Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Diese Methode kann helfen, eine der Schlüsselfragen im reproduktiven Bereich zu beantworten, nämlich wie und wann genetisch regulierte Prozesse die Größe der Eierstockreserve beeinflussen, von der wir wissen, dass sie sich auf Weibchen auswirkt, die Langlebigkeit der Fortpflanzung Dieses Protokoll kann für groß angelegte Studien mit den gleichen Techniken für intakte Eierstöcke aus verschiedenen Entwicklungsstadien übernommen werden. Es generiert herstellbare Daten, indem es eine effiziente Quantifizierung von Keimzellen ermöglicht. Diese Methode, die auf genetisch unterschiedliche Tiere derselben Art angewendet wird, kann einen Einblick in die genetischen Faktoren geben, die direkt die Entwicklung von Keimzellen und Eierstöcken und andere Entwicklungsorgane betreffen.

Nathaniel Boechat, ein Forschungspraktikant aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren Um mit der Fülle-Schrittstelle zu beginnen und die betäubte pubertäre weibliche Maus auf dem Rücken zu sichern, indem er alle Beine sanft durch die Pfotenpolster in einer entspannten Position auf ein Brett pinnt. Um die Brusthöhle der Maus zu öffnen, schneiden Sie vorsichtig die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins direkt unter dem Schulterblatt, vermeiden Sie es, die Lunge zu punktieren, greifen Sie die Haut oder die Rippenklappen mit der Pinzette und stecken Sie die Klappen fest, um die inneren Organe freizulegen, verwenden Sie eine Dissektionsschere, um den rechten Vorhof des Herzens zu schneiden und Blut aus dem System freizusetzen. Führen Sie dann durch Halten des Herzens mit einer Pinzette eine Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und pumpen Sie 10 Milliliter PBS mit einem sanften und konstanten Druck.

Wenn die Gewebe wie die Lebernieren und der Fortpflanzungstrakt von rosa nach weiß werden, ersetzen Sie das PBS durch frisch hergestelltes 1% Paraformaldehyd oder PFA und setzen die Perfusion mit etwa 10 Millilitern PFA fort. Als nächstes lokalisieren Sie das Fettpolster mit den Eierstöcken unterhalb der Niere und sezieren Sie vorsichtig den gesamten Fortpflanzungstrakt einschließlich der Fettpad-Eierstöcke und Uterushörner, um es in eine Durchstechflasche mit 4% PFA zu legen. Fixieren Sie die Eierstöcke bei Raumtemperatur für 16 bis 24 Stunden, bevor Sie die 4% PFA durch 70% Ethanol ersetzen.

Am Tag der Färbung schneiden Sie die Eierstöcke ab, bevor Sie mit der Immunfärbung fortfahren. Am ersten Tag des Immunfärbeprotokolls pipettierte ein Milliliter PBS pro Vertiefung in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer sauberen 24-Well-Platte. Schneiden Sie die Spitze einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab, um eine breite Öffnung zu machen, und verwenden Sie die breite Spitze, um die pubertären Eierstöcke vorsichtig von Fläschchen mit 70% Ethanol in die Brunnen zu übertragen, dann ersetzen Sie PBS im Bohrloch durch frische 0,8 Milliliter PBS Am nächsten Tag aspirieren Sie PBS aus den Bohrlöchern, um es durch 0,8 Milliliter des Permeationspuffers pro Vertiefung zu ersetzen.

Nach dem Inkubieren der Platten auf dem Shaker bei Raumtemperatur für vier Stunden ersetzen Sie den Permeationspuffer durch Blockpuffer Am dritten Tag bereiten Sie die primären Antikörper durch Verdünnung im Blockpuffer vor. Um die Eizellen zu visualisieren, inkubieren die pränatalen und präpubertären Eierstöcke mit den Eizellmarkern. Am achten Tag die Proben zwei Stunden lang mit einem frischen Waschpuffer waschen und dann den Waschpuffer durch 0,5 Milliliter der in einem Blockpuffer verdünnten sekundären Antikörpermischungen ersetzen.

Verschließen Sie die Platte mit einem Parafilm, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie die Proben drei Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Tag 11 nach der Immunfärbungswäsche den Waschpuffer absaugen und die Proben mit 0,8 Millilitern der Skala kubische eine Lösung bei 37 Grad Celsius für drei Tage im Dunkeln inkubieren. Ändern der Skala cubic eine Lösung täglich.

