Name: Umgekehrter genetischer Ansatz zur Identifizierung von Regulatoren der Pigmentierung anhand von Zebrafischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie ein umgekehrter genetischer Ansatz mit Zebrafischen Schlüsselregulatoren der Pigmentierung identifiziert. Diese Methode kombiniert Bildgebung, Durchflusszytometrie und Spektrophotometrie zur Analyse von Melanozytenzahl und Melaningehalt.

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Wir danken der finanziellen Unterstützung des Rates für wissenschaftliche und industrielle Forschung im Rahmen des Projekts MLP2008 und des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für das Projekt GAP165 für die Unterstützung der in diesem Manuskript vorgestellten Arbeit. Wir danken Jeyashri Rengaraju und Chetan Mishra für ihre Hilfe bei den Experimenten.

Die Zebrafisch-Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit der institutionellen Tierethik-Genehmigung (IAEC) des CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indien, durchgeführt (Vorschlag Nr. 45a). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid der Tiere so gering wie möglich zu halten.
1. Injektion von Morpholino in Zebrafischembryonen
<ol><li>Ziehen Sie mit einem Standard-Nadelzieher sehr scharfe und geschlossene Pipetten.</li>
	<li>Füllen Sie die morpholinohaltige Lösung mit einer Mikroladerspitze in die Mikropipetten und führen Sie sie in die Mikroinjektorvorrichtung ein. Ziehen Sie die Schraube fest an, um die Mikropipette zu verriegeln. HINWEIS: Eine Standardisierung der Dosierung von Morpholinos ist erforderlich. Die geeignete Dosierung hat eine Überlebensrate von >70% und einen spezifischen Phänotyp bei 24 hpf.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze der Mikropipette mit einer feinen Pinzette ab und kalibrieren Sie sie11.</li>
	<li>Zur Kalibrierung wird 1 Volumen der Morpholino-Lösung von der Mikropipette in das Kapillarröhrchen injiziert, wobei die Injektionszeit bei 1 s bleibt. Wiederholen Sie dies fünfmal. Ermitteln Sie mit dem Standardvolumen 1 mm = 30 nL das in 5 s injizierte Volumen, indem Sie das Kapillarrohr gegen eine Messskala halten. Berechnen Sie anhand der obigen Informationen die Zeit (in Sekunden), die erforderlich ist, um 1-3 nL pro Injektion12 zu injizieren. HINWEIS: Der Standard, 1 mm = 30 nL, ist spezifisch für die Druckeinstellungen des Mikroinjektors und den Durchmesser der für die Kalibrierung verwendeten Kapillare. Idealerweise muss die Injektion in die Dotter-Zell-Grenzfläche erfolgen, die innerhalb von 15-20 Minuten nach der Befruchtung gebildet wird. Um Mehrfachinjektionen zu ermöglichen, kann die Entwicklung leicht verzögert werden, indem die Embryonen auf einer niedrigeren Temperatur (18 °C) gehalten werden. Dies sollte jedoch auf ein Minimum beschränkt und nicht über 30 Minuten hinaus verlängert werden, da sich eine niedrigere Temperatur auf die Veränderungen der Genexpression auswirkt.</li>
	<li>Montieren Sie die Embryonen auf eine mit Agarose gegossene Petrischale (60 mm). Stapeln Sie die Embryonen fest in den Rippen. Richten Sie sie mit feuerpolierten Glaspipetten in der richtigen Ausrichtung für die Injektion aus.</li>
	<li>Bringen Sie die Mikropipette unter dem Mikroskop mit Manipulatoren näher an den Embryo heran und injizieren Sie sie durch Drücken des Fußschalters in die Dotter-Zell-Schnittstelle.</li>
	<li>Injizieren Sie alle Embryonen auf ähnliche Weise; Sammeln Sie sie in einer Petrischale mit frischem Embryowassermedium und inkubieren Sie sie bei 28 °C.</li>
	<li>Überprüfen Sie die injizierten Embryonen nach 6-8 Stunden. Entfernen Sie alle toten Embryonen, die aufgrund ihrer hohen Opazität identifizierbar sind, und wechseln Sie das Embryowasser mindestens einmal täglich, um eine Infektion zu vermeiden.</li>
