Name: Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Erfahren Sie einen markierungsfreien Assay zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die direkte Detektion von AP-Stellen-Produkten mit hoher Spezifität.

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Wir danken der NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und dem NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, R.O.C. unterstützt [Fördernummer MOST109-2314-B-002 -186 an K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 an S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 an W.-h.F.]. H.-L.C. ist Stipendiat der National Taiwan University. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: Ministerium für Wissenschaft und Technologie, R.O.C.

1. Substrat-/Vorlagenvorbereitung
<ol><li>Entwerfen Sie Uracil-Substrat / Template-Duplex mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt von ~ 50 ± 10% und einer minimalen Schmelztemperatur von 50 ° C für den Duplexbereich. HINWEIS: Ein Nukleotidunterschied zwischen 18 nt-Substraten und 19 nt-Schablonen (Tabelle 1 und Abbildung 1) trägt zu einer besseren MS-Signalinterpretation und einem geeigneten Glühen bei. Der Template-Strang dient als komplementäre DNA zur Erzeugung von A-U- oder G-U-Mismatches (Tabelle 1), kann aber auch als Referenzsignal in MS-Messungen verwendet werden. Die Verwendung von HPLC-gereinigten synthetischen Oligonukleotiden ist für diese Studie zufriedenstellend.</li>
	<li>DNA in 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C) (TE) bei einer Konzentration von 100 μmol/L als Vorrat lösen und bei -20 °C lagern. Verdünnen Sie diesen 20-μL-Schaft mit TE auf ein Endvolumen von 800 μL (25-fache Verdünnung auf 4 μmol/L). Messen Sie die Absorption der DNA-Lösung in einem UV-sichtbaren Spektralphotometer bei λ = 260 nm, um die vom Hersteller zugewiesene Konzentration sicherzustellen. Zum Beispiel: A260 = 0,204 für 4 μmol/L von U+9 und A260 = 0,192 für 4 μmol/L von T1 (Tabelle 1).</li>
	<li>Durchführung einer MALDI-TOF-MS-Analyse (Abschnitte 4-6) zur Qualitätskontrolle von Oligonukleotid, indem eindeutige Spitzensignale bei bestimmten m/z-Werten untersucht und überprüft wird, ob das Signal-Rausch-Verhältnis >100 beträgt (Abbildung 1B und Abbildung 1D).</li>
</ol>2. DNA-Glykosylase-Assay
<ol><li>Unter Verwendung eines G:U-Substrats von T1/U+9-duplex (Tabelle 1 und Abbildung 1A) für die Glykosylase-Reaktion, beispielsweise in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, werden 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG-Reaktionspuffer, 5 μL T1-Material und 5 μL U+9-Material (Schritt 1.2) zugegeben. HINWEIS: Wählen Sie die richtige Art von Mikropipette und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das erforderliche Volumen zu handhaben. Verwenden Sie beispielsweise eine 2-μL-Pipette, um 0,1-2 μL Flüssigkeit zu dosieren, verwenden Sie eine 10-μL-Pipette, um 2-10 μL Flüssigkeit zu dosieren, und verwenden Sie eine 100-μL-Pipette, um 20-100 μL Flüssigkeit zu dosieren, um Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse zu gewährleisten. Das beschriebene Volumen der Reagenzmischung gilt für 10 Assays; Passen Sie die Lautstärke an die gewünschte Anzahl von Reaktionen an. Der 1x UDG-Reaktionspuffer enthält 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C). Siehe die Materialtabelle für die Quelle des 10-fachen UDG-Reaktionspuffers.</li>
	<li>Schließen Sie die Röhre sicher; Inkubieren Sie in einem Wasserbad für 30 min bei 65 ° C, dann für 30 min bei 37 ° C und schließlich auf Eis für 3 Minuten, um ein ordnungsgemäßes Glühen des Substrats / der Vorlagen-Duplex sicherzustellen.</li>