Waschen Sie die Proben am 15. Tag dreimal für 10 Minuten und 0,8 Milliliter PBS bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln. Dann ersetzen Sie das PBS durch 0,8 Milliliter der frisch zubereiteten entgasten 20%igen Saccharose mit PBS, gefolgt von sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde ersetzen Sie die 20%ige Saccharoselösung, um die Proben mit 0,8 Millilitern der kubischen Zweierlösung für vier bis fünf Tage zu behandeln, wie zuvor erläutert.

Um eine Probeneinrichtung vorzubereiten, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit dem Spitzenschnitt, um die pubertären Eierstöcke mit 15 bis 20 Mikrolitern kubischer Zweifachlösung in die Mitte der Klebevertiefung zu übertragen. Sobald die Eierstöcke mit einem Tropfen Clearinglösung in den einzelnen Brunnen überführt wurden, legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Klebeschacht und drücken Sie, um eine Versiegelung zu schaffen, die die Proben und die Clearinglösung zwischen zwei Deckgläsern aufnimmt. Für die Bildgebung platzieren Sie das Abdeckschlittensandwich in einem 3D-gedruckten Mikroskopadapterobjektträger.

Richten Sie die Parameter für die Bildaufnahme nach den Mikroskopiekernen oder den Herstellerangaben ein. Falls verfügbar, verwenden Sie die bidirektionale Bildaufnahme, um die Scanzeit zu reduzieren und die Effizienz zu verbessern. Passen Sie den Liniendurchschnitt, den Rahmendurchschnitt und die Rahmenakkumulation in der Software an.

Richten Sie den Z-Stapel ein, indem Sie die Anfangs- und die Endposition identifizieren und dann eine Z-Schrittgröße von zwei Mikrometern für präpubertäre Eierstöcke und fünf Mikrometer für pubertäre Eierstöcke auswählen. Als nächstes aktivieren Sie die Z-Kompensationsfunktion und den Erregungsgewinn. Stellen Sie die Z-Kompensation für die Unter- und Oberseite der Probe ein, indem Sie für beide eine Laserintensität auswählen.

Verwenden Sie den Kachelmodus für größere Stichproben, die nicht in einem einzigen Sichtfeld erfasst werden können. Aktivieren Sie den Bildnavigator und geben Sie die Anzahl der Kacheln an, die zum Erfassen der gesamten Probe mit dem rechteckigen Markierungswerkzeug erforderlich sind. Sobald die Einstellung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Bilder mit mehreren Kacheln, beginnen Sie mit der Bildaufnahme mit dem Navigator, um alle Kacheln zu erfassen.

Speichern Sie nach der Bildaufnahme alle Bilder. Und wenn mehrere Kacheln erworben wurden, führen Sie das Mosaik-Zusammenführungswerkzeug aus, um die Kacheln zu einem einzigen Bild zusammenzuführen. Um die Größe der Eizellen zu bestimmen, öffnen Sie das Bild und wählen Sie die Slice-Option, um das Zs-Stack-Bild zu öffnen.

Wählen Sie die Linienoption und das Messfeld aus und messen Sie den Abstand, indem Sie eine Linie von einer Kante einer Eizelle oder Markierung zur anderen Kante an der breitesten Stelle zeichnen, um den X-Y-Durchmesser der Eizelle zu bestimmen. Bewegen Sie sich durch den Stapel und erhalten Sie den Durchmesserbereich für mehrere Eizellen desselben Typs. Verwenden Sie die kürzeste Länge als Größenauswahlkriterium für die Anzahl der Eizellen.

Wählen Sie als Nächstes in der Option 3D-Ansicht die Fleckenfunktion aus. Aktivieren Sie im Szenenfenster die Funktion Neue Flecken hinzufügen, um das Algorithmusbedienfeld zu öffnen. Deaktivieren Sie dann alle Algorithmuseinstellungen als Größenauswahlfilter mit der zuvor erhaltenen Eizellgröße.

Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil des Kanals, um zum Quellkanal zu gelangen. Wählen Sie dann den Kanal mit dem bevorzugten Marker aus und geben Sie den erfassten Durchmesser in den geschätzten X-, Y-Durchmesser ein. Nach der Größenauswahl aktivieren Sie das Modell PSF-Dehnung und Hintergrundsubtraktion, die automatisch ermittelt werden.

Wählen Sie dann den einzelnen Vorwärtspfeil aus, um zum Bedienfeld "Filterpunkte" zu wechseln, und fügen Sie den Qualitätsfilter hinzu, um einen Schwellenwert zu bestimmen. Um die genaue Schätzung der Anzahl der Eizellen zu gewährleisten, vergrößern Sie das Bild. Klicken Sie später auf den Doppelpfeil, um die automatischen Zählungen abzuschließen.