</ol>2. Pigmentierungsanalyse
<ol><li>Präparat zur Zählung lateraler Mittellinienmelanophoren in 3 dpf Zebrafischembryonen<ol><li>Behandeln Sie Embryonen mit 0,016% neuromuskulärem Anästhetikum, um sie zu immobilisieren.</li>
		<li>Um die Embryonen für die Bildgebung zu montieren, geben Sie einige Milliliter 1,5-2% Methylcellulose in die Petrischale (60 mm), so dass sie eine dünne Schicht bildet. Nehmen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette heraus und positionieren Sie sie vorsichtig in Methylzellulose, um die weitere Bewegung während der Bildgebung einzuschränken.</li>
		<li>Passen Sie ihre Position für eine optimale laterale (Rückenstreifen, ventraler Streifen, Dotterstreifen und Mittellinienmelanophoren) oder dorsale (Melanophoren auf dem dorsalen Teil des Kopfes) Bildgebung an. Für eine bessere Auflösung benachbarter Melanophoren, Bild bei höherer Vergrößerung (>5x)</li>
	</ol></li>
	<li>Hellfeld-Bildgebung HINWEIS: Die Hellfeld-Bildgebung wird mit einem Stereomikroskop mit 8-10-facher Vergrößerung durchgeführt.<ol><li>Stellen Sie die Petrischale mit den Zebrafischembryonen unter das Mikroskop. Stellen Sie den Fisch mit einem Manipulator so aus, dass alle fünf embryonalen Melanozytenstreifen gleichzeitig sichtbar sind (dorsal, ventral, zwei lateral, Eigelb) (Abbildung 1C). Schnelle Aufnahme von Bildern mit der Erfassungssoftware. Falls sich das Tier wieder bewegt, bevor es abgebildet wird, tauchen Sie es erneut in ein Anästhetikum und fahren Sie mit der Bildgebung fort, sobald es ausreichend immobilisiert ist.</li>
		<li>Wiederholen Sie dies mit allen Fischen und stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich bleibt.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnung des mittleren Grauwerts mit der ImageJ-Software<ol><li>Machen Sie dorsale und laterale Bilder von 2 dpf Zebrafischembryonen.</li>
		<li>Öffnen Sie das Bild, das in ImageJ quantifiziert werden soll, mit dem Werkzeug Öffnen . Verwenden Sie das Freihandformwerkzeug , um den zu analysierenden Bereich zu skizzieren. Gehen Sie zur Option Messungen festlegen und wählen Sie Mittlerer Grauwert | Bereich. Drücken Sie M (oder analysieren | Measure), um den mittleren Grauwert für den ausgewählten Bereich zu berechnen.</li>
		<li>Halten Sie die zu analysierende Fläche konstant und berechnen Sie die mittlere Grauzone für jedes Tier separat.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein Balkendiagramm mit den erfassten Daten (Abbildung 2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Melaningehalts-Assay<ol><li>Verwenden Sie bei 2 dpf eine Pasteur-Pipette aus Glas, um ~ 25 Zebrafischembryonen zu sammeln.</li>
		<li>Führen Sie eine manuelle Dechorionation mit 1-ml-Insulinnadeln durch und geben Sie sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Entsorgen Sie das Embryomedium vorsichtig und fügen Sie 1 ml eiskalten Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) mit Proteasehemmer-Cocktail hinzu und bereiten Sie Proteinlysate durch Ultraschall vor.</li>
		<li>Die Lysate werden in 1 ml 1 N NaOH gelöst und die Proben bei 100 °C für 50 min in einem Wasserbad inkubiert. Wirbeln Sie es intermittierend, um die Lysate vollständig zu homogenisieren.</li>
		<li>Nehmen Sie Absorptionsmessungen der Proben bei 490 nm mit einem Spektralphotometer vor.</li>
		<li>Berechnen Sie den Melaningehalt, indem Sie die Probenabsorption mit einer Standardkurve bekannter Konzentrationen von synthetischem Melanin vergleichen (Abbildung 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Melanophor-Zählung
HINWEIS: Die Fluoreszenzanalyse in transgenen Zebrafischembryonen kann mit zwei Methoden durchgeführt werden: 1) Zählung von GFP-positiven Zellen; 2) Messung der Fluoreszenzintensität.
