correlated Single Photon Counting), zwei hybriden Photomultiplierröhren (PMT) und zwei Avalanche-Photodioden (APD) für die Photonensammlung und die Datenerfassungssoftware ausgestattet. Es ist sehr wichtig, den Aufbau jedes Mal vor den Messungen mit lebenden Zellen auszurichten. Die detaillierte Aufbaubeschreibung finden Sie in Ergänzende Anmerkung 2. Sowohl Laser als auch alle Detektoren (zwei PMTs und zwei APDs) sind während der Messungen immer eingeschaltet, da alle Messungen unter identischen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Verwenden Sie für die Kalibrierungsmessungen einen Deckglas aus derselben Partie, auf der die Zellen ausgesät wurden, dies verringert die Variation der Kragenringkorrektur.<ol>
<li>Zur Einstellung der Fokus-, Loch- und Kragenringposition legen Sie 2 nM grüne Kalibrierlösung auf einen Glasdeckglas und schalten den 485 nm und 560 nm Laser ein. Betreiben Sie den Laser im PIE-Modus (Pulsed Interleaved Excitation)16.</li>
		<li>Konzentrieren Sie sich auf die Lösung und stellen Sie die Loch- und Kragenringposition so ein, dass die höchste Zählrate und das kleinste konfokale Volumen erhalten werden, um die maximale molekulare Helligkeit zu erhalten.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für die roten Kanäle mit 10 nM roter Kalibrierlösung und einer Mischung aus grüner und roter Kalibrierlösung.</li>
		<li>Legen Sie die 10 nM-DNA-Lösung auf einen Glasdeckglas und passen Sie die Fokus-, Loch- und Kragenringposition so an, dass die Kreuzkorrelation zwischen den grünen und roten Detektionskanälen am höchsten ist, d.h. die höchste Amplitude zeigt. HINWEIS: Die Schritte 1.2.1 und 1.2.4 müssen möglicherweise hin und her wiederholt werden, um die optimale Ausrichtung zu finden. Nehmen Sie 3-5 Messungen von jeder Kalibrierlösung für 30 s - 120 s vor, nachdem die Fokus-, Loch- und Kragenringposition optimal auf die grünen und roten Detektionskanäle und das konfokale Überlappungsvolumen ausgerichtet wurde.</li>
		<li>Messen Sie einen Tropfen von ddH2O, dem Bildmedium und einer nicht transfizierten Zelle jeweils 3-5 Mal für 30 s - 120 s, um die Hintergrundzählraten zu bestimmen.</li>
		<li>Sammeln Sie die Instrumentenreaktionsfunktion mit 3-5 Messungen für 30 s - 120 s. Dies ist optional, wird aber dringend empfohlen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lebendzellmessungen<ol>
<li>Finden Sie eine geeignete Zelle, indem Sie mit der Quecksilberlampe beleuchten und durch das Okular beobachten. HINWEIS: Geeignete Zellen sind lebendig und zeigen die typische Morphologie der jeweiligen adhärenten Zelllinie. Die Fluoreszenz des interessierenden Proteins, hier ein Oberflächenrezeptor, ist überall auf der Oberfläche sichtbar. Weniger helle Zellen sind aufgrund des besseren Kontrasts in FCS besser geeignet als hellere, wenn eine geringe Anzahl von Molekülen im Fokus ist.</li>
		<li>Schalten Sie beide Laser im PIE-Modus ein und fokussieren Sie sich auf die Membran, indem Sie die maximale Anzahl pro Sekunde betrachten. HINWEIS: Die Laserleistung muss möglicherweise für die Zellproben reduziert werden (weniger als 5 μW am Objektiv). Dies hängt von den verwendeten Fluorophoren und dem Aufbau ab.</li>
		<li>Beobachten Sie in der Online-Vorschau der Datenerfassungssoftware die Auto- und Kreuzkorrelationskurven des eGFP oder des beschrifteten SNAP-Tags am β2AR und sammeln Sie mehrere kurzmessungen (~2 -10) mit einer Erfassungszeit zwischen 60 -180 s. HINWEIS: Erregen Sie die Zellen nicht für längere Zeit kontinuierlich, da die Fluorophore bleichen können. Es hängt jedoch von der Helligkeit jeder Zelle ab, wie lange die Messungen dauern können und wie viele Messungen insgesamt durchgeführt werden können.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Datenanalyse
<ol><li>Datenexport<ol>
<li>Exportieren Sie die Korrelationskurven, G(tc),und die Zählraten, CR, aus allen Messungen.</li>
		<li>Achten Sie darauf, die Zeitfenster "Prompt" und "Delay" korrekt zu definieren und verwenden Sie die Option "Microtime Gating" in der Datenkorrelationssoftware. HINWEIS: Insgesamt sind drei verschiedene Korrelationen erforderlich: (1) Autokorrelation des grünen Kanals im Eingabeaufforderungszeitfenster (ACFgp), (2) Autokorrelation der roten Kanäle im Verzögerungszeitfenster (ACFrd) und schließlich (3) die Kreuzkorrelation des grünen Kanalsignals im Eingabeaufforderungszeitfenster mit dem roten Kanalsignal im Verzögerungszeitfenster (CCFPIE). Der Datenexport wird Schritt für Schritt für verschiedene Software in Ergänzende Anmerkung 3 dargestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibriermessungen<ol><li>Verwenden Sie die Autokorrelationsfunktionen der grünen (ACFgp) und roten (ACFrd) Fluorophorlösungen und passen Sie sie bei Bedarf an ein 3D-Diffusionsmodell mit einem zusätzlichen Triplettterm an (Gl. 1), um die Form und Größe des konfokalen Detektionsvolumens für die beiden verwendeten Farbkanäle zu kalibrieren: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> Gleichung 1 Dabei ist b die Basislinie der Kurve, N die Anzahl der fokussierten Moleküle, tD die Diffusionszeit (in ms) und s = z0/w0 der Formfaktor des konfokalen Volumenelements. Das Triplett blinkt oder andere Photophysik wird durch seine Amplitude aR und Relaxationszeit tRbeschrieben. HINWEIS: Alle Variablen und Symbole, die innerhalb des Protokolls verwendet werden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
