Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung
November 4th, 2021
Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zellen schnell von Screening-Schnittstellen für die genomische Charakterisierung zu isolieren, und diese Fähigkeit ist von Bedeutung, da es makroskopisch beobachtbare Zellmerkmale mit genomischen Informationen kombinieren kann. Die anvisierten Bakterienzellen aus den Screening-Grenzflächen können mit dieser Technik auf operationell einfache Weise mit hoher räumlicher Position isoliert werden. Die Hydrogele können in anderen Siebschnittstellen implementiert werden.
Das Hydrogel-Material kann leicht in mikrofluidische Kanäle eingebaut werden, um Auf-Abruf von Zellen aus mikrofluidischen Geräten auf Abruf zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Impfung des Vernetzungspuffers mit der gewünschten Zelldichte. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung in einem 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 12,5 Mikroliter des Vernetzungspuffers und 5,6 Mikroliter PEG ONB-Diacrylatlösung hinzufügen.
Und schließlich fügen Sie 6,9 Mikroliter Unterarm-PEG-Thiollösung zu der Mischung hinzu. Für die Zellverkapselung in der Hydrogel-Vorläuferlösung legen Sie die thiolierten Basis-Deckgläser auf eine saubere Petrischale und positionieren zwei Abstandshalter auf den beiden gegenüberliegenden Seiten des Deckglases. Befestigen Sie die Abstandshalter auf dem Bodendeckglas, indem Sie die Abstandshalter an die Petrischale kleben.
Nach Zugabe des gewünschten Volumens der Vorläuferlösung auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger den Objektträger auf den Bodendeckglas legen und die Hydrogelbildung bei Raumtemperatur 25 Minuten abschließen lassen. Sobald die Gelierung abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den perfluoralkylierten Glasobjektträger. Legen Sie das Substrat in die 60 mal 15 Millimeter große Petrischale mit ATGN-Medien, die mit einem Antibiotikum ergänzt werden.
Säen Sie 700 Mikroliter bakterielle Zellsuspensionen mit OD 600 von 0,1 über das Microwell-Array-Substrat und stellen Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung her, wie zuvor unter Verwendung von 12,5 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung ATGN von pH acht gezeigt. 12,5 Mikroliter der Vorläuferlösung werden auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert und zwei 38 Mikrometer große Stahlabstandhalter auf zwei gegenüberliegenden Seiten des mit Zellen innokulierten Mikrotiterfeld-Array-Substrats platziert. Dann den perfluoralkylierten Glasobjektträger mit dem Vorläuferlösungströpfchen invertieren und ein Tröpfchen in die Mitte des Mikrotitergutsubstrats legen.
Wenn das Hydrogel nach einer Inkubation von 25 Minuten bei Raumtemperatur gebildet wird, entfernen Sie den Glasobjektträger vorsichtig vom Mikrotitergutsubstrat und legen Sie das Substrat in eine Petrischale mit ATGN-Medien, die mit Antibiotika ergänzt sind. Legen Sie die Probe in einen PDMS-Halter und fügen Sie das definierte Medium auf die Probe auf, um eine Austrocknung der Probe zu verhindern und eine Trägerlösung für freigesetzte Zellen bereitzustellen. Nachdem Sie den Kalibrierspiegel in Position gebracht haben, stellen Sie den Mikroskopfokus ein, um ein scharfes Bild der Kolonien innerhalb des Hydrogel- oder Mikrotiterrohrarrays zu erhalten, und inspizieren Sie, um Kolonien oder Vertiefungen von Interesse zu identifizieren.
Entwerfen Sie hier die Lichtmuster, während die Kameraansicht die Kolonien in der Probe zeigt, um verschiedene Muster für die Zellextraktion zu testen und das definierte Muster zu speichern. Wählen Sie dann den Abschnitt Sitzungssteuerung aus und fügen Sie die gespeicherte Sequenz unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs hinzu. Wählen Sie die Option zum Stimulieren des Musters, um die gewünschte Belichtungsposition anzuzeigen und anzupassen.
Stellen Sie als Nächstes die Lichtintensität auf 60% und die Belichtungszeit auf 40 Sekunden unter der LED-Steuerregisterkarte ein und starten Sie den Belichtungsprozess. Überwachen Sie den Hydrogelabbau in Echtzeit und im Brightfield-Modus, um die Zellfreisetzung sicherzustellen. Um die freigesetzte Zelle zu sammeln, ändern Sie den Mikroskopfilter von Brightfield auf TRITC, um den exponierten Bereich der Probe mit bloßem Auge sichtbar zu machen.
Sobald der exponierte Bereich lokalisiert ist, platzieren Sie das Ende des Schlauches auf der bestrahlten Stelle und ändern Sie dann den Mikroskopfilter zurück in Brightfield, um den Zellabruf in Echtzeit zu überwachen. Verwenden Sie die Spritze, die am anderen Ende des Schlauches befestigt ist, um vorsichtig 200 Mikroliter Lösung mit den freigesetzten Zellen zu entnehmen und die Lösung zur DNA-Analyse oder Beschichtung in ein 1,5-Millimeter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Für die Zellextraktion aus Bulk-Hydrogelen wurden unterschiedliche UV-Licht-Mikromuster verwendet, die die Morphologie der freigesetzten Zellen beeinflussten.