<ol><li>Vorbereitung für die FACS-basierte Zählung von GFP-positiven Zellen in frühen Zebrafischembryonen<ol><li>Sammeln Sie 200-250 ftyrp:GFP-Embryonen und waschen Sie sie in einem Sieb mit klarem Embryowasser. Verarbeiten Sie als Negativkontrolle GFP-negative, stadienangepasste Wildtyp-Embryonen (Assam-Wildtyp)12.</li>
		<li>Je nach interessierendem Stadium werden die Embryonen in eine Petrischale mit 0,6 mg/ml Pronase überführt. Nach 5-10 Minuten werden die dechorionierten Embryonen mit einer Pasteurpipette in eine frische Petrischale mit klarem Embryowasser überführt. Sammeln Sie mit einer Pasteurpipette aus Glas ~ 100 Embryonen und übertragen Sie sie in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Entsorgen Sie das Medium vorsichtig und fügen Sie 200 μl eiskalte Ringer-Lösung hinzu (Deyolking-Puffer). Halten Sie das Röhrchen auf Eis und pipettieren Sie den Inhalt ~20 Mal auf und ab, bis sich das Eigelb aufgelöst hat. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100 × g für 1 min in einer Tischzentrifuge bei 4 °C. Erneut zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen.</li>
		<li>Mit einer 1-ml-Pipette werden die dejolkierten Embryonen in eine Petrischale mit 10 ml Trypsinlösung (Zelldissoziationspuffer) überführt. Führen Sie es in mehreren Petrischalen durch, um eine Überfüllung der Embryonen und eine ineffiziente Trypsinisierung zu vermeiden. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette und mischen Sie die Lösung, die die Embryokörper enthält, ein- oder zweimal, um die Aggregation zu verringern.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Petrischalen bei Raumtemperatur für 15 min (<24 hpf Embryonen) oder 30 min (24-30 hpf Embryonen). Aspirieren und dosieren Sie die Suspension gelegentlich mit einer 1-ml-Pipette, um den Zerfall der Zellen zu unterstützen.</li>
		<li>Initialisieren Sie während der Inkubationszeit das Durchflusszytometer für die Zellzählung.</li>
		<li>Platzieren Sie ein 70-μm-Zellsieb über einem konischen 50-ml-Röhrchen und führen Sie die trypsinisierte Suspension durch das Sieb, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Waschen Sie die Petrischalen einige Male mit der gleichen Suspension, um an der Oberfläche haftende Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Die Proben werden bei 450 × g bei 4 °C 5 min lang in einem schwenkenden Schaufelrotor geschleudert.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Nochmals bei 450 × g, 4 °C 5 min drehen und den Überstand wegwerfen.</li>
		<li>Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in PBS + 5% fötalem Rinderserum und halten Sie es bis zum FACS-Lauf auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des Durchflusszytometers<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und leiten Sie die Inbetriebnahme ein. HINWEIS: Leeren Sie vor dem Einschalten der Maschine den Abfallbehälter und füllen Sie den Mantelflüssigkeitstank.</li>
		<li>Normalisieren Sie den Durchfluss des Stroms für eine 70-μm-Düse (oder 85-μm-Düse). Lassen Sie es 10-15 Minuten ungestört, wenn es instabil ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Zählung fluoreszenzmarkierter Zellen mit einem Durchflusszytometer<ol><li>Initialisieren Sie einen neuen Experimentordner und erstellen Sie ein Streudiagramm der Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Seitenstreuung und ein Histogramm der Intensität von Fluoresceinisothiocyanat (FITC).</li>