		<li>Verwenden Sie die bekannten Diffusionskoeffizienten D für den grünen26 und roten Kalibrierstandard27 und die erhaltenen Formfaktoren sgrün und srot, um die Abmessungen (Breite w0 und Höhe z0)und das Volumen Veff des konfokalen Volumenelements (Eq. 2a-c) zu bestimmen. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">Gl. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">Gl. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">Gl. 2c HINWEIS: Vorlagen für die Berechnung des Kalibrierparameters werden als ergänzende Dateien (S7) zur Verfügung gestellt.</li>
		<li>Berechnen Sie das spektrale Übersprechen α des grünen Fluoreszenzsignals (gesammelt in den Kanälen 0 und 2) in die roten Detektionskanäle (Kanalnummer 1 und 3) als Verhältnis der hintergrundkorrigierten (BG) Signale (Gl. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> Gl. 3</li>
		<li>Bestimmen Sie die direkte Anregung des Akzeptorfluorophors δ durch die Donoranregungswellenlänge durch das Verhältnis der hintergrundkorrigierten Zählrate der roten Kalibriermessungen im Zeitfenster "prompt" (Anregung durch grünen Laser) zur hintergrundkorrigierten Zählrate im Zeitfenster "Verzögerung" (Anregung durch roten Laser) (Vgl. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> Gl. 4</li>
		<li>Berechnen Sie die molekulare Helligkeit B sowohl der grünen als auch der roten Fluorophore (Gl. 5a-b) basierend auf den hintergrundkorrigierten Zählraten und der erhaltenen Anzahl der Moleküle im Fokus, N, aus der 3D-Diffusionsanpassung (Eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">Gl. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">Gl. 5b</li>
		<li>Passen Sie sowohl ACFgp und ACFrd als auch CCFPIE der doppelt markierten DNA an das 3D-Diffusionsmodell an (Gl. 1). Halten Sie die erhaltenen Formfaktoren, sgrün und srot, konstant für ACFgp bzw. ACFrd. Der Formfaktor für die CCFPIE, sPIE, liegt normalerweise zwischen diesen beiden Werten. HINWEIS: In einem idealen Setup hätten sowohl Veff,grün als auch Veff, rot die gleiche Größe und überlappen sich perfekt.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Amplitude bei Null Korrelationszeit, G0(tc), basierend auf den gefundenen Werten der scheinbaren Anzahl von Molekülen im Fokus (Ngrün, Nrot und NPIE).</li>
		<li>Berechnen Sie das Amplitudenverhältnis rGR und rRG für eine Probe mit 100% Kodiffusion von grünen und roten Fluorophoren (Eq. 6). Beachten Sie, dass NPIE nicht die Anzahl der doppelt markierten Moleküle im Fokus widerspiegelt, sondern nur die 1 /G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">und <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> Gl. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Experimente mit lebenden Zellen<ol><li>Passen Sie bei einfach beschrifteten Konstrukten die Zellproben an ein geeignetes Modell an. Für den gezeigten Membranrezeptor erfolgt die Diffusion bimodal mit einer kurzen und einer langen Diffusionszeit. Zusätzlich müssen die Photophysik und das Blinken der Fluorophore berücksichtigt werden: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> Gl. 7 Dabei sind td1 und td2 die beiden erforderlichen Diffusionszeiten, und eine1 ist der Bruchteil der ersten Diffusionszeit. HINWEIS: Im Gegensatz zu den Kalibriermessungen, bei denen die freien Farbstoffe und DNA-Stränge frei in alle Richtungen diffundieren, zeigt der Membranrezeptor nur eine 2D-Diffusion entlang der Zellmembranen. Dieser Unterschied zwischen 3D- und 2D-Diffusion spiegelt sich im modifizierten Diffusionsterm wider (vgl. Eq. 1), wobei tD im 2D-Fall nicht vom Formfaktor s des konfokalen Volumenelements abhängt. </li>
		<li>Berechnen Sie die Konzentration c von grün oder rot markierten Proteinen aus dem jeweiligen N- und V-Eff mit grundlegender Mathematik (Eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">Gl. 8 wobei NA = Avogadro-Zahl</li>
		<li>Passen Sie für die N-terminale SNAP-Markierung und das intrazelluläre eGFP die beiden Autokorrelationen (ACFgp und ACFrd) der doppelt markierten Probe mit dem gleichen Modell an wie für die einfach markierten Konstrukte für die ACFs (Ziff. 7) und die CCFPIE unter Verwendung eines bimodalen Diffusionsmodells (Gl. 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">Gl. 9 HINWEIS: Für eine globale Beschreibung des Systems müssen alle drei Kurven zusammenpassen: Der Diffusionsterm ist für alle drei Kurven identisch und die einzige Differenz ist der Relaxationsterm für den CCFPIE. Da die Photophysik von zwei Fluorophoren in der Regel nicht zusammenhängt, ist kein Korrelationsbegriff erforderlich. Dieses Fehlen von Relaxationstermen führt zu einem flachen CCFPIE bei kurzen Korrelationszeiten. Übersprechen und direkte Anregung des Akzeptors aufgrund des Donorfluorophors können jedoch falsch-positive Amplituden aufweisen und sollten sorgfältig auf die Verwendung der Kalibriermessungen überprüft werden.</li>
		<li>Berechnen Sie die Konzentration c von grün oder rot markierten Proteinen aus dem jeweiligen N- und V-eff mit Gleichung 8.</li>