	<li>In einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen fügen Sie 49 μL eiskalten 1x UDG-Reaktionspuffer und 1 μL UDG (5.000 Einheiten/ml; siehe Materialtabelle) hinzu und verdünnen auf 0,1 Einheiten/μL. Führen Sie serielle Verdünnungen mit 1x UDG-Puffer auf die gewünschten Enzymkonzentrationen von 0,05, 0,02 oder 0,01 Einheiten/μL durch. Halten Sie das verdünnte UDG immer auf Eis. HINWEIS: In einer 10-μL-Reaktion können 0,1 Einheiten UDG in 3 min mehr als 30 pmol Uracil aus einem T1/U+9-Duplex spalten.</li>
	<li>In einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 9,0 μL Substratmischung aus Schritt 2.2 zugeben und das Röhrchen auf 37 °C vorwärmen. Zugabe von 1,0 μL des verdünnten UDG aus Schritt 2.3. Verwenden Sie einen Timer, um die Reaktion zu timen, und bewegen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen. HINWEIS: Für einen Unit-Definitionsassay beträgt die Inkubationszeit 30 min. Für einen kinetischen Assay verwenden Sie eine Zeitverlaufsanalyse von 0,5, 1, 2, 3, 5 Minuten, um die Anfangsrate zu erhalten. Für einen UGI-Inhibitionsassay wird die Reaktion für 15 min zeitlich begrenzt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch für 3-5 s bei 3.200 × g bei Umgebungstemperatur. Übertragen Sie dann die Reaktion sofort auf 37 °C.</li>
	<li>Reaktionsabbruch
	<ol>
<li>Bereiten Sie Lösungen von 0,25 M HCl und 0,23 M Tris Base vor. In einem 15 ml Reagenzglas 10 ml einer Lösung von 1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C) zugeben, um 1x UDG-Reaktionspuffer nachzuahmen. Ansäuern Sie mit 1 ml 0,25 m HCl und überprüfen Sie mit einem pH-Meter, um sicherzustellen, dass der pH-Wert ~ 2 ± 0,5 beträgt. Neutralisieren Sie mit 1 ml 0,23 M Tris-Basis und überprüfen Sie mit einem pH-Messgerät auf einen endgültigen pH-Wert von 6,5 ± 0,5. HINWEIS: Die Verwendung von pH-Teststreifen ist eine schnelle und einfache Möglichkeit, den pH-Wert der Reagenzmischung erneut zu bestätigen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 μL 0,25 M HCl hinzu, um die 10 μL Reaktionsmischung anzusäuern, um das Enzym zu inaktivieren, und legen Sie es für 6 min auf Eis. Fügen Sie 1 μL 0,23 M Tris-Base hinzu, um die DNA-Produkte zu neutralisieren, um einen Bruch der AP-Stelle durch längere Säureexposition zu vermeiden. Fügen Sie 13 μL TE hinzu, um das Volumen der Produktmischung für den Matrixchiptransfer zu erhöhen, und legen Sie es dann auf Eis. HINWEIS: Das AP-Produkt ist chemisch instabil und sollte innerhalb von 2 Tagen von MALDI-TOF MS analysiert werden. Nach längerer Lagerung über mehr als eine Woche kommt es aufgrund von β/δ Eliminationsreaktionen der AP-Produkte zu einer Anhäufung eines erheblichen Teils der Strangbrüche (Abbildung 1D-G).</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie alle 25-μL-UDG-Reaktionsprodukte aus Mikrozentrifugenröhrchen auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte. HINWEIS: Hohe Konzentrationen von Kationen, wie Natrium oder Kalium in Puffern, erzeugen Interferenzen in der MALDI-TOF MS-Analyse und erfordern daher eine Entsalzung. Da E. coli UDG-Reaktionspuffer sehr geringe Konzentrationen an Kationen enthält, ist eine Entsalzung nicht notwendig. Modifizieren Sie dieses Protokoll jedoch, um andere DNA-Glykosylase-Reaktionen zu messen, die Metallkationen enthalten, die wie zuvor beschrieben entsalzt werden müssen35.</li>
</ol>3. UDG-Reaktionsprodukte auf einen Matrixchip übertragen
<ol><li>Öffnen Sie die Tür des Nanoliter-Dispensers (siehe Materialtabelle) und laden Sie die 384-Well-Mikrotiterplatte aus Schritt 2.7 auf den Plattenhalter des Decks.</li>
	<li>Setzen Sie das Matrix-Chip-Array in die entsprechende Scout-Plate-Position ein. Legen Sie die geladene Scout-Platte auf das Verarbeitungsdeck des Nanoliter-Spenders und schließen Sie die Tür.</li>
	<li>Berühren Sie die Lauftaste auf dem Transferbildschirm und warten Sie, bis das Gerät mit der Abgabe von Proben von der 384-Well-Mikrotiterplatte an den Matrixchip beginnt.</li>
