Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse

Dieses Protokoll wurde für Anfänger des NanoSight LM10 entwickelt. Durch das Befolgen der Schritt-für-Schritt-Anweisungen können genaue und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Diese Technik trägt dazu bei, konsistente Ergebnisse über mehrere Testläufe hinweg sicherzustellen, unabhängig von den Fähigkeiten des Benutzers.

Die Charakterisierung von Nanopartikeln, insbesondere die Quantifizierung, ist nach wie vor eine Herausforderung im Bereich der extrazellulären Vesikelforschung. Dieses Protokoll ermöglicht eine konsistente Größen- und Konzentrationsanalyse von Nanopartikeln in Suspension. Beginnen Sie mit der Reinigung der Glasoberflächen des Lasermoduls mit einem hochwertigen Linsenreiniger und Linsenpapier.

Stellen Sie vor der Montage des Moduls sicher, dass die O-Ring-Dichtung ordnungsgemäß in der Nut der Durchflusszellenabdeckung sitzt. Platzieren Sie dann die Durchflusszellenabdeckung auf dem Lasermodul und stellen Sie sicher, dass sich die elektrischen Kontakte in der richtigen Ausrichtung befinden. Als nächstes platzieren Sie die vier federbelasteten Rändelschrauben durch die Durchflusszellenplatte und greifen die Gewinde des Lasermoduls ein, ohne sie einzeln festzuziehen.

Während Sie den gleichmäßigen Druck auf die Durchflusszellenabdeckung ausüben, ziehen Sie die Rändelschrauben abwechselnd diagonal gleichmäßig an, bis sie fest sitzen. Spülen Sie zwei Ein-Milliliter-Tuberkulinspritzen mit Slip-Lock-Adaptern dreimal mit einem Milliliter DPBS. Entfernen und entsorgen Sie den Kolben aus der ersten Tuberkulinspritze, bevor Sie die Spritze in den verbleibenden Anschluss einführen, um als leeres Verdünnungsmittel oder Probenreservoir zu dienen.

Füllen Sie dann die zweite Spritze mit einem Milliliter DPBS und befestigen Sie sie am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung. Halten Sie das Lasermodul geneigt, wobei der Auslassspritzenanschluss erhöht ist, damit Luft aus der Kammer gespült werden kann, während das DPBS langsam in das Lasermodul injiziert wird. Spülen Sie die verbleibenden DPBS aus dem Lasermodul, indem Sie einen Milliliter Luft in den Einlassanschluss injizieren.

Wiederholen Sie das Spülen zweimal. Entleeren Sie nach dem letzten Spülen das Lasermodul so vollständig wie möglich und laden Sie das Modul zum Fokussieren und Positionieren. Öffnen Sie die Software.

Klicken Sie auf der Registerkarte Aufnahme in der oberen linken Ecke auf Kamera starten. Wenn sich die Kamera nach fünf Minuten automatisch ausschaltet, klicken Sie auf Kamera starten, um sie neu zu starten. Stellen Sie auf derselben Registerkarte die Kameraebene auf 14 bis 16 ein, um die Laserlinie aufzuhellen und die Partikelidentifizierung und -fokussierung zu vereinfachen.

Indem Sie den oberen Schieberegler auf der linken Seite des Kopfstücks nach innen oder außen bewegen, leiten Sie das Bild von der Kamera zu den Okularen um. Suchen Sie im Sichtfeld den Bereich mit erhöhter Dichte, der als Fingerabdruck und Mitte bezeichnet wird, und fokussieren Sie den Fingerabdruck vertikal. Zentrieren Sie im Sichtfeld die Laserlinie und bewegen Sie dann den oberen Schieberegler, um das Licht auf die Kamera umzuleiten, wie auf dem Computerbildschirm beobachtet.

Das Bild auf dem Computerbildschirm ist ein Spiegelbild aus der Ansicht in den Mikroskopokularen. Passen Sie den Fokus an, um das Bild einzelner sich bewegender Partikel auf dem Bildschirm mit dem Fokusknopf zu schärfen. Um die Proben zu laden, ziehen Sie einen Milliliter der Probe in eine gespülte Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze und befestigen Sie die Spritze am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung.

Bewegen Sie den Kolben weiter, bis Flüssigkeit in der offenen Spritze sichtbar ist, die am Auslassanschluss befestigt ist. Das Modul sollte geneigt sein, damit Luft aus dem Lasermodul gespült werden kann. Verschieben Sie in der Kameraansicht den Fokus rechts von der Laserlinie auf einen Bereich mit einer gleichmäßigen Anzahl von Partikeln.

Passen Sie die vertikale Ausrichtung an, um die horizontalen Lichtbänder zu zentrieren, und fokussieren Sie neu, bis die höchste Anzahl von Partikeln sichtbar ist. Stellen Sie sicher, dass die Position des Fokus für alle nachfolgenden Maßnahmen konsistent bleibt. Stellen Sie die Kameraebene so ein, dass das Symbol für dunkle Informationen in der oberen rechten Ecke der Kameraansicht zeitweise ein- und ausgeschaltet wird.