		<li>Schätzen Sie den Anteil oder die Konzentration , cGR oder cRG, von interagierenden grün und rot markierten Proteinen aus den Zellproben unter Verwendung der aus den DNA-Proben erhaltenen Korrekturfaktoren, der Amplitudenverhältnisse rGR und rRG der Zellprobe und ihrer jeweils erhaltenen Konzentrationen (Eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> und <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> Gl. 10</li>
		<li>Passen Sie für die C-terminale SNAP-Markierung und das intrazelluläre eGFP die beiden Autokorrelationen (ACFgp und ACFrd) der FRET-Probe als single-labeled samples (Gleichung 7) und des CCFFRET an ein bimodales Diffusionsmodell an, das einen Antikorrelationsterm enthält (Gleichung 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> Gl. 11 wobei af die Amplitude der gesamten Antikorrelation und aR und tR die jeweilige Amplitude und Relaxationszeit widerspiegelt. HINWEIS: Im Falle von antikorrelierten Fluoreszenzänderungen aufgrund von FRET können ein oder mehrere Antikorrelationsterme erforderlich sein (Gl. 11), was zu einem "Rückgang" der CCF-FRET zu Zeiten niedriger Korrelation führt, die mit einem Anstieg der beiden Autokorrelationen (ACFgp und ACFrd) zusammenfallen. Beachten Sie jedoch, dass Photophysik wie Triplett-Blinzeln den Anti-Korrelationsterm maskieren kann, indem sie die FRET-induzierte Anti-Korrelation dämpft. Eine gemeinsame Analyse, ergänzt durch gefilterte FCS-Methoden, könnte helfen, den Anti-Korrelations-Term zu entlarven. Zusätzlich sollten technische Artefakte, die aus Totenzeiten in der Zählelektronik im Nanosekundenbereich stammen, ausgeschlossen werden16. Ein detaillierteres Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Durchführung der Analyse in ChiSurf28 und Vorlagen für die Berechnung des konfokalen Volumens oder der molekularen Helligkeit werden im Github-Repository (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) und als ergänzende Dateien (Ergänzende Anmerkung 4 und Ergänzende Anmerkung 6) bereitgestellt. Zusätzlich finden Sie dort die Python-Skripte für den Batch-Export von Daten, die mit der Symphotime-Software im .ptu-Format erfasst wurden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine der wichtigsten Methoden zur Quantifizierung der Proteindynamik und der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit minimaler Störung im zellulären Kontext. Die konfokale Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine der leistungsfähigen Methoden zur Analyse der Molekulardynamik, da sie einzelmolekülempfindlich, hochselektiv und lebendzellkompatibel ist1. Im Vergleich zu anderen dynamikorientierten Ansätzen hat FCS einen breiteren messbaren Zeitbereich, der von ~ ns bis ~ s reicht und vor allem die schnellen Zeitskalen abdeckt, die für bildgebende Verfahren oft nicht zugänglich sind. Darüber hinaus bietet es auch räumliche Selektivität, so dass die Membran-, Zytoplasma- und Kernmoleküldynamik leicht unterschieden werden kann 2. So können molekulares Blinken, die mittlere lokale Konzentration und der Diffusionskoeffizient quantitativ mit FCS analysiert werden. Intermolekulare Dynamik wie Bindung wird leicht zugänglich, wenn die Kodiffusion von zwei molekularen Spezies in der Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) -Analyse3,4,5 ineinem zweifarbigen Ansatz untersucht wird.
Das Hauptprinzip der Korrelationsspektroskopie ist die statistische Analyse von Intensitätsschwankungen, die von fluoreszenzmarkierten Biomolekülen emittiert werden, die in einen Laserfokus ein- und ausdringen (Abbildung 1A). Die resultierenden Auto- oder Kreuzkorrelationsfunktionen können dann durch Kurvenanpassung weiter analysiert werden, um schließlich die Zinskonstanten von Interesse abzuleiten. Mit anderen Worten, die statistischen Methoden FCS und FCCS liefern keine Einzelmolekülspuren wie bei der Einzelpartikelverfolgung, sondern ein dynamisches Muster oder einen "Fingerabdruck" einer untersuchten Probe mit hoher zeitlicher Auflösung. In Kombination mit dem Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) können intramolekulare Dynamiken wie Konformationsänderungen gleichzeitig in einem gemeinsamen konfokalen Aufbau5,6überwacht werden. FRET untersucht den Abstand von zwei Fluorophoren und wird oft als molekularer "Nanoruler" bezeichnet. Energietransfer findet nur statt, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähe befinden (< 10 nm), das Emissionsspektrum des Donors sich signifikant mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptormoleküls überschneidet und die Dipolorientierung von Donor und Akzeptor (ausreichend) parallel ist. Somit bietet die Kombination von FRET und FCCS eine Technik mit sehr hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Wenn räumliche Selektivität, Empfindlichkeit sowie Lebendzellkompatibilität erforderlich sind, hat FRET-FCCS einen offensichtlichen Vorteil gegenüber anderen Methoden wie der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC)7,der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)8oder der Kernspinresonanz (NMR)9,10 zur Messung der Proteindynamik und -wechselwirkungen.
