Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse
7. Dezember 2021
Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.
Die beiden hier demonstrierten Peeling-Techniken isolieren einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente und können dazu beitragen, die wichtigen physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment bei gesunden und kranken Stäbchen ablaufen. Die Isolierung verschiedener Stäbchenzellkompartimente von der Netzhaut der Maus kann eine Herausforderung darstellen. Diese einfachen Techniken verwenden kostengünstige und alltägliche Labormaterialien, um subzelluläre Kompartimente für die Proteinanalyse zuverlässig zu isolieren.
Legen Sie zunächst ein Stück Filterpapier in eine Petrischale, die mit Ames HEPES-Puffer gefüllt ist, der mit 100% Sauerstoff gefüllt ist. Übertragen Sie dann mit einer Breitrohr-Transferpipette ein retinales Rechteck, das von einer zwei bis drei Monate alten C57 Black 6J-Maus seziert wurde. Richten Sie die unterteilte Netzhaut konkav aus und stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren nach unten zum Boden der Schale zeigen.
Greifen Sie dann mit einer Pinzette leicht die Seiten der halbierten Netzhaut und bewegen Sie sie auf das Filterpapier. Sobald die Netzhaut zentriert ist, bewegen Sie das Filterpapier nach oben, so dass die halbierte Netzhaut das Filterpapier berührt, um ein äußeres Segment zu erzeugen, oder ROS, um die Papierhaftung zu filtern. Heben Sie das Filterpapier mit der angebrachten Netzhaut vorsichtig aus dem Ames HEPES-Puffer heraus.
Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie zwei- bis dreimal zum Trocknen ab. Fügen Sie einen Tropfen Ames HEPES mit der Netzhaut auf die Seite des Filterpapiers und legen Sie das Filterpapier zum Trocknen erneut auf das Papiertuch. Als nächstes legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut zurück in die Petrischale und drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Ränder der halbierten Netzhaut nach oben und weg vom Filterpapier auf allen Seiten.
Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Filterpapier weg und berühren Sie nur den äußersten Umfang der Netzhaut, um ihre strukturelle Integrität zu erhalten. Heben Sie dann das Filterpapier aus der Petrischale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch, um sicherzustellen, dass die Seite, die mit der Netzhaut in Kontakt kommt, das Papiertuch nicht berührt. Legen Sie das Filterpapier mit der partiellen ROS-Schicht in ein markiertes Rohr auf Eis und halten Sie die geschälte Netzhaut in den Ames HEPES-Puffer getaucht.
Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für diese halbierte Netzhaut etwa sieben bis acht Mal, um die gesamte ROS-Schicht zu entfernen. Legen Sie das Filterpapier nach jedem Abziehen in dasselbe Röhrchen, um alle ROS zu kombinieren, die von einer halbierten Netzhaut isoliert sind. Bewahren Sie das Rohr mit allen Filterpapierschalen des isolierten ROS zur sofortigen Verwendung auf Eis auf.
Übertragen Sie die übrig gebliebene geschälte Netzhaut mit einer Pinzette in eine entsprechend gekennzeichnete Röhre und halten Sie die Tube zur sofortigen Verwendung auf Eis. Um die Netzhautprobe für die Lyophilisation vorzubereiten, legen Sie ein Stück Filterpapier und geben Sie eine halbierte Netzhaut in eine Petrischale, die mit kaltem Ringerpuffer gefüllt ist. Als nächstes drehen Sie die Netzhaut mit einer Pinzette vorsichtig um, so dass sie konkav nach oben ausgerichtet ist, und bewegen Sie sie, um auf dem Filterpapier zu ruhen.
Heben Sie das Filterpapier an den Rändern nach oben an, so dass das halbierte Stück Netzhaut das Filterpapier berührt. Heben Sie das Filterpapier weiterhin aus der Ringer-Lösung heraus. Legen Sie dann die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie es zwei- bis dreimal vorsichtig ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Als nächstes nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und fügen Sie einen Tropfen kalter Ringer auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lagern Sie jede geklebte Netzhaut- und Filterpapierprobe in einer Petrischale, die mit kalten Ringern gefüllt ist, bis alle Proben eingefroren werden können.
Heben Sie dann mit einer Pinzette jede Probe aus dem Puffer des kalten Ringers heraus und stellen Sie sicher, dass die Pinzette nur die Filterpapierränder berührt und die halbierte Netzhaut vermeidet. Legen Sie die Unterseite jedes Filterpapiers auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie dann einen Tropfen kaltes PBS auf die Seite des Filterpapiers auf, wo die Netzhaut haftet, und tupfen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch.
Legen Sie alle Filterpapierstücke in die Petrischale und leiten Sie mit fusselfreiem Seidenpapier überschüssige Flüssigkeit ab, die das Filterpapier umgibt. Wickeln Sie dann die gesamte Schale mit Alufolie fest ein und stellen Sie sicher, dass die Kanten der Aluminiumfolie gesichert und sanft in den Boden der Petrischale gedrückt werden. Eine Handvoll 0,1 bis 0,2 Millimeter große Löcher in den Deckel der Aluminiumfolie einstechen.