Für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) legen Sie die Dauer auf 30 oder 60 Sekunden und die Anzahl der Videos auf fünf fest. Um den vorhandenen Basisdateinamen zu ändern, klicken Sie auf die Registerkarte für einen neuen Speicherort für generierte Daten mit einem neuen Dateinamen. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Zieltemperatur, um die gewünschte Temperatur einzugeben, und klicken Sie auf Skript erstellen, um die Standardmessung wiederzuverwenden.

Sobald das Beispiel geladen ist und das Experiment zum Ausführen bereit ist, klicken Sie auf Erstellen und Skript ausführen. Füllen Sie im Popup-Fenster "Berichtsdetails festlegen" die Felder mit den erforderlichen Informationen zum Bediener, zur Probe und zum Verdünnungsmittel aus. Wenn alle gewünschten Felder ausgefüllt wurden, klicken Sie auf Einstellungen OK, um das Skript zu starten.

Suchen Sie vor jeder Videoaufnahme nach einer Eingabeaufforderung, um den Kolben manuell zu bewegen. Injizieren Sie etwa 0,05 Milliliter der Probe in die Laserkammer. Wenn die Partikel zur Ruhe kommen, klicken Sie auf OK. Nach Abschluss der fünften Videoaufnahme wird neben dem Prozessfeld ein Einstellungsbestätigungsfeld angezeigt.

Wenn die Frames manuell vom unteren Rand des Videobildschirms aus verschoben werden, notieren Sie sich die Anzahl der blauen Kreuze, die Partikel auf dem Bildschirm bilden, und legen Sie den Erkennungsschwellenwert für die Verarbeitung der Probe fest. Warten Sie, bis die Videos automatisch in einem Histogramm der Ergebnisse verarbeitet werden, bevor eine Dialogfeldbenachrichtigung über den Abschluss angezeigt wird, und klicken Sie dann auf OK. Nachdem das Feld Exporteinstellungen angezeigt wird, speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Exportieren klicken. Markieren Sie alle fünf Aufnahmevideos, die im aktuellen Experiment aufgeführt sind.

Klicken Sie anschließend auf Ausgewählte Dateien verarbeiten und warten Sie, bis das Einstellungsbestätigungsfeld im Prozessfeld angezeigt wird, um den Erkennungsschwellenwert zu ändern, passen Sie dann den Erkennungsschwellenwert auf die gewünschte Stufe an, gehen Sie zur Einstellung und klicken Sie auf OK. Die Videos werden automatisch in einem Histogramm der Ergebnisse verarbeitet und eine Dialogfeldbenachrichtigung über die Fertigstellung wird angezeigt. Klicken Sie OK.In die repräsentative Analyse, die Ergebnisse der Nanotracking-Analyse, kurz NTA, für die Liposomenproben und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel angezeigt werden. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108 Nanometern und eine Konzentration von 7,4 mal 10 bis achte Partikel pro Milliliter.

Im Gegensatz dazu hatten ungefilterte Proben einen mittleren Partikeldurchmesser von 159 Nanometern und eine Konzentration von 7,6 mal 10 bis zum achten Partikel pro Milliliter. Auf kombinierten Kameraebenen, als die Erkennungsschwelle von zwei auf fünf erhöht wurde, zeigte die mittlere und modische Partikelgröße eine signifikante Abnahme der Partikelgrößen der gefilterten Proben. Die Partikelkonzentrationen auf kombinierten Kameraebenen wurden verringert, da die Nachweisschwelle erhöht wurde.

Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Partikelkonzentrationen zwischen gefilterten und ungefilterten Proben festgestellt. Bei kombinierten Erkennungsschwellen, als der Kamerapegel von 12 auf 14 anstieg, wurde eine Abnahme der mittleren und modischen Partikelgröße der gefilterten Proben festgestellt. Die Partikelkonzentrationen bei kombinierten Detektionsschwellen stiegen an, als die Kamerawerte von 12 auf 14 stiegen.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten Proben beobachtet. Die Schritte 4.1 bis 5.2 sind wichtig, um den richtigen Betrachtungsbereich zu finden. Das Erreichen konsistenter Ergebnisse über mehrere Testläufe hängt von dieser wiederholbaren Fähigkeit ab.

Die dynamische Lichtstreuung wird oft als Begleiter der Nanopartikel-Tracking-Analyse verwendet, um in erster Linie das Zetapotential zu erhalten, das die Oberflächenladung der Partikel ist. Für die Nanopartikelanalyse ist NTA nach wie vor eine sehr wertvolle Methode zur Quantifizierung von Partikeln, die für die extrazelluläre Vesikelforschung nützlich sind.