Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Diese relativ einfache Methode kann bei der Forschung helfen, die sich auf Motoneuronen und neuromuskuläre Verbindungen in Gesundheit und Krankheit konzentriert. Dieses Protokoll verwendet Standard-Stammzelltechnologie und kommerziell erhältliche mikrofluidische Geräte, was die Reproduzierbarkeit erhöht. Die Trennung von Motoneuronen und Muskelzellen ist ein frühes Phänomen bei mehreren neuromuskulären Erkrankungen.

Ein einfaches humanisiertes Modell könnte helfen, Strategien zu entwickeln, um diesem Phänomen entgegenzuwirken. Wir verwenden dieses Modell, um die Motoneuronstörung, die amyotrophe Lateralsklerose, zu untersuchen, dieses Modell kann jedoch auch für andere Erkrankungen verwendet werden, bei denen die motorische Einheit wesentlich ist. Beginnen Sie mit dem Transfer des Geräts mit der Pinzette vom Versandbehälter in die Petrischale mit 10 Millilitern 70% bis 100% Ethanol zur Sterilisation für 10 Sekunden.

Übertragen Sie das Gerät mit einer Pinzette auf ein Blatt Papier, um es in der Laminar Flow für ca. 30 Minuten an der Luft zu trocknen. Sobald ein Gerät getrocknet ist, verwenden Sie eine Pinzette, um jedes Gerät zu einer einzelnen 10-Zentimeter-Petrischale zu bewegen. Um das Gerät mit Poly-L-Ornithin oder PLO zu beschichten, fügen Sie 100 Mikroliter PLO-Lösung in den oberen Brunnen hinzu und beobachten Sie, wie die Flüssigkeit vom oberen Brunnen durch den Kanal zum unteren Brunnen gelangt.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter PLO-Lösung in den bodenigen Brunnen hinzu und wiederholen Sie ihn auf der anderen Seite der Mikrorillen. Abschließend fügen Sie 100 Mikroliter PLO-Lösung auf einer Seite hinzu, um einen Volumengradienten zwischen den beiden verspiegelten Seiten des Geräts zu erzeugen, um die Mikrorillen zu beschichten. Drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.

Nach drei Stunden waschen Sie das Gerät dreimal für fünf Minuten mit DPBS. Beschichten Sie das Gerät mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin und neurobasalem Medium, indem Sie das Verfahren ähnlich der PLO-Beschichtung befolgen. Inkubieren Sie das Gerät über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Verwenden Sie am nächsten Tag eine 200-Mikroliter-Pipette und positionieren Sie die Spitze im Brunnen gegenüber der Kanalöffnung, um die Laminin-Beschichtung von den Vertiefungen zu entfernen. Nachdem Sie DPBS zu allen Vertiefungen hinzugefügt haben, lassen Sie die Geräte mit DPBS in der Laminar Flow bei Raumtemperatur für die Zellaussaat. Schneiden Sie die SCM-Blätter auf die Größe des Geräts ab, während Sie auf jeder Seite einige Millimeter belassen.

Nach dem Sterilisieren der Geräte und SCM-Platten in einer Petrischale mit 10 Millilitern 70% bis 100% Ethanol für 10 Sekunden werden die Geräte mit einer Pinzette auf eine Sechs-Well-Platte und die SCM-Platten auf eine 10-Zentimeter-Petrischale zur Lufttrocknung in der Laminar Flow übertragen. Positionieren Sie das Gerät auf der Kante, damit alle Seiten etwa 30 Minuten trocknen können. Beschichten Sie die Geräte, indem Sie jedem Gerät in der Sechs-Well-Platte einen Milliliter PLO-Lösung pro Vertiefung hinzufügen.

Stellen Sie sicher, dass das Gerät auf der Oberseite der PLO-Lösung schwebt, wobei der Kanal und die Mikronutseite nach unten in die Flüssigkeit zeigen. Beschichten Sie die SCM-Platten, indem Sie 10 Milliliter PLO-Lösung in die 10-Zentimeter-Petrischale geben, und drücken Sie die SCM-Blätter mit der Pinzette in die Flüssigkeit. Inkubieren Sie Geräte und SCM-Platten drei Stunden lang, wie zuvor gezeigt.