Die UV-Exposition in einem Ringmuster führte zur Freisetzung der gesamten Kolonie, die in einem schützenden PEG-Hydrogel eingekapselt war. Im Gegensatz dazu könnten Zellen durch die Exposition eines Teils oder der gesamten Kolonie gegenüber UV-Licht entweder als aggregierte Zellcluster oder als freie Einzelzellen extrahiert werden. Die Zellaussaatdichte und -dicke des Hydrogels sind wichtig für die Zellverkapselung.
Die dünneren Hydrogele führten zu Mikrokolonien mit minimaler Kolonieüberlappung, während die Hydrogele mit erhöhter Dicke zu überlappenden Kolonien führten, was zur Extraktion mehrerer Kolonien führen könnte. Überlappende Kolonien können während der Extraktion aufgrund der zweidimensionalen Natur des Lichtmusters zu einer Kreuzkontamination führen. Wenn eine Top-Kolonie ins Visier genommen wurde, wurde auch die darunter liegende Kolonie mit ihr extrahiert.
Die Wirkung unterschiedlicher UV-Licht-Mikromuster auf die Zelllebensfähigkeit wurde ebenfalls bewertet. Wenn Mikrokolonien kontrollierten Dosen von UV-Licht entweder in einem kreisförmigen oder kreuzförmigen Muster ausgesetzt wurden, wurden die Zellwiederherstellung und die DNA-Reinheit nicht beeinflusst. Die Zellen wurden mit diesem Ansatz erfolgreich aus Mikrotiterplatten-Arrays gewonnen, was aus den repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern hervorging, wobei bei Bestrahlung im Kreis- und Ringmuster die Zellen im jeweiligen Muster entfernt wurden.
Nach der Extraktion aus Microwell-Arrays wurden die Zelllebensfähigkeit und die DNA-Menge bewertet. Die Expositionsmuster beeinflussten weder die Anzahl der lebensfähigen Zellen noch die DNA-Qualität, was darauf hindeutet, dass lebensfähige Bakterienzellen selektiv aus Mikrobohrungen mit minimalem Schaden entnommen werden konnten und ihre DNA mit hoher Reinheit für die nachgeschaltete genomische Analyse isoliert werden konnte. Überprüfen Sie immer, ob sich das Hydrogel gebildet hat, bevor Sie den perfluoralkylierten Deckglas entfernen.
Präzision und Sorgfalt sind erforderlich, um die Abstandhalter für die Hydrogelabscheidung zu platzieren und die Schläuche für die Extraktion von Zellen zu verwenden.
Übersicht
Dieser Artikel behandelt ein Protokoll zur Isolierung bakterieller Zellen unter Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen und hochauflösender Lichtmusterung. Die Methode ermöglicht die schnelle und kostengünstige Extraktion spezifischer Bakterien aus komplexen Gemeinschaften und erleichtert die genomische Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
- Genomik
Hintergrund
- Die Isolierung spezifischer bakterieller Zellen ist entscheidend für die genomische Charakterisierung.
- Photoabbaubare Hydrogele bieten einen neuartigen Ansatz für die Einkapselung und Rückgewinnung von Zellen.
- Die Technik kombiniert beobachtbare Zellmerkmale mit genomischen Daten.
- Hydrogele können in verschiedene Screening-Schnittstellen integriert werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur schnellen Isolierung gezielter bakterieller Zellen.
- Beurteilung der Wirksamkeit von Lichtmustern bei der Zellextraktion.
- Bewertung des Einflusses der Hydrogeldicke auf die Zelllebensfähigkeit und Extraktionseffizienz.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Hydrogel-Vorläuferlösungen für die Zelleinkapselung.
- Verwendung von Lichtmusterwerkzeugen zum Abbau von Hydrogelen und zur Freisetzung von Zellen.
- Überwachung der Zellextraktion durch Mikroskopie.
- Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und DNA-Qualität nach der Extraktion.
Hauptergebnisse
- Zellen wurden erfolgreich aus Mikrowellen-Arrays mit minimalen Schäden isoliert.
- Verschiedene UV-Lichtmuster beeinflussten die Morphologie der freigesetzten Zellen.
- Die Hydrogeldicke beeinflusste die Kolonienüberlappung und die Extraktionsergebnisse.
- Zelllebensfähigkeit und DNA-Reinheit blieben während des Extraktionsprozesses erhalten.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht die selektive Rückgewinnung lebensfähiger bakterieller Zellen.
- Hydrogele können effektiv in genomischen Studien von Bakterien eingesetzt werden.
- Dieser Ansatz verbessert die Effizienz der Zellisolierung für nachgelagerte Anwendungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