Als nächstes senken Sie mit einer Metallzange die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale allmählich in flüssigen Stickstoff ab. Bewahren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff auf, bis sie zur Lyophilisation bereit sind. Zur Lyophilisation legen Sie die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale in einen Gefriertrocknungskolben und befestigen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers an der Lyophilisatormaschine.
Lyophilisieren Sie die Netzhaut für 30 Minuten. Sammeln Sie nach der Lyophilisation das äußere und innere Segment des Stabes, indem Sie vorsichtig ein kleines Stück Klebeband auf die lyophilisierte Netzhaut legen und leichten Druck mit der Pinzette ausüben, um sicherzustellen, dass sie sich mit der Photorezeptorschicht verbindet. Ziehen Sie das Band langsam ab und stellen Sie sicher, dass sowohl der ROS als auch der RIS am Band haften.
Ein dünner, weißer Film wird an der gebrochenen Oberfläche vorhanden sein. Das ist das RIS. Um dieses RIS zu trennen, legen Sie ein weiteres Stück Klebeband und drücken Sie das Band auf die gebrochene Oberfläche.
Legen Sie dann das Stück Klebeband mit nur der orange-rosa Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das als ROS gekennzeichnet ist, und Stücke von Klebeband mit der dünnen, weißen Schicht in ein anderes Röhrchen mit der Bezeichnung RIS. Als nächstes sammeln Sie mit Klebeband das verbleibende Netzhautgewebe, das sich auf dem Filterpapier befindet, indem Sie die dicke, weiße Schicht abziehen. Legen Sie dieses Isolat dann in eine Röhre mit der Bezeichnung OIS.
Wenn Sie am selben Tag verwenden, lagern Sie die isolierten Schichten der lyophilisierten Netzhaut bei Raumtemperatur. Bei dunkel angepassten Tieren stimmte die Verteilung von GNAT1 und ARR1 eng mit ihren bekannten Dunkelzustandsverteilungen überein, wobei das GNAT1-Signal in der ROS-Isolierung sichtbar am stärksten war und das ARR1-Signal in der ROS-Isolierung robuster war. Die Quantifizierung der GNAT1- und ARR1-Signale zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Dunkellichtbedingungen für GNAT1 und ARR1 in ROS- und ROS-Proben.
Sowohl in dunklen als auch in lichtangepassten Proben werden G-Beat-5S-, Cytochrom-C- und Aktinsignale aus den ROS-Proben ausgeschlossen, was eine Abwesenheit von Kontamination durch andere Zellschichten zeigt. Zusätzlich war das G beta 5L-Signal in den ROS-Proben deutlich sichtbar. Die Rasterelektronenmikroskopie der Oberflächen intakter und geschälter lyophilisierter Netzhaut zeigte, dass vor dem Ablösen mit Klebeband die Oberfläche der intakten lyophilisierten Netzhaut eng mit dem charakteristischen zylindrischen ROS übereinstimmte.
Nach dem anfänglichen Bandpeeling schienen ROS und RIS vollständig entfernt zu sein, wie die gleichmäßige Kernschicht auf der Oberfläche der übrig gebliebenen, geschälten, lyophilisierten Netzhaut zeigt. Nachfolgende Bandabschalen entfernten RIS von der freien Oberfläche der geschälten Schicht. Diese Technik zeigte auch, dass die GRK1-Immunreaktivität in ROS-Proben in lichtexponierten Netzhäuten am intensivsten war und in OIS-Proben fehlte.
Umgekehrt zeigten ROS- und RIS-Proben ein schwaches Signal für PKC alpha, das in ROS oder RIS üblicherweise nicht durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen wird. Schließlich könnte ein suboptimales Bandpeeling leicht kontaminierte Proben ergeben. Die RIS-Probe war mit einer OIS-Probe kontaminiert, wodurch sowohl G beta 5L- als auch G beta 5S-Bänder und ein höheres PKC-Alpha-Signal erzeugt wurden.
Bei der Lyophilisation der Netzhaut ist Vorsicht geboten. Wenn eine unsachgemäße Lyophilisationstechnik verwendet wird, kann die Netzhaut schmelzen, was die Isolierung verschiedener subzellulärer Stäbchenschichten durch Klebeband unmöglich macht. Die Verwendung dieser Bandpeeling-Methode in Verbindung mit der qRT-PCR hat die Trennung von Photorezeptortranskripten vom Rest der Netzhaut ermöglicht.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert zwei Techniken zur Isolierung von subzellulären Kompartmenten muriner Stäbchen-Photorezeptoren, mit Fokus auf das Verständnis der physiologischen Prozesse sowohl in gesunden als auch in erkrankten Zuständen. Die Protokolle verwenden lebende Netzhäute und lyophilisierte Proben und setzen gängige Labormaterialien für eine effektive Isolierung zur Proteinanalyse ein.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Photorezeptorbiologie
- Proteinanalyse
Hintergrund
- Die Isolierung von subzellulären Stäbchen-Kompartments ist entscheidend für die Untersuchung der Photorezeptorphysiologie.