Verwenden Sie die Registerkarte Bearbeiten, um verpasste Eizellen manuell auszuwählen, oder heben Sie die Auswahl von Nicht-Eizellpartikeln auf, die durch den automatischen Schwellenwert ausgewählt wurden. Wenn Sie fertig sind, notieren Sie die Daten auf der Registerkarte Statistiken unter der Registerkarte "Gesamt" für weitere Analysen. Um die Gesamtzahl der Eizellen und die geschädigten Eierstöcke zu schätzen, öffnen Sie Bilder der intakten Eierstöcke mit MRS und wählen Sie die Rahmenfunktion.

Wählen Sie unter den Rahmeneinstellungen das Kästchenraster, die Teilstriche und Zugriffsbeschriftungen aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Position XYZ die Option 200 Mikrometer aus, um in allen XYZ-Positionen Teilstriche mit 200 Mikrometern zu erzeugen. Wählen Sie anhand der 200-Mikrometer-Tick-Markierungen Eizellen aus, die innerhalb von 50% des Volumens jedes Eierstocks liegen.

Klicken Sie auf die Fleckenfunktion und wählen Sie die Bearbeitungsetiketten aus, um die Eizellen, die in den 50%-Bereich fallen, nach Farbe zu klassifizieren. In den repräsentativen Graustufen-Multiphotonenbildern der nicht durchbluteten und durchbluteten Eierstöcke waren die kleinen Eizellen in den primordialen Follikeln mit der dünnen Schicht zytoplasmatischer DDX4-Färbung zu sehen. Zusätzlich wurden die größeren Eizellen in den wachsenden Follikeln gesichtet.

Die 3D-Darstellungen aus den Multiphotonenbildern der pränatalen und postnatalen Eierstöcke wurden untersucht. Am postnatalen Tag 28 enthielt der Eierstock des nicht bestrahlten Kontrollweibchens eine große Population kleiner Eizellen in den Urfollikeln. Im Gegensatz dazu waren die Eierstöcke des bestrahlten Weibchens mit 0,5 Grau der Gammastrahlung völlig frei von kleinen Eizellen in den Primärfollikeln.

Aber größere Eizellen waren immer noch vorhanden. Für die Quantifizierung der Eizellen wurden die 3D-Multiphotonenbilder in der MRS-Software unter Verwendung des Goucian-Filters verarbeitet und die Eizellen kleiner und großer Größe mit dem Spot-Feature identifiziert und quantifiziert. Als nächstes wurde der durchschnittliche Prozentsatz der Eizellen in jeder Phase im Vergleich zu der durchschnittlichen Anzahl berechnet, die im frühesten Stadium vorhanden war E 15,5 Eizellenzahlen nahmen zwischen E 15,5 und E 18,5 stark ab, die E 15,5 und E 18,5 fetalen Eizellen exprimierten Linie eins oder ein P, wie in den Multiphotonenbildern zu sehen ist.

Die Intensitätsanalyse zeigte höhere Expressionen der Linie eins oder ein P pro Eizelle bei E 18,5 als E 15,5. Die Eierstöcke mit kleinen Schäden können zur Analyse verwendet werden. Die Gesamtzahl der Eizellen wird durch rechnerische Korrektur bestimmt.

Das repräsentative Modell zeigt G CNA-positive Eizellen im Eierstock E 15,5 mit fünf 10%-Regionen, die in einem intakten Eierstock hervorgehoben sind. In ähnlicher Weise wurde ein simulierter Eierstock mit 10% inkrementellen Regionen erzeugt, in denen bis zu 50% des Eierstocks fehlten. Die Gesamtzahl der Eizellen und die simulierten Eierstöcke wurden mit den ursprünglichen intakten Eierstöcken verglichen.

Und der Unterschied wurde als prozentuale Abweichung dargestellt Gute Perfusion führt zu einer guten Bildqualität. Stellen Sie also sicher, dass alle Gewebe mit PBS gereinigt werden, bevor Sie zu PFA wechseln. Stellen Sie sicher, dass die Eierstöcke vollständig freigelegt sind, indem Sie das zusätzliche Gewebe abschneiden.

Das Protokoll ermöglicht eine effiziente Analyse einer großen Anzahl von Proben, quantitative Daten aus genetischen Referenzpopulationen wie kollaborative Kreuz- oder Diversitätsergebnisse werden dazu beitragen, genetische Modifikatoren der Eizellenentwicklung und der Anzahl der Eizellen zu identifizieren.