Trotz der Fähigkeiten und des Versprechens der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (dc-FCCS) ist die Durchführung von dc-FCCS in lebenden Zellen aufgrund des spektralen Durchblutens oder Übersprechens zwischen den Kanälen3,4, des Unterschieds in den konfokalen Volumina aufgrund der spektral unterschiedlichen Laserlinien 3,4,11, Hintergrundsignal und Rauschen oder begrenzter Photostabilität der Proben technisch anspruchsvoll12. 13,14,15. Die Einführung der pulsverschachtelten Anregung (PIE) in FCCS war eine wichtige Optimierung, um die verschiedenen Laseranregungen zeitlich zu entkoppeln, um das spektrale Übersprechen zwischen den Kanälen zu reduzieren16. Andere Korrekturmethoden zur Bekämpfung der spektralen Durchblutung17,18,19 und Hintergrundkorrekturen wurden ebenfalls gut akzeptiert17,18,19. Für Details und Grundlagen zu FCS, PIE oder FRET wird auf die folgenden Referenzenverwiesen 2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Hier werden alle notwendigen Kalibrierexperimente und Analysen zusammen mit den experimentellen Ergebnissen eines prototypischen G-Protein-gekoppelten Rezeptors, β 2-adrenergen Rezeptor (β2AR), für drei verschiedene Szenarien vorgestellt: (1) einfach markierte Moleküle, die entweder eine "grüne" (eGFP) oder eine "rote" (SNAP-Tag-basierte Markierung)25 Fluorophor tragen; (2) ein doppelt markiertes Konstrukt, das einen N-terminalen SNAP-Tag und intrazelluläres eGFP (NT-SNAP) trägt [in diesem Fall befinden sich beide Markierungen am selben Protein. Somit wird 100% Co-Diffusion erwartet]; und (3) eine doppelt markierte Probe, bei der sich beide Fluorophore auf derselben Seite der Zellmembran befinden (CT-SNAP). Es trägt einen C-terminalen SNAP-Tag und ein intrazelluläres eGFP. Auch hier sind beide Markierungen am selben Protein mit wiederum 100% Co-Diffusion zu erwarten. Da beide Markierungen sehr nahe beieinander liegen, auf der gleichen Seite der Zellmembran, zeigt es das Potenzial, FRET und antikorreliertes Verhalten zu beobachten. Alle Konstrukte wurden in Zellen des chinesischen Hamsterovary (CHO) transfiziert und später mit einem rot fluoreszierenden Substrat markiert, das für das NT-SNAP-Konstrukt membranundurchlässig und für das CT-SNAP-Konstrukt membrandurchlässig ist. Schließlich veranschaulichen simulierte Daten den Einfluss experimenteller Parameter auf die FRET-induzierte Antikorrelation und die Wirkung von Protein-Protein-Interaktionen auf die Co-Diffusionsamplitude.
Somit bietet dieses Protokoll eine vollständige Anleitung zur Durchführung des kombinierten FRET-FCCS in lebenden Zellen, um die Proteindynamik und die Protein-Protein-Interaktionen zu verstehen und gleichzeitig auf technische/physikalische Artefakte, Herausforderungen und mögliche Lösungen aufmerksam zu machen.

<table><tbody><tr><td>1x Teleskop in 4f-Konfiguration mit fünf Linsen</td><td>Qioptiq, Rhyl, UK</td><td>G063126000</td><td>Optics</td></tr><tr><td>2x Bandpassfilter Brightline</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Deutschland</td><td>HC 525/50 und HC 600/52</td><td>Filter</td></tr><tr><td>2x dichroitischer Strahlteiler</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Deutschland</td><td>HC BS F38-573</td><td>Filter</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatte Nunc</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>140675</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (grüner Kalibrierstandard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20000</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (roter Kalibrierstandard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20003</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>ASI Tisch PZ-2000 XYZ</td><td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Deutschland</td><td>WK-XYB-PZ-IX71</td><td>Mikroskopteile</td></tr><tr><td>Attofluor Zellkammer, 35 mm Durchmesser für&nbsp; 25 mm runde Deckgläser</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A7816</td><td>Glasdeckglashalter</td></tr><tr><td>Avalanche Fotodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td><td>Laser Components GmbH, Olching, Deutschland</td><td>SPCM-AQR-14</td><td>Einzelphotonenzähldetektor</td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Newport, Darmstadt, Deutschland</td><td>10FC16PB.3</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Biorender (Software)</td><td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>---<td>Software zur Erstellung einer GPCR-Skizze, https://app.biorender.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Chinesischer Hamster Eierstock (CHO) Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>Zelllinien</td></tr><tr><td>ChiSurf (Datenanalysesoftware)</td><td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td><td></td>---<td>tttrlib-basierte Software zur Analyse von Fluoreszenzkorrelationsdaten und Fluoreszenzzerfallshistogrammen, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Anleitung: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>472476-2.5L</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Deutschland)</td><td>A3672,0250</td><td>Reagenz-DNA-Strang</td></tr><tr><td>(40 bp Fluorophorabstand)</td><td>IBA Lifesciences GmbH (G&ouml; ttingen, Deutschland)</td><td>---</td><td>Reagenz, 5' CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3', 3' GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5'</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle-Medium: Nährstoffgemisch F12 (mit und ohne Phenolrot)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>P04-41250, P04-41650</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ethanol (absolut)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>34852-1L-M</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Erythrosin B,Farbstoffgehalt >=95 %</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>200964-5G</td><td>Reagenz, Instrumentenansprechfunktion, gelöst in EtOH bis 