- Es gibt Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Netzhautstrukturen während der Isolierungsverfahren.
- Gängige Techniken erfordern oft fortgeschrittene oder teure Werkzeuge; diese Studie bietet einfachere Alternativen.
Zweck der Studie
- Protokolle zur Isolierung von äußeren und inneren Stäbchensegmenten aus Mäuse-Netzhäuten zu detaillieren.
- Proteinanalyse der isolierten Kompartments zu erleichtern.
- Zukünftige Studien zu unterstützen, die physiologische Veränderungen in Photorezeptoren untersuchen.
Verwendete Methoden
- Isolierung lebender Netzhäute unter Verwendung von Zellulosefilterpapier und Ames HEPES-Puffer.
- Lyophilisierungsprozess für die Isolierung sowohl der äußeren als auch der inneren Segmente.
- Verwendung von Klebeband zum Entfernen von Schichten aus lyophilisierten Netzhäuten.
- Mehrfache Schäliterationen zur Gewährleistung einer umfassenden Schichtisolierung.
Hauptergebnisse
- Die beschriebenen Methoden ermöglichen eine zuverlässige Trennung von äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und inneren Stäbchensegmenten (RIS).
- Tests bestätigten unterschiedliche Proteinsignale in ROS und RIS unter verschiedenen Lichtbedingungen.
- Die Studie hebt signifikante molekulare Unterschiede zwischen den isolierten Kompartments hervor.
Schlussfolgerungen
- Diese Arbeit ermöglicht ein verbessertes Verständnis der Funktionalität von Stäbchen-Photorezeptoren durch detaillierte Kompartmentanalyse.
- Die Isolierungstechniken können breit für Forschungsanwendungen in der Photorezeptorbiologie angepasst werden.
- Die Ergebnisse können zukünftige Forschungen zu Netzhauterkrankungen und Photorezeptor-Pathophysiologie beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating subcellular compartments of rod photoreceptors enables precise measurement of protein distribution, supporting target validation in retinal disease research. These peeling methods provide enriched, compartment-specific fractions for quantitative western blot analysis, improving mechanistic de-risking of photoreceptor targets. The techniques are adaptable to healthy and degenerating retinae, offering translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating rod outer segment (ROS) and inner segment (RIS) for protein-specific analysis.
- Operational Value: Uses inexpensive, common lab materials (filter paper, tweezers, tape) to isolate subcellular compartments without specialized equipment.
- Predictive Value: Facilitates quantitative measurement of photoreceptor protein redistribution under dark- and light-adapted conditions, supporting functional target assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers enriched subcellular fractions (ROS, RIS, OIS) that reduce contamination from other retinal layers, improving assay specificity.
- Operational Value: Simple peeling workflow allows rapid preparation of samples for downstream protein analysis, increasing throughput in early screening.
- Predictive Value: Enables reliable detection of compartment-specific proteins (e.g., GNAT1 in ROS, ARR1 in ROS) under defined physiological conditions, supporting biomarker-aligned assay design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing isolation of compartments from both healthy and degenerating retinae.
- Operational Value: Lyophilization and tape-based peeling preserve structural integrity, enabling consistent sample preparation across experimental conditions.
- Predictive Value: Demonstrates absence of contamination (e.g., exclusion of G beta 5S, cytochrome C, actin from ROS) confirming layer-specific protein signals for reliable translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven isolation of photoreceptor compartments prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating ROS and RIS to study protein localization and redistribution.
- Screening: Generates quantitative, compartment-specific protein outputs suitable for assay standardization and reproducibility testing.
- Analytics: Provides measurable readouts (e.g., GNAT1, ARR1, GRK1 signals) that allow comparison across light/dark conditions and disease states.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling protein analysis in disease models of retinal degeneration.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standardized, low-cost materials, supporting adaptation across labs and model systems as a reusable isolation capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through compartment-specific protein resolution.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via simple, repeatable peeling steps using accessible lab supplies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of target engagement and subcellular specificity, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on target distribution in photoreceptor compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection and handling of delicate neural tissue under sterile or controlled conditions.
- Dependent on standard lab equipment: Petri dishes, filter paper, tweezers, tape, lyophilizer, and buffers (Ames HEPES, Ringer's, PBS).
- Necessitates cross-team standardization of peeling technique and lyophilization timing to ensure sample integrity and reproducibility.
- Must account for adaptation across model systems, as retinal curvature and layer thickness may vary between species or disease states.
- Practical limitation: suboptimal tape peeling or improper lyophilization can yield contaminated samples, requiring careful technique execution.
