Kryoschnitt-Dissektion der adulten subependymalen Zone für genaue und tiefe quantitative Proteomanalyse

Unsere Dissektionsmethode ermöglicht eine präzise Isolierung der ventrikulären neurogenen Nische und eignet sich daher gut für die Untersuchung der molekularen Mikroumgebung dieser Nische. Der Hauptvorteil dieser Dissektionsmethode besteht darin, dass sie präzise und effizient ist und eine minimale Gewebestörung verursacht, während sie gleichzeitig mit der Massenspektrometrie für die Proteomanalyse kompatibel ist. In diesem Protokoll extrahieren wir die neurogene Nische des Ventrikels aus einem Mausgehirn, aber diese Methode kann auch auf andere Arten und in verschiedenen Gesundheits- und Krankheitszuständen angewendet werden.

Die Technik kann etwas Training erfordern. besonders bei den Skalpellschnitten beim Freilegen und Extrahieren der ventrikulären neurogenen Nische. Nachdem Sie eine 8 bis 10 Wochen alte schwarze/6-maus aus C57 eingeschläfert haben, extrahieren Sie das Gehirn durch manuelle Dissektion und legen Sie es in eine Kulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium.

Entfernen Sie mit einem Skalpell den Riechkolben, indem Sie einen geraden koronalen Schnitt zwischen dem Riechkolben und dem innenpol des Kortex machen. Als nächstes entfernen Sie den vorderen Pol des Kortex, indem Sie einen koronalen Schnitt machen, um sicherzustellen, dass die lateralen Ventrikel in der koronalen Ebene sichtbar sind. Öffnen Sie dann mit einer Schere beide seitlichen Ventrikel von oben, beginnend mit dem sagittalen Abschnitt von der kortikalen Oberfläche bis zum ventrikulären Lumen.

Verlängern Sie diesen Schnitt C-förmig nach der ventrikulären Flexion. Als nächstes verbinden Sie die kaudalen Enden des linken und rechten sagittalen Schnitts mit einem zusätzlichen koronalen Schnitt. Als nächstes entfernen Sie den Kortex und das Corpus callosum, die die medialen Ventrikelwände bedecken.

Wenn das Gewebe an den medialen Ventrikelwänden befestigt ist, machen Sie zusätzliche Schnitte oder heben Sie den Kortex und den Corpus callosum mit einer Schere an, um das Gewebe zu entfernen. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette den Kortex und den Corpus callosum, die die lateralen Ventrikel bedecken. Verteilen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Ventrikelwände und entfernen Sie den Aderhautplexus.

Legen Sie dann das Gehirn auf eine Glasrutsche und legen Sie die Folie auf Trockeneis, um das Gehirn mit den ventrikulären Wänden in der offenen Konfiguration einzufrieren. Stellen Sie vor dem Schneiden sicher, dass das Gehirn mit einem Einbettungsmedium für gefrorenes Gewebe an der Kryostatenaufsatzplatte am Hinterhirn befestigt ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass kein Einbettungsmedium mit dem Vorderhirn in Kontakt kommt, insbesondere an den Ventrikeln.

Schneiden Sie dann 50 bis 100 Mikrometer dicke koronale Abschnitte des Gehirns bis zum Ende des lateralen Ventrikels und montieren Sie die Abschnitte auf den Glasobjektträgern. Legen Sie die Glasobjektträger unter einem Seziermikroskop auf Trockeneis. Heben Sie die Scheiben für 15 bis 30 Sekunden vom Trockeneis ab, um ein kurzes, unvollständiges Auftauen zu erreichen, wodurch das kompakte Myelin des Striatums als dichte weiße Punkte beobachtbar wird.

Trennen Sie dann mit einem vorgekühlten Skalpell die subependymale Zone vom angrenzenden Striatum und übertragen Sie sie als ganzes Stück oder in zwei bis vier Teile geschnitten in ein Mikrozentrifugenrohr mit dem stumpfen Rand des gekühlten Skalpells. Dann machen Sie dasselbe für die mediale ventrikuläre Zone. Myelin-assoziierte, Glykoprotein-positive innere Kapseln des Striatums wurden in den Wholemount-Proben identifiziert, selten jedoch in den Kryoschnitt-Dissektionsproben über die Immunhistochemie.

Die striatale Kontamination in den Wholemount-Proben wurde durch Anreicherung von Myelinproteinen in der subependymalen Zone im Vergleich zu den somato-sensorischen Kortexproben bestätigt. Im Gegensatz dazu zeigten Vergleiche dieser Myelinmarkerproteine in den Kryoschnitt-Dissektionsproben keine signifikanten Unterschiede in der subependymalen Zone und somato-sensorischen Kortexproben. Beim Vergleich der massenspektrometrischen Ergebnisse zwischen Kryoschnitt-Dissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion ergab die Laser-Capture-Mikrodissektion etwa halb so viele quantifizierte Proteine, obwohl die Gewebeentnahmezeit etwa doppelt so lang war.

Die Analyse der Hauptkomponenten zeigt, dass es eine größere Variabilität zwischen Proben gibt, die mit Laser-Capture-Mikrodissektion gesammelt wurden, die als Quadrate dargestellt werden, als zwischen denen, die mit Kryoschnitt-Dissektion gesammelt wurden, die als Kreise dargestellt werden. Ein 2D-Annotationsanreicherungstest zwischen Kryoschnitt-Dissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion für die subependymalen und medialen ependymalen Zonen ergab eine ähnliche Anreicherung sowohl in Methoden als auch in Regionen für Proteine, die mit dem extrazellulären Raum assoziiert sind. Die Kryoschnittdissektion bietet eine robustere Identifizierung und Quantifizierung der Neurogenese in subependymalzonenassoziierten extrazellulären Matrixproteinen.

Im Falle von Tenascin-C zeigte nur die Kryoschnittdissektion eine Anreicherung in der subependymalen Zone im Vergleich zur medialen ependymalen Zone. Achten Sie darauf, dass die Hirnabschnitte auf den Folien nicht vollständig aufgetaut werden. Insgesamt ist es gut, die Schritte im Dissektionsverfahren für ein konsistentes Ergebnis zu üben.

Die Dissektionsmethode kann auch mit anderen Proteinanalysemethoden verwendet werden, die sehr wenig vorhandene Proteine wie Wachstumsfaktoren und Zytokine leicht nachweisen können. Diese Mikrodissektionsmethode ermöglichte es uns, einen neuen Neurogenese-Regulator zu identifizieren, und wir glauben, dass es anderen ermöglichen wird, andere Regulatoren der Neurogenese in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.