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biochrom&nbsp; (Berlin, Deutschland)</td><td>S 0615</td><td>Reagenz-Fluoreszenzlichtquelle</td></tr><tr><td>X-Cite 120 Q</td><td>Excelitas Technologies, Ontario, Kanada</td><td>XI120-Q-5060</td><td>Mikroskopteile</td></tr><tr><td>Fluoreszierende SNAP-Substratzelle : SNAP Cell TMR- STAR</td><td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Deutschland)</td><td>S9105S</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Fluoreszierende SNAP-Substratoberfläche : DY-549</td><td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Deutschland)</td><td>S9112S</td><td>Reagenzgläser</td></tr><tr><td>aus Glas (Maße: Durchmesser 24 mm, Dicke 0,13 - 0,16 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml; nigshofen, Deutschland)</td><td>111640</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Laser Controller</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>910020 (PDL 828-S "SEPIA II")</td><td>Optik</td></tr><tr><td>Laserlinien (480 nm und 560 nm)</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td><td>Optik</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>11668-019</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>MFD suite (Software)</td><td>AG Seidel, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland</td><td>---</td><td>Softwarepaket zur Analyse von Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimenten, u.a. Kristine (Korrelation von tttr-Daten), Burbulator (Simulation eines Einzelmolekül-Experiments), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td></tr><tr><td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25,4 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Deutschland</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>Zweiter Teil des Strahlaufweiter</td></tr><tr><td>Neubauer Kammer (Tiefe 0,1 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml; nigshofen, Deutschland)</td><td>640110</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 Stand</td><td>Olympus, Hamburg, Deutschland</td><td>IX2-ILL100</td><td>Mikroskopteile</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduziertes Serummedium)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>31985-047</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>049M4857V</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>14190144</td><td>Reagenz-Lochblende</td></tr><tr><td>(50 & Mikro; M)</td><td>Newport, Darmstadt, Deutschland</td><td>PNH-50</td><td>Pinhole</td></tr><tr><td>PMT Hybrid-40</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>932200 (PMA Hybrid 40)</td><td>Einzelphotonenzähldetektor</td></tr><tr><td>Python scripts (Software)</td><td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Zentrum für integrative und translationale Bildgebung, Universität Würzburg, Deutschland</td><td>---</td><td>Sammlung von selbstgeschriebenen Python-Skripten auf Basis von tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib), die verwendet werden, um (1) die durchschnittlichen Zählraten zu bestimmen, (2) die Daten zu korrelieren und (3) Fluoreszenzzerfallshistogramme zu erstellen, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td></tr><tr><td>Quad-Band-Strahlteiler (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td><td>AHF, T&uuml; bingen, Deutschland</td><td>F73-421PH</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Singlemode Faserpolarisation haltend, NA = 0,08 mit Kollimator</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>02126</td><td>Optik</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>6771.1</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>SymPhotime x64 Software (Datenerfassungs- und Datenexportsoftware)</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>931073 (SPT64-1+2 Einzelbenutzer )</td><td>Time-Tag Time-Resolved (tttr) Datenerfassung am selbst gebauten FCCS-Setup, Datenexport</td></tr><tr><td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) System Hydraharp 400</td><td>Picoquant, Berlin, Deutschland</td><td>930010 (Hydraharp 400)</td><td>Optik</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>T4299-100ml</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ungefasste achromatische Dubletten, ARC: 400 - 700 nm, D=12,7 mm, F=-20 mm</td><td>Thorlabs, Bergkirchen, Deutschland</td><td>ACN127-020-A</td><td>Erstes Teil des Strahlaufweiters</td></tr><tr><td>Wasserimmersionsobjektiv (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td><td>Olympus, Hamburg, Deutschland</td><td>UPLSAPO60XW</td><td>Objektiv</td></tr></tbody></table>

zweifarbige fluoreszenz-kreuzkorrelationsspektroskopie zur untersuchung der protein-protein-interaktion und proteindynamik in lebenden zellen

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Wir stellen ein Protokoll und einen Workflow zur Durchführung der Zweifarb-Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET) vor, um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen. Im zweifarbigen FCCS, bei dem die Fluktuationen der Fluoreszenzintensität den dynamischen "Fingerabdruck" des jeweiligen fluoreszierenden Biomoleküls darstellen, können wir die Co-Diffusion oder Bindung der Rezeptoren untersuchen. FRET mit seiner hohen Empfindlichkeit gegenüber molekularen Abständen dient als bekannter "Nanoruler" zur Überwachung intramolekularer Veränderungen. Zusammengenommen werden Konformationsänderungen und Schlüsselparameter wie lokale Rezeptorkonzentrationen und Mobilitätskonstanten in zellulären Umgebungen zugänglich.
Quantitative Fluoreszenzansätze sind in Zellen aufgrund des hohen Rauschpegels und der Anfälligkeit der Probe eine Herausforderung. Hier zeigen wir, wie dieses Experiment durchgeführt werden kann, einschließlich der Kalibrierungsschritte mit zweifarbig markierten β2-adrenergen Rezeptor (β2AR), die mit eGFP und SNAP-tag-TAMRA markiert sind. Ein Schritt-für-Schritt-Datenanalyseverfahren wird mit Open-Source-Software und Vorlagen bereitgestellt, die einfach anzupassen sind.