		<li>Laden Sie zuerst die Wildtyp-Zellen, um die Vorwärts- und Seitenstreugatter (um Dubletten und Trümmer auszuschließen) und den FITC-Schwellenwert festzulegen.</li>
		<li>Nachdem die Gates gesetzt sind, entnehmen Sie die Probe und laden Sie die Zellen, die aus Tg(ftyrp1:GFP)-Embryonen isoliert wurden, um Melanozyten zu zählen. HINWEIS: Da ftyrp1:GFP hier spezifisch reife Melanozyten markiert, entspricht die Anzahl der GFP-positiven Zellen unter dem FITC-Gate der Anzahl der Melanozyten.</li>
		<li>Wiederholen Sie den obigen Schritt mit Morpholino-injizierten Proben, um die Anzahl der Melanozyten mit der Kontrolle abzuschätzen und zu vergleichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messung der Fluoreszenzintensität in Zebrafischembryonen<ol><li>Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas 100-120 Embryonen und geben Sie sie in eine Petrischale mit klarem Embryowasser.</li>
		<li>Übertragen Sie die Embryonen bei ~10-12 hpf auf 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff, um die Pigmentierung zu hemmen.</li>
		<li>Führen Sie eine manuelle Dechorionation mit Insulinnadeln durch, um Embryonen <48 hpf zu bilden.</li>
		<li>Um Embryonen zu immobilisieren, behandeln Sie sie mit 0,016% Tricain.</li>
		<li>Um Embryonen für die Bildgebung zu montieren, geben Sie einige ml 1,5-2% Methylcellulose in die Petrischale (60 mm), so dass sie eine dünne Schicht bildet. Fügen Sie die Embryonen zu Methylcellulose hinzu, um jede weitere Bewegung während der Bildgebung einzuschränken. Stellen Sie die Petrischale mit den Proben unter das Mikroskop. Stellen Sie das Tier mit einer Pipettenspitze in die gewünschte Ausrichtung ein.</li>
		<li>Erfassen Sie Bilder mit der Erfassungssoftware. Bei Embryonen <24 hpf wird der gesamte Embryo auf einmal unter 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Erfassen Sie für >24 HPF-Stufen mehrere Scanfelder und setzen Sie sie anschließend zusammen (nähen).</li>
		<li>Wiederholen Sie dies mit allen Fischen und stellen Sie sicher, dass die Einstellung für den Erwerb während des gesamten Experiments konstant bleibt.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizierung<ol><li>Analysieren Sie das Bild weiter mit der ImageJ-Software.</li>
		<li>Öffnen Sie das Bild, das in ImageJ quantifiziert werden soll, mit dem Werkzeug Öffnen .</li>
		<li>Verwenden Sie das Freihandformwerkzeug , um den zu analysierenden Bereich zu skizzieren (Abbildung 3E).</li>
		<li>Drücken Sie M (oder analysieren | Messen), um eine ausgewählte Flächenintensitätsmessung zu erfassen.</li>
		<li>Halten Sie die zu analysierende Fläche konstant und berechnen Sie die mittlere Intensität pro Fläche für jedes Tier separat.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Der Pigmentierungsphänotyp äußert sich häufig in Veränderungen des Melaningehalts oder der Anzahl der pigmenttragenden Melanozyten. Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt die Dissektion dieser Dichotomie und erlaubt sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Beurteilung des Melaningehalts und der Anzahl der Melanophoren pro Embryo, unabhängig vom Melaningehalt. Die hohe Fruchtbarkeit des Zebrafisches, die sichtbare Natur der pigmentierten Melanozyten und der Mangel an Melanosomentransfer ermöglichen die Analys...