	<li>Verwenden Sie die Registerkarte Vision, um das Bild des Chips und die Dosiermengen für jede Stelle während der Dosierung anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass das gefleckte Volumen auf dem Chip im Bereich von 5-10 nL liegt.</li>
</ol>4. Richten Sie die Assay-Parameter auf dem Massenspektrometer ein
<ol><li>Verwenden Sie das Anwendungsprogramm (siehe Materialverzeichnis), um eine .xlsx Datei mit dem vorhergesagten Signal-m/z-Wert für den Import vorzubereiten. HINWEIS: Die Einstellungen in DATEI I.xlsx (Tabelle 2) sind Beispieleinstellungen für den UDG-Assay des G:U-Substrats in Abschnitt 2.</li>
	<li>Verwenden Sie das Anwendungsprogramm, um einen neuen UDG-Assay zu erstellen und zu definieren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option Assaygruppe im Designerformat importieren klicken und die .xlsx Datei aus der Dropdown-Liste auswählen (z. B. DATEI I.xlsx aus Schritt 4.1).</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Customer:Project:Plate und klicken Sie oben im Dropdown-Optionsbaum, um eine neue Assay-Platte einzurichten. Geben Sie im Dialogfeld einen Dateinamen ein (z. B. CTT20210620 für den Laborcode und das Assay-Datum), und wählen Sie in der Dropdownliste Plattentyp 384 Vertiefungen den Plattentyp 384 aus , und drücken Sie OK. Suchen Sie nach einer leeren Platte, die auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt wird.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Option Assay . Wählen Sie den Assay (z. B. FILE I.xlsx) aus der Dropdown-Liste aus.</li>
	<li>Um den ausgewählten Assay (z. B. FILE I.xlsx) jeder Probenpunktposition auf der Platte zuzuweisen, bewegen Sie den Cursor an jede Position der leeren Platte, klicken Sie, um den Brunnen zu markieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Plex hinzufügen auszuwählen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Desktop- oder Laptop-Computer, um eine Arbeitsliste im .xlsx Format ohne Kopfzeile (z. B. 0620.xlsx von Tabelle 3) für alle Beispiele auf dem Chip aus Schritt 2.7 vorzubereiten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Beispielprojekt hinzufügen . Wählen Sie die Datei (z. B. 0620.xlsx) aus der Dropdown-Liste aus, um die Arbeitsliste zu importieren.</li>
	<li>Suchen Sie in der Arbeitsliste (z.B. von 0620.xlsx) auf der linken Seite des Bildschirms nach allen Prüfmustercodes. Klicken Sie auf den Beispielcode in der Arbeitsliste, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Position der Platte, um die Tests mit jeder Position zu verknüpfen.</li>
</ol>5. Massenspektrometerbetrieb
<ol><li>Verwenden Sie das Anwendungsprogramm, um das Massenspektrometer (siehe Materialtabelle) mit dem zu analysierenden Probenchip (aus Abschnitt 3) zu verbinden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Standardeinstellung. Geben Sie im Dialogfeld einen Dateinamen aus Schritt 4.3 ein (z. B. CTT20210620); Geben Sie im Feld Testname die Chip-ID in den Chip-Barcode ein und speichern Sie die Einstellungen.</li>
	<li>Starten Sie das Massenspektrometer-Steuerprogramm (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Drücken Sie die In/Out-Taste des Massenspektrometers und lassen Sie das Deck ausfahren. Nehmen Sie den Chiphalter heraus und stecken Sie den Probenchip aus Schritt 3.4 in den Chiphalter. Legen Sie den geladenen Chiphalter auf das verlängerte Deck und drücken Sie die In/Out-Taste, damit der Sample-Chip in das Instrument gelangt.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf das Symbol Erwerben des Anwendungsprogramms. Klicken Sie im Fenster Erfassen auf die Registerkarte Automatisch ausführen , um das Instrument zu starten und Massenspektren von den Proben auf dem Chip zu erfassen.</li>
</ol>6. Massenspektren betrachten und die Daten analysieren
<ol><li>Führen Sie das Datenanalyseprogramm aus (siehe Materialverzeichnis).</li>