Unsere Leitlinie ermöglicht es Forschern, molekulare Wechselwirkungen von Biomolekülen in lebenden Zellen in situ mit hoher Zuverlässigkeit zu entschlüsseln, trotz der begrenzten Signal-Rausch-Werte in Lebendzellexperimenten. Das Betriebsfenster von FRET und insbesondere FCCS bei niedrigen Konzentrationen ermöglicht eine quantitative Analyse unter nahezu physiologischen Bedingungen.

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Die Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie ist eine statistische Methode, die die Zeitergebnisfluoreszenz verwendet, um die dynamische Signatur von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in lebenden Zellen zu lokalisieren. Hier interessieren wir uns besonders für beta-2 adrenerge Rezeptoren. Sphingolipidrezeptoren liefern hauptsächlich Informationen über die translationale Diffusionsdynamik und mit Hilfe der Fluoreszenzanisotropie auch über die Rotationsdiffusion.Durch die Einführung eines zusätzlichen Etiketts können wir auch Bindungs- oder sogar Konformationsänderungen fördern, wenn wir die Resonanzenergieübertragung zwischen den untersuchten Etiketten fördern. Die quantitative zeitaufgelöste Fluoreszenz erfordert eine sorgfältige Ausrichtung der Aufbau- und Kalibrierungsmessungen. In den folgenden Minuten werden wir einen experimentellen Leitfaden für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie von Lebenszellen, die Kreuzkorrelationsspektroskopie und den Forster-Resonanzenergietransfer von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren unter Verwendung klonfähiger Tags und synthetischer Flusskraft bereitstellen.Zellsitzen und Transfixieren müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Legen Sie eine saubere Deckblatt-Langhantel auf eine Sechs-Well-Kulturplatte und waschen Sie sie mit steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung ab, fügen Sie zwei ml Zellkulturmedium mit Phenolrot hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 Mikrogramm pro Aminpenicillin und 100 Mikrogramm pro ml Streptomycin zu jeder Vertiefung und halten Sie es beiseite. Nehmen Sie die CHO-Zellen, die im selben Medium mit Phenolrot bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent CO2 kultiviert werden, und waschen Sie sie mit fünf ml PBS, um die toten Zellen zu entfernen.Fügen Sie zwei ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Datenzellen mit acht ml Medium mit Phenolrot und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer und setzen Sie die Zellen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Vertiefung in die sechs Vertiefungskulturplatte, die den Deckschlupf enthält.Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Inkubator wachsen, um eine Konfluenz von ungefähr 80% zu erreichen. Verdünnen Sie zwei Mikrogramm der gewünschten Vektor-DNA. Zum Beispiel CT SNAP oder NT SNAP und sechs Mikroliter dieses Transfektionsreagenzes in zwei separate Röhrchen.Jeder enthielt 500 Mikroliter reduziertes Serummedium für jede Vertiefung und inkubierte sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Mischen Sie die beiden Lösungen miteinander, um die Transfektionsmischung zu erhalten, und inkubieren Sie sie für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie in der Zwischenzeit die sitzenden CHO-Zellen einmalig mit sterilem PBS.Ersetzen Sie das PBS durch ein ml pro Vertiefung phenolrotfreies Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und ohne Antibiotika. Fügen Sie die gesamte Konstruktionsmischung von einem ml Tropfenweise zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad in fünf Prozent CO2. Zur Markierung verdünnen Sie das geeignete SNAP-Substrat in einem ml Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt wird, um eine Endkonzentration von einem Mikromolaren zu erhalten.Waschen Sie die transfizierten Zellen einmal mit PBS und fügen Sie eine ml pro Vertiefung einer mikromolaren SNAP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei 37 Grad in fünf Prozent CO2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit phenolrotfreiem Medium und fügen Sie zwei ml pro Well phenolrotfreies Medium hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent CO2. Übertragen Sie den Abdeckschein aller Proben anschließend in die Bildgebungskammer und waschen Sie ihn mit 500 Mikroliter Bildgebungspuffer. Fügen Sie 500 Mikroliter Imaging-Puffer hinzu, bevor Sie zum FRED FCS-Setup wechseln.Das FRED FCS-Setup ist mit einem konfokalen Mikroskopie-Wasserobjektiv, zwei Laserlinien, einem Zeitquilter-Einzelauslandszählsystem, zwei Hybrid-BMTs und zwei Aktien für die Photonensammlung und die Datenerfassungssoftware ausgestattet. Es ist sehr wichtig, den Aufbau jedes Mal vor der Messung in lebenden Zellen auszurichten. Um Fokus, Loch und Farbposition einzustellen, legen Sie zwei nanomolar grüne Kalibrierlösungen auf einen Glasabdeckungsschein und schalten Sie den 485-Nanometer- und 560-Nanometer-Laser ein, der in Stapeln, interleaved-Anregung oder PI-Modus betrieben wird.Konzentrieren Sie sich auf die Lösung und stellen Sie die Loch- und Kragenringposition so ein, dass die höchste Zählrate und das kleinste konfokale Volumen erhalten werden, um die maximale molekulare Helligkeit zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die roten Kanäle mit 10 nanomolaren roten Kalibrierlösungen und einer Mischung aus beidem. Legen Sie 10 nanomolare DNA-Lösung auf glasbedeckten Zettel und stellen Sie den Fokus des Lochlochs und die Position des Kragenrings so ein, dass die Kreuzfarben zwischen den grünen und roten Detektionskanälen am höchsten sind.Das ist die Quelle der höchsten Amplitude. Für Messungen in lebenden Zellen finden Sie eine geeignete Zelle, indem Sie mit der Markerlampe limitieren und durch das Okular beobachten. Schalten Sie beide Laser im PI-Modus ein und fokussieren Sie sich auf die Membran, indem Sie nach den maximalen Anzahlen pro Sekunde suchen.Bitte beachten Sie, dass die Laserleistung für die Zellproben möglicherweise reduziert werden muss. Vorzugsweise weniger als fünf Mikrowatt am Ziel. Dies hängt stark von der verwendeten Blume und dem Setup ab.Beobachten Sie die Auto- und Cross-Coll-Kurven der an EGP- und Snap-Tag-Sonden gebundenen Beta-2 AR in der Online-Vorschau der Datenerfassungssoftware und sammeln Sie mehrere Sortiermessungen mit einer Erfassungszeit zwischen 60 und 180 Sekunden. Exportieren Sie den Korrelationsverlauf und den Kontrast aus allen Messungen. Bitte achten Sie hier darauf, die Zeitfenster für Eingabeaufforderung und Verzögerung korrekt zu definieren und verwenden Sie eine Mikrozeiterfassungsoption in der Datenkorrelationssoftware.Insgesamt sind drei verschiedene Korrelationen erforderlich. Automatische Korrelation des Zeitfensters für die Eingabeaufforderung des grünen Kanals. Automatische Korrelation der roten Kanäle und des Verzögerungszeitfensters.Und schließlich war die Kreuzkorrelation des grünen Kanalsignals und des Eingabeaufforderungszeitfensters das rote Kanalsignal im Verzögerungszeitfenster. Hier sind die Autokorrelationsfunktionen des grünen und roten FRED für Lösungen und passen Sie sie an ein 3-DT-Diffusionsmodell mit einem zusätzlichen Triplettterm an, der erforderlich ist, um die Form und Größe des konfokalen Detektionsvolumens für die beiden Verwendeten Farbkanäle zu kalibrieren, wobei B die Basislinie der Kurve und die Anzahl der Moleküle und des Fokus ist. TD die Diffusionszeit und S, die Null über Omega Null, der Formfaktor des konfokalen Volumenelements. Die Triplett-Blink- und Fotophysik wird als Amplituden-AR und Relaxationszeit TR beschrieben. Verwenden Sie den bekannten Diffusionskoeffizienten für die grünen und roten Kalibrierungsmerkmale und erhalten Sie Formfaktoren, um die Abmessungen und das Volumen des infektiösen konfokalen Volumenelements zu bestimmen.Berechnen Sie das Spektrum wie IFR, das grüne Fluoreszenzsignal, das auf den Kanälen Nullen gesammelt wird, und zwei in den richtigen Detektionskanal, Kanal eins und drei, als Verhältnis der im Hintergrund gesammelten Signale. Bestimmen Sie die direkte Erwartung des Akzeptorflusses von Daten durch die Donoranregungswellenlängen durch das Verhältnis des hintergrunderzogenen Kontrasts der roten Kalibriermessungen und der prompten Zeitfensteranregung durch grünen Laser zum Hintergrund korrekte Darstellung direkt in der Verzögerungszeitfensteranregung durch roten Laser. Berechnen Sie die molekulare Helligkeit von B sowohl die grüne als auch die rote Strömungskraft basierend auf dem Hintergrund des gesammelten Kontrastes, und um die Anzahl der Moleküle zu erhalten und sich auf die 3 DT-Diffusionsanpassung zu konzentrieren.Passen Sie sowohl Ultrakorrelationen aus dem grünen und roten Kanal als auch über die Korrelation von der grünen Eingabeaufforderung und der roten Verzögerung der Doppelebenen-DNA an das 3-DT-Diffusionsmodell an, um die erhaltenen Formfaktoren für die Autokorrelationsfunktionen konstant zu halten. Der Formfaktor für die Kreuzkorrelationsfunktionen liegt normalerweise zwischen diesen beiden Werten. Bestimmen Sie die Amplitude bei Null Korrelationszeit basierend auf den Schriftwerten der scheinbaren Anzahl von Molekülen und Fokus.Berechnen Sie das Amplitudenverhältnis für eine Probe war eine 100% Co-Diffusion von grüner und roter Bodenkraft. Passen Sie die Zellproben an ein geeignetes Modell an. Wie sie gezeigt werden, dass die Membranrezeptordiffusion nicht bimodal ist, war eine kurze, keine lange Diffusionszeit.Zusätzlich müssen die Fotophysik und das Ausblinzeln der Bodenkraft berücksichtigt werden. Hier zu TD1 und TD2, sind die beiden für Diffusionszeiten erforderlich. Und eine ist ein Bruchteil der ersten Diffusionszeit Im Gegensatz zur Kalibrierungsmessung, bei der die freie Würfel- und DNA-Strangdiffusion in alle Richtungen, Membranrezeptoren nur 2D-Diffusion entlang der Zellmembranen zeigen, berechnen die Konzentration von Grün- oder Rotmarkierungsproteinen unter Berücksichtigung der Anzahl der Moleküle und des Fokus.Und das Volumen des konfokalen Volumenelements unter Verwendung der Biasing-Masse. Passen Sie die beiden Alt-Korrelationen der doppelt markierten Stichprobe mit dem gleichen Modell wie für das einstufige Konstrukt und die Kreuzkorrelationsfunktion mit einem bimodalen Diffusionsmodell an, Hinweis für eine globale Beschreibung des Systems. Alle drei Kulturen müssen zusammen fit sein.Der Diffusionsterm ist für alle drei Kulturen identisch. Und der einzige Unterschied ist eine