Während sich die Verwendung von Melanin für den Lichtschutz im Tierreich mehrmals weiterentwickelt hat, haben Wirbeltiere den Prozess scheinbar perfektioniert. Spezielle pigmentproduzierende Zellen mit einer ausgeklügelten Maschinerie zur Synthese und Eindämmung von Melanin werden vom Fisch bis zum Menschen konserviert1. Das Ergebnis der Pigmentierung ist jedoch dramatisch unterschiedlich, reicht von der Farbe bis zur Wahrnehmung, und zeigt sich als lebendige Muster auf den Integumenten, der Haut und den Haaren2. Trotz der Vielfalt ist das Repertoire an Genen, die an der Pigmentierungsreaktion beteiligt sind, auffallend konserviert. Die Kernkomponenten der Melanin-synthetisierenden Maschinerie, wie die wichtigsten Melanin-synthetisierenden Enzyme, die Komponenten der Melanosomen und die vorgeschaltete Konnektivität zum Signalweg, bleiben im Wesentlichen über alle Organismen hinweg identisch. Subtile genetische Unterschiede führen zu dramatischen Veränderungen in den Pigmentierungsmustern, die bei Spezies3 beobachtet werden. Daher bietet ein umgekehrter genetischer Ansatz in einem niederen Wirbeltierorganismus, dem Zebrafisch (Danio rerio), eine hervorragende Möglichkeit, die Beteiligung von Genen an der Wiedergabe des pigmentierten Zustands zu entschlüsseln4.
Zebrafischembryonen entwickeln sich innerhalb einer Zeitspanne von ~24 Stunden nach der Befruchtung (hpf)5 von einer einzelligen befruchteten Zygote zu einer Larve. Auffallend ist, dass es sich bei den Melanozyten-äquivalenten Zellen – den Melanophoren – um große Zellen handelt, die in der Dermis vorhanden sind und durch den dunklen Melaningehalt auffallen6. Diese von der Neuralleiste abgeleiteten Zellen strahlen ~11 hpf aus und beginnen, ~24 hpf 6,7 zu pigmentieren. Konservierte Genexpressionsmodule haben die Identifizierung von Schlüsselfaktoren ermöglicht, die die Funktionen von Melanozyten orchestrieren, und zur Entwicklung transgener fluoreszierender Reporterlinien Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) und Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 geführt, die selektive Stadien der Melanozytenentwicklung markieren. Die Verwendung dieser transgenen Fischlinien ermöglicht die Abfrage der Zellbiologie von Melanozyten auf organismischer Ebene im Gewebekontext mit geeigneten Hinweisen entsprechend den Entwicklungszeitplänen. Diese Reporter ergänzen die pigmentbasierte Quantifizierung von Melanozyten und ermöglichen eine eindeutige Beurteilung der Melanozytenzahl unabhängig vom Melaningehalt.
Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Entschlüsselung der Biologie von Melanozyten durch die Bewertung von zwei kritischen Parametern, nämlich dem Melaningehalt und der Melanozytenzahl. Während ersteres ein übliches funktionelles Auslesen ist, das von einer Hypopigmentierungsreaktion ausgeht, ist letzteres mit einer Verringerung der Spezifikation oder des Überlebens von Melanozyten verbunden und wird häufig mit genetischen oder erworbenen Depigmentierungsbedingungen in Verbindung gebracht. Die Gesamtstrategie dieses umgekehrten genetischen Screenings besteht darin, ausgewählte Gene mit einem Morpholino zum Schweigen zu bringen und die Melanozyten-spezifischen Ergebnisse zu untersuchen. Der Melaningehalt wird mittels bildbasierter Quantifizierung der mittleren Grauwerte analysiert und anschließend mit einem Melaningehaltstest bestätigt. Die Anzahl der Melanozyten in verschiedenen Reifungsstadien wird mittels bildbasierter Quantifizierung analysiert und mittels FACS-Analyse weiter bestätigt. Hier wird das Screening-Protokoll anhand von zwei Kandidatengenen demonstriert, nämlich der Carboanhydrase 14, die an der Melanogenese beteiligt ist, und einer Histonvariante H2AFZ.2, die an der Spezifizierung von Melanozyten aus der Neuralleistenvorläuferpopulation beteiligt ist. Während ersteres den Melaningehalt und nicht die Melanozytenzahl verändert, verändert letzteres die Anzahl der spezifizierten Melanozyten und folglich den Melaningehalt im Embryo. Insgesamt bietet diese Methode ein detailliertes Protokoll, um die Rolle eines Kandidatengens bei der Pigmentierung zu identifizieren und seine Rolle bei der Kontrolle der Melanozytenzahl im Vergleich zum Melaningehalt zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td>Zur Herstellung von MO-Lösung</td></tr><tr><td>2 mL Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>Für Waschschritte im FACS-Protokoll</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9539-500G</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td>Für die Zellsortierung</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Sieb</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td>FACS Protokoll</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>zur Immobilisierung ZF für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Für Kältelysepuffer</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>BD-Biosciences</td><td>342065</td><td>FACS-Protokoll</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>FACS-Protokoll</td></tr><tr><td>Graphpad-Prismen-Software</td><td>Graphstats Technologies</td><td>NA</td><td>Für die Datendarstellung</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health</td><td>NA</td><td>Für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>Insulinspritzen (1 mL)</td><td>DispoVan</td><td>NA</td><td>Für die manuelle Dechorionierung</td></tr><tr><td>Melanin, synthetisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8631</td><td>Für Melaningehalt-Assay</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027-250G</td><td>zur Immobilisierung ZF für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-tools</td><td>NA</td><td>Für Knock-down-Experimente</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>zur Hemmung der Melaninbildung</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Konisch Steril Polypropylen Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>FACS-Protokoll</td></tr><tr><td>Petrischale (60 mm)</td><td>Tarsons</td><td>460090</td><td>Für Embryoplatten</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>Für Kältelysepuffer</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TL1099-500mL</td><td>Zum Waschen von Zellen</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53702</td><td>Für die Dechorionierung</td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Für Kältelysepuffer</td></tr><tr><td>Schleuse Flüssigkeit</td><td>BD FACSFlowTM</td><td>342003</td><td>FACS-Protokoll</td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td>Kältelysepuffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>Für Kältelysepuffer</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>1677119</td><td>Für die Trypsinisierung</td></tr></tbody></table>

umgekehrter genetischer ansatz zur identifizierung von regulatoren der pigmentierung anhand von zebrafischen

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanozyten sind spezialisierte Neuralleistenzellen, die in der epidermalen Haut vorhanden sind. Diese Zellen synthetisieren Melaninpigmente, die das Genom vor schädlichen ultravioletten Strahlen schützen. Störungen der Melanozytenfunktion führen zu Pigmentstörungen wie Piebaldismus, Albinismus, Vitiligo, Melasma und Melanom. Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modellsystem, um die Funktionen von Melanozyten zu verstehen. Das Vorhandensein auffälliger pigmentierter Melanozyten, die einfache genetische Manipulation und die Verfügbarkeit transgener fluoreszierender Linien erleichtern die Untersuchung der Pigmentierung. In dieser Studie werden Wildtyp- und transgene Zebrafischlinien verwendet, die die Expression von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP) unter mitfa - und tyrp1-Promotoren steuern, die verschiedene Stadien von Melanozyten markieren. 