Nach drei Stunden waschen Sie die Geräte und SCM-Blätter zweimal für fünf Minuten mit DPBS, gefolgt von einer weiteren Wäsche für fünf Minuten mit sterilem Wasser. Dann übertragen Sie jedes SCM-Blatt in eine einzelne 10-Zentimeter-Petrischale zur Lufttrocknung. Während Sie unter einem Mikroskop in der Laminar Flow arbeiten, verwenden Sie eine Pinzette, um das Silikongerät mit dem Kanal und der Mikronutseite nach unten in einem Winkel von 90 Grad auf der SCM-Platte zu montieren, um sicherzustellen, dass alle Seiten ausgerichtet sind.

Drücken Sie leicht auf das Gerät, um sicherzustellen, dass nicht nur die äußeren Kanten, sondern auch die Vertiefungen, Kanäle und Mikrorillen abgedichtet werden. Um das Gerät mit Laminin zu beschichten, fügen Sie im Laminar Flow und unter dem Mikroskop 100 Mikroliter à 20 Mikrogramm pro Milliliter Lamininlösung in den oberen Brunnen mit einer 200 Mikroliter Pipette hinzu. Beobachten Sie, wie die Flüssigkeit vom oberen Brunnen durch den Kanal zum unteren Brunnen gelangt, ohne dass das Bohrloch und der Kanal austreten.

Anschließend fügen Sie 100 Mikroliter Lamininlösung in den Bodenschacht hinzu, wiederholen Sie ihn auf der anderen Seite der Mikrorillen und beenden Sie mit zusätzlichen 100 Mikrolitern Laminin auf einer Seite, um einen Volumengradienten zwischen den beiden verspiegelten Seiten des Geräts zu erzeugen, um die Mikrorillen zu beschichten, und inkubieren Sie das Gerät dann über Nacht. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtung von den Vertiefungen mit der 200-Mikroliter-Pipette, indem Sie die Spitze in der Vertiefung gegenüber der Kanalöffnung positionieren, nachdem Sie DPBS zu allen Vertiefungen hinzugefügt haben, lassen Sie die Geräte mit DPBS in der Laminar Flow bei Raumtemperatur für die Zellaussaat. Um die neuronalen Vorläuferzellen oder NPCs im mikrofluidischen Gerät zu plattieren, entfernen Sie DPBS aus zwei Vertiefungen auf einer Seite der Mikrorillen im Gerät mit einer 200-Mikroliter-Pipette.

Um insgesamt 250.000 NPCs und 60 bis 100 Mikroliter des Tages 10 Motoneuronmedium pro Gerät zu säen, in der oberen rechten Vertiefung, säen Sie die Hälfte der Zellsuspension in der Nähe der Kanalöffnung in einem Winkel von 45 Grad. Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die verbleibende Hälfte der Zellsuspension in die untere Vertiefung geben. Verwenden Sie einen Stift, um die ausgesäte Seite als NPC oder gleichwertig zu markieren, um das Gerät ohne Mikroskop leicht zu orientieren, und inkubieren Sie fünf Minuten lang für die Zellbefestigung.

Als nächstes füllen Sie langsam die beiden NPC-seeded Wells mit einem zusätzlichen Tag 10 Motoneuronmedium auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikroliter pro Vertiefung. Entfernen Sie DPBS mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus den beiden Vertiefungen auf der anderen Seite der Mikrorillen gegenüber den frisch gesäten NPCs. Fügen Sie 200 Mikroliter des Tages 10 Motoneuron-Medien pro Vertiefung zu den ungesetzten Vertiefungen hinzu.