Reputationszeit fällt, die Kreuzkorrelationsfunktion. Berechnen Sie die Konzentration von grünen oder roten Arbeitsproteinen aus der jeweiligen Anzahl von Molekülen und Fokus und dem Volumen des konfokalen Volumenelements.Schätzen Sie den Anteil oder die Konzentration von interagierenden Grün- und Rotmarkierungsproteinen aus den Zellproben unter Verwendung der aus den DNA-Proben erhaltenen Korrekturfaktoren, der Amplitudenverhältnisse der Zellprobe und der jeweils erhaltenen Konzentrationen. Passen Sie die beiden Alterkorrelationen der FRED-Probe als einzelne markierte Proben und die vordere Kreuzkorrelation zu einem bimodalen Diffusionsmodell an, das einen Antikorrelationsterm enthält, wobei AF die Amplitude der gesamten Antikorrelation und AR und TR die jeweilige Amplitude und Relaxationszeit widerspiegelt. Im Falle von antikorrelierten Fluoreszenzänderungen aufgrund von FRED können ein oder mehrere Antikorrelationsterme erforderlich sein, was zu einem Rückgang der Fred-Kreuzkorrelationsfunktion bei niedrigen Korrelationszeiten führte, die mit einem Anstieg der beiden Autokorrelationsfunktionen zusammenfielen.Die Kalibrierungsmessungen der grünen und roten Blütenlösungen zur Rasur von Faktoren von 6,5 und den grünen Kanälen und 6,8 in den roten Kanälen. So hat das konfokale Volumen die Größe von 1,4 und 1,9 Femto später an diesem Messtag, die Molekülhelligkeit liegt bei 12,5 Kilohertz pro Molekül und 2,6 Kilohertz pro Molekül. Wir haben 15% des Übersprechens von der grünen Blütenpracht für in die roten Kanäle nach der Spendererregung und 38% der direkten außer Anregung der roten Blütenform durch die grüne, aus unserer DNA-Messung bestimmen wir die Korrekturfaktoren für das konfokale Überlappungsvolumen auf 0,6 und 0,7 auch, die mit einem einzigen Markierungskonstrukt transfizierten Zellen zeigen eine bimodale zweidimensionale Diffusion auf der Zellmembran, wo etwa die Hälfte der Moleküle langsam auf diffundiert die Zeitskala von 50 bis hundert Millisekunden und die andere Hälfte relativ schnell um zwei Millisekunden in beiden Konstrukten.Zusätzlich ist Triplet-Blinken vorhanden. Im Red-Level-Snap-Konstrukt wird jedoch eine weitere Relaxationszeit bei 180 Mikrosekunden erfasst, die von Unbound Snap Straight herrühren könnte. Von der Doppelmarkierung selbst, die mit dem Anti-Snap-Konstrukt durchtrennt wurde, bei dem die beiden Markierungen auf zwei verschiedenen Seiten der Zellmembran zwei weniger Messungen durchgeführt wurden, wurden das Rauschen und die rote Schicht auf Korrelation gesammelt.Und die PI-Kreuzkorrelation ist hier ziemlich hoch. Hier sind 70% der Moleküle, wenn man langsam unter einer Zeitskala von hundert Millisekunden und nur 30% schnell um eine Millisekunde ist, ist der Anteil der doppelt freisetzenden Moleküle gering und liegt zwischen 15 und 25%Die Daten für den CT-Snap sehen besser aus und es ist weniger laut. Die erwartete vordere tiefste Antikorrelation kann jedoch nicht gesehen werden und ist höchstwahrscheinlich massereich durch die hohe Menge an Übersprechen, direkte Akzeptanzerregung und Triplett-Blinken beider Blütenkraft, und sobald Datenanalyseschemata die gesammelte Fluoreszenzintensität DKS nutzen, könnten helfen, dies zu retten, wie für den simulierten Datensatz gezeigt.Der Vorteil der Fred FCS-Technik besteht darin, dass wir neben der Mobilität auch die Konferenzdynamik von GPCRs untersuchen können. Die Durchführung von FRED-FCs in Laboren ist jedoch eine Herausforderung und erfordert gute transfizierte Zellen, eine effiziente Markierung und einen perfekt kalibrierten Aufbau. Nur ein FRED-Paar Pro Force ist auch sehr wichtig.Kritische experimentelle Schritte umfassen die Optimierung der Transfektionsoptimierung, die Minimierung des Hintergrunds und die Autofluoreszenz. Darüber hinaus wird die Atoms-Analyse-Pipeline dazu beitragen, die verschiedenen Dynamiken von Präzeptoren in lebenden Zellen zu verstehen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll nützlich sein wird, um den FRED FCS-Ansatz in lebenden Zellexperimenten durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

Dieses Video demonstriert die Technik der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Homo-Oligomerisierung von Proteinen. Fluoreszenzmarkierte Proteine in einer Probe werden bei der Untersuchung der Proteinoligomerisierung mit FFS mit einem Wirkstoff dimerisiert. Während sich die Proteine in das kleine Beobachtungsvolumen hinein- und herausbewegen, wird mit einem konfokalen Mikroskop die Analyse der Helligkeitsschwankungen der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt, um den...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dreifarbigen SmFRET Daten und deren Auswertung mit einem 3D-Ensemble Hidden-Markov-Modell zu erhalten. Mit diesem Ansatz können Wissenschaftler kinetische Informationen aus komplexen Protein Systeme, einschließlich der Kooperativität oder korrelierte Interaktionen extrahieren.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Lernen Sie die zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Analyse von Membranrezeptordynamik in lebenden CHO-Zellen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

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