Morpholino-basiertes Silencing von Kandidatengenen wird erreicht, um das phänotypische Ergebnis der Larvenpigmentierung zu bewerten und ist für das Screening auf Pigmentierungsregulatoren anwendbar. Dieses Protokoll demonstriert die Methode von der Mikroinjektion über die Bildgebung bis hin zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Dissektion von Phänotypen unter Verwendung von zwei Kandidatengenen, Carboanhydrase 14 (Ca14) und einer Histonvariante (H2afv), um das Pigmentierungsergebnis umfassend zu bewerten. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll die Trennung von Kandidatengenen in Melanozytenspezifizierer und -differenzierer, die die Melanozytenzahl bzw. den Melaningehalt pro Zelle selektiv verändern.

Der in Abbildung 1 beschriebene Arbeitsablauf wurde verwendet, um eine morpholinobasierte genetische Störung im Zebrafisch-Einzellstadium durchzuführen. Die Pigmentanalyse wurde mit verschiedenen Methoden durchgeführt, wie unten erwähnt. Um die repräsentativen Ergebnisse zu veranschaulichen, wurden standardisierte Volumina von Antisense-Morpholino-Genen, die auf h2afv und ca14 abzielen, in das Eigelb- oder Einzellstadium des Zebrafischembryos injiziert. Die anfängliche Phän...

Regulatoren der Melanozytenfunktionen bestimmen sichtbare Unterschiede im Pigmentierungsergebnis. Die Entschlüsselung der molekularen Funktion des Kandidaten-Pigmentierungsgens stellt eine Herausforderung dar. Hier demonstrieren wir die Verwendung eines Zebrafisch-Modellsystems, um Kandidaten zu identifizieren und sie in Regulatoren des Melaningehalts und der Melanozytenzahl zu klassifizieren.

Umgekehrter genetischer Ansatz zur Identifizierung von Regulatoren der Pigmentierung anhand von Zebrafischen

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Dieses Protokoll ist eine Verschmelzung verschiedener Techniken, die es den Forschern ermöglichen würden, die Rolle des Kandidatengens in der Melanozytenbiologie abzugrenzen. Es ist ein ganzheitlicher Ansatz, um eine logische Schlussfolgerung zu erzielen. Durch die Kombination verschiedener Methoden können Störfaktoren vermieden werden und es kann den Forschern helfen, ein substanzielles Ergebnis zu erzielen.Um mit der Analyse zu beginnen, immobilisieren Sie die 48 HPF-Embryonen mit 0,016% Tricain. Montieren Sie die Embryonen mit einigen Millilitern 1,5 bis 2% Methylcellulose in einer Petrischale. Nehmen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette und legen Sie sie in Methylzellulose, um die Bewegung während der Bildgebung einzuschränken.Für eine optimale laterale oder dorsale Bildgebung passen Sie ihre Position mit einer mehr als 5-fachen Vergrößerung an. Stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Stellen Sie den Fisch mit einem Manipulator so ein, dass alle fünf embryonalen Melanozytenstreifen gleichzeitig sichtbar sind.Nehmen Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware auf. Wenn der Fisch erwacht, legen Sie ihn in Tricainwasser, bis er sich stabilisiert hat. Öffnen Sie mit dem Open-Tool in der ImageJ-Software das Bild, das quantifiziert werden soll.Wählen Sie das Freihandformwerkzeug aus, um den zu analysierenden Bereich zu skizzieren. Wählen Sie die Option "Maße einstellen", klicken Sie auf den mittleren Grauwert und dann auf die Fläche. Um den mittleren Grauwert für den ausgewählten Bereich zu berechnen, klicken Sie auf M oder gehen Sie zu Analysieren und wählen Sie Messen.Übertragen Sie die Embryonen je nach interessierendem Stadium in eine Petrischale, die 0,6 Milligramm pro Milliliter Pronase enthält. Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen mit einer Pasteurpipette nach fünf bis 10 Minuten in eine Petrischale mit klarem Embryowasser. Mit einer Pasteurpipette aus Glas werden etwa 100 Embryonen gesammelt und in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Entsorgen Sie das Medium und fügen Sie 200 Mikroliter eiskalte Ringers-Lösung hinzu. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und mischen Sie den Inhalt etwa 20 Mal mit einer Pipette, um das Joch aufzulösen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen zweimal eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 100 G und entsorgen Sie den Überstand.Übertragen Sie die mit einem Milliliter gefüllten Embryonen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in eine Petrischale mit 10 Millilitern Trypsinlösung. Mischen Sie die Lösung ein- oder zweimal mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Aggregation zu verringern. Führen Sie die trypsinisierte Suspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist, um eine einzellige Suspension aufzufangen.Waschen Sie die Petrischalen mit der trypsinisierten Suspension, um die anhaftenden Zellen von der Oberfläche zu entfernen. Um die fluoreszenzmarkierten Zellen mit einem Durchflusszytometer zu zählen, zeichnen Sie nach dem Erstellen eines neuen Experimentordners ein Vorwärts- und Seitenstreudiagramm. Erstellen Sie ein Histogramm für die Intensität von Fluoresceinisothiocyanat.Laden Sie zuerst die Wildtypzellen, um die Vorwärts- und Seitenstreugates und den FITC-Schwellenwert festzulegen. Anschließend werden die aus transgenen FTYRP-GFP-Embryonen isolierten Zellen geladen, um die Melanozyten zu zählen. Montieren Sie die Embryonen in 1,5 bis 2% Methylcellulose in einer Petrischale.Legen Sie es unter das Mikroskop und stellen Sie es mit einer Pipettenspitze in die gewünschte Ausrichtung ein. Erfassen Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware. Bei Embryonen mit weniger als 24 HPF wird mit 10-facher Vergrößerung das gesamte Bild aufgenommen, während bei Embryonen mit mehr als 24 HPF mehrere Scanfelder erfasst und anschließend zusammengesetzt werden.Nach Durchführung des Assays zeigte die Brightfield-Bildgebung nach 48 Stunden das Vorhandensein aller fünf pigmentierten Melanophorstreifen. Im 48-HPF-Stadium wurde die Anzahl der lateralen Melanophoren berechnet und es wurde festgestellt, dass die H2AFV-Morphanten der Histonvariante im Vergleich zur Kontrolle eine reduzierte Anzahl von Melanophoren aufwiesen. Der mittlere Grauwert wurde für CA14- und h2afv-Morphanten gemessen, was zeigte, dass die Werte für die Varianten höher waren als für die Kontrollmorphanten.Unter Verwendung einer auf Natriumhydroxid basierenden spektrophotometrischen Absorptionsmethode wurde der Melaningehalt quantifiziert, wobei die CA14-Morphanten einen geringeren Gehalt aufwiesen als die Kontrollmorphanten. Die Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die morpholinobasierte Veränderung für verschiedene Stadien der Melanophorenentwicklung von Zebrafischen zu bewerten. Die Anzahl der Melanophoren in CA14- und h2afv-Morphanten wurde mittels FACS analysiert.Es wurde beobachtet, dass die Anzahl der Melanophoren in CA14 unverändert blieb, während sie in h2afv im Vergleich zum Kontrollmorphanten signifikant reduziert waren. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Fläche wurde ebenfalls berechnet, was zeigt, dass die h2afv-Morphanten eine signifikante Abnahme des Wertes im Vergleich zu den Kontrollmorphanten aufweisen. Stellen Sie beim Anpassen des Fisches vor der Bildgebung sicher, dass Sie alle fünf Melanophorstreifen visualisieren können.Sie müssen den Fisch ein wenig neigen, um zwischen den beiden Seitenstreifen zu unterscheiden. Nachdem wir die Rolle eines Kandidatengens bei der Entwicklung von Melanozyten festgestellt haben, können wir das Gen mit Hilfe der CRISPR-Technologie gewebespezifisch eliminieren. Das wird ein gezielterer Ansatz sein.

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