Fügen Sie dann sechs Milliliter DPBS pro 10-Zentimeter-Schüssel um das Gerät herum hinzu, um die Verdunstung des Mediums während der Inkubation zu verhindern. Um das Medium zu wechseln, entfernen Sie langsam Medien in beiden Vertiefungen mit NPCs, indem Sie die 200 Mikroliter Pipettenspitze am unteren Rand der Vertiefungswand gegenüber der Kanalöffnung positionieren. Um zu verhindern, dass ein starker Mittelfluss die Zellen auf dem Kanal schädigt, fügen Sie langsam 50 bis 100 Mikroliter frisches Motoneuronmedium zu jeder Vertiefung hinzu, indem Sie kontinuierlich zwischen dem oberen und unteren Brunnen wechseln.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis jede Vertiefung 200 Mikroliter Medium enthält. Entfernen Sie am Tag 17 der Motoneurondifferenzierung das Motoneuronmedium auf der ungesetzten Seite der Mikrorillen im Gerät mit einer 200-Mikroliter-Pipette und waschen Sie die Vertiefungen mit DPBS. Säen Sie insgesamt 200.000 menschliche primäre Mesoangioblasten oder MABs in 60 bis 100 Mikroliter Wachstumsmedium pro Gerät, indem Sie die Hälfte der Zellsuspension in der oberen Vertiefung säen.

Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die verbleibende Hälfte der Zellsuspension in den Bodenbohrloch säen, wie zuvor für die Beschichtung von NPCs gezeigt. Füllen Sie dann die beiden frisch mit MAB bepflanzten Vertiefungen mit einem zusätzlichen Wachstumsmedium auf und inkubieren Sie erneut wie gezeigt.

Um die Chemo-Taktik und den volumetrischen Gradienten am 21. Tag der Motoneurondifferenzierung zu initiieren, fügen Sie dem Myotube-Kompartiment 200 Mikroliter pro Vertiefung des neuronenneuronbasalen Mediums, das Wachstumsfaktoren enthält, hinzu und fügen Sie dann 100 Mikroliter pro Vertiefung des Motoneuron-Basalmediums ohne Wachstumsfaktoren zum Motoneuronkompartiment hinzu. Es ist wichtig, das Differenzierungspotenzial der Zelllinien zu bewerten, bevor sie in mikrofluidischen Geräten kokulturiert werden. Der Fusionsindex von MABs wurde bestimmt, und etwa 8% wurden als ausreichend für die Kokultur geschätzt.

Die erzeugten Motoneuronkulturen waren zu 85 bis 95% positiv für Motoneuronmarker. Zur Charakterisierung und Quantifizierung der Menge an neuromuskulären Verbindungen oder NMJs wurde die Anzahl der Kolokalisationen zwischen dem Motoneuron und den präsynaptischen Markern Neurofilament Heavy Chain und Synaptophysin und postsynaptischer Acetylenrezeptormarker alpha Bungarotoxin durch jeden Krankheitsstapel gezählt und an einer Reihe von myosinlastigen, mit Myotuben markierten Myotuben im Z-Stack normalisiert. Die NMJs erschienen als Single-Contact-Point-NMJs, bei denen der Neurit an einem Interaktionspunkt einen Cluster eines subtilen Cholinrezeptors berührte.

Oder als NMJs mit mehreren Kontaktpunkten, bei denen sich ein Neurit auffächerte und über eine größere Oberfläche mit dem subtilen Cholinrezeptorcluster interagierte. Die Quantifizierung des Prozentsatzes der von Motoneuronen innovierten Myotubes zeigte, dass nicht alle Myotubes NMJs enthielten. Bei der Aktivierung des Motoneurons mit Kaliumchlorid wurde ein Kalziumeintrag in die Fluo-4-markierten Myotubes beobachtet, was eine funktionelle Verbindung durch den Motoneuronneuriten im Myotube bestätigte, die Zugabe von NMJ-Blocker d-Tubocurarin oder DTC zum Myotube-Kompartiment führte zu einer Hemmung des Kalziumeintrags.

Um mit diesem Modell den größten Erfolg zu haben, ist es unglaublich wichtig, eine Zelllinienqualitätsprüfung durchzuführen und die Bildung von Luftblasen in den Kanälen des Geräts zu vermeiden. Die Kombination der neuromuskulären Verbindung in einer Schale mit anderen IPC-Direktzelltypen ahmt die In-vitro-Situation noch besser nach, dies ermöglicht es auch, die Rolle dieser Zelltypen zu untersuchen.