	<li>Durchsuchen Sie den Datenbankbaum und wählen Sie die Chip-ID aus Schritt 5.2 aus. Klicken Sie, um eine Zielvertiefung auf dem Chip zu markieren, und klicken Sie auf das Spektrumsymbol , um das Massenspektrum anzuzeigen.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Anpassungsdialog auszuwählen, um einen bestimmten Spektrumbereich in einem neuen Fenster zuzuschneiden. Klicken Sie auf die X-Achse , um die obere und untere Grenze von m / z einzugeben, und drücken Sie OK, um das angegebene Bereichsspektrum einschließlich der interessierenden Signale anzuzeigen. HINWEIS: Die DNA-Menge ist proportional zur Spitzenintensität bei jeder m/z-Werteinheit.</li>
	<li>Messen Sie die Spitzenhöhe der m/z-Werte der Signale, die dem U-Substrat, dem AP-Produkt und der Vorlage entsprechen. Klicken Sie auf den Gipfel und sehen Sie sich die Spitzenhöhe in der oberen linken Ecke des Bildschirms an. HINWEIS: Ein Spektrum von 1.600 Breite / 1.200 Einheit ist eine angemessene Dimension für die Inspektion auf einem Computerbildschirm sowie für die Aufbewahrung von Aufzeichnungen.</li>
	<li>Um das Spektrum für die Aufzeichnung zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren und wählen Sie in der Dropdown-Liste JPEG-Dateityp aus. Klicken Sie auf Ziel und Disc durchsuchen, um das Speichergerät in der Dropdown-Liste auszuwählen (z. B. Flash Disc E:). Geben Sie den Dateinamen ein (z. B. 0620_1-2.jpg) und klicken Sie auf Exportieren.</li>
	<li>Drucken Sie bei Bedarf eine exportierte JPEG-Datei aus und messen Sie die Spitzenhöhe manuell mit einem Lineal.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Papier bietet ein detailliertes Verfahren für die Verwendung einer UDG MALDI-TOF MS-Assay-Methode zum direkten Nachweis von AP-haltigen DNA-Produkten. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass Uracil-haltige Substrate markierungsfrei, skalierbar, einfach zu verarbeiten sind und eine größere Flexibilität im Substratdesign bieten.
Die vom UDG-Lieferanten empfohlene Phenol/Chloroform-Extraktion ermöglicht die Inaktivierung des Enzyms, um den Abbau der Produkt-DNA zu verhindern....

Obwohl Uracil eine normale Base in RNA ist, ist es eine häufige und hochgradig mutagene Läsion in der genomischen DNA. Uracil kann durch spontane/enzymatische hydrolytische Desaminierung eines Desoxycytidins entstehen. In jeder lebenden Zelle tritt diese Desaminierung 100-500 Mal pro Tag unter physiologischen Bedingungen auf1,2. Wenn diese Veränderungen nicht repariert werden, kann es zu einer Veränderung der DNA-Sequenzzusammensetzung kommen, die zu einer Mutation führt. Da Uracil in der DNA es vorzieht, sich während der Replikation mit dATP zu paaren, wenn Cytosin zu Uracil deaminiert, wird es in zwei Replikationsereignissen eine neue G: C zu A: T-Übergangsmutation in der Hälfte der Nachkommen DNA3 geben.
Unter den zellulären Strategien zur Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist die Base Excision Repair (BER) ein wesentlicher Mechanismus, der beschädigte Basen wie Uracil in DNA4 repariert. Der BER ist ein hochgradig evolutionär konservierter Prozess. Es gibt zwei allgemeine BER-Signalwege: den Kurzfeldweg, der zu einem Reparaturtrakt eines einzelnen Nukleotids führt, und den Langfeldweg, der einen Reparaturtrakt von mindestens zwei Nukleotiden erzeugt5. Der BER ist ein koordinierter Mechanismus, der in mehreren Schritten erfolgt. Der erste Schritt im BER ist die enzymatische Hydrolyse der geschädigten Nukleotidbase durch eine schadensspezifische DNA-Glykosylase zur Erzeugung einer apurinisch/apyrimidinischen (AP) Zwischenstelle6. Es folgt die Spaltung des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der AP-Stelle durch eine Endonuklease, die Reinigung der DNA-Endung durch eine Lyase, die Lückenfüllung durch eine DNA-Polymerase und die Versiegelung des letzten Nicks durch eine Ligase5.
Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) hydrolysiert das Uracil aus Uracil-haltiger DNA für BER in Escherichia coli. Herkömmliche UDG-Assays mit radioaktiv markierter DNA mit unterschiedlichen Trenntechniken6,7,8,9,10,11,12,13 sind in der Regel zeitaufwendig, arbeitsintensiv, mit kostspieligen Markierungsreagenzien, komplizierten Verfahren und erfordern intensive Schulungen und Übungen, um das Risiko einer Exposition gegenüber radioaktiven Stoffen zu reduzieren. Fluorometrische Oligonukleotid-Assays wurden als Ersatz für die Radioisotopenmarkierung14 entwickelt, zusätzlich zu molekularen Beacons und Förster-Resonanzenergieübertragungstechnologie15,16,17,18,19,20. Für alle oben genannten Methoden ist jedoch eine spezifische Kennzeichnung erforderlich. Kürzlich wurden markierungsfreie Biosensor-Assays21,22,23 und kolorimetrische Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines G-Quadruplex24,25,26 basieren. Mehrere A:U-Paare oder speziell entwickelte Sequenzen in den Sonden erschweren jedoch die Definition der Enzymeinheit.
MALDI-TOF MS ist eine Technologie, die bei der DNA-Analyse von großem Nutzen sein könnte. Zu den entwickelten Anwendungen gehören die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung27,28, die modifizierte Nukleotidanalyse29 und die DNA-Reparatur-Zwischenidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS sollte leicht für die DNA-Glykosylase-Analyse eingesetzt werden, um AP-Site-haltige DNA-Produkte nachzuweisen. AP-Stellen in der DNA sind jedoch unter vielen experimentellen Bedingungen anfällig für Strangbrüche33. Hier wird ein UDG-Assay vorgestellt, der MALDI-TOF MS verwendet, um die AP-Standortproduktion ohne signifikantes Strangbruchrauschen direkt zu messen. Diese markierungsfreie Methode ist einfach zu bedienen und hat ein hohes Potenzial für die pharmazeutische Anwendung des DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screenings.

<table><tbody><tr><td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol (Trisbase)</td><td>J.T Baker</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Autoklaviertes deionisiertes Wasser</td><td>MILLIPORE</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T Baker</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>AQUAGLOVE</td><td></td><td>Protokoll 1,2,3</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit geringer Retention (0,5-10 & Mikro; L)</td><td>zusätzliches Gen</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit niedriger Retention (1.250 & Mikro; L)</td><td>national scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit geringer Retention (200 & Mikro; L)</td><td>national scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td></td><td>Protocol 4, 5 Zu den Steuerungsprogrammen für die Massenspektrometrie gehören Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE und Start RT Process.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td>RS1000</td><td>Protokoll 3</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Kubota</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Clubio</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)</td><td>National scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Röhrchengestell</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipette&nbsp; (P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipette&nbsp; (Seite 2)</td><td>Gilson-Protokoll</td><td></td><td>1,2-Mikropipette</td></tr><tr><td>(P10)</td><td>Gilson-Protokoll</td><td></td><td>1,2-Mikropipette</td></tr><tr><td>(P100)</td><td>Gilson-Protokoll</td><td></td><td>1,2-Mikropipette</td></tr><tr><td>(P200)</td><td>Gilson-Protokoll</td><td></td><td>1,2-Mikropipette</td></tr><tr><td>(SL2)</td><td>Rainin-Protokoll</td><td></td><td>1,2-Oligonukleotide</td></tr><tr><td></td><td>Integrierte DNA-Technologien (Singapur)</td><td></td><td>Protokoll 1,2</td></tr><tr><td>Quest Graph IC50 Taschenrechner (v.1)</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td></td><td>Abb. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>WAKO</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>SpectroCHIP-Array</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td>Protokoll 3, 5</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Typer 4.0 Software</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td>Protocol 6 Typer 4.0 besteht aus vier Programmen, darunter Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor und Typer Analyzer.</td></tr><tr><td>UDG-Reaktionspuffer (10x)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B0280S</td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Uracil-Glykosylase-Hemmer</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0281S</td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>Uracil-DNA-Glykosylase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0280L</td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>UV-VISBLE-Spektralphotometer UV-1601</td><td>SHIMADZU</td><td></td><td>Protokoll 1</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>ZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc)</td><td></td><td>Protokoll 2</td></tr></tbody></table>

uracil-dna-glykosylase-assay durch matrixgestützte laserdesorption/ionisations-time-of-flight-massenspektrometrie-analyse

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) ist eine Schlüsselkomponente im Reparaturweg der Basenexzision zur Korrektur von Uracil, das durch hydrolytische Desaminierung von Cytosin gebildet wird. Daher ist es entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität. Zur Messung der UDG-Aktivität wurde eine hochspezifische, nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode entwickelt. Ein synthetisches DNA-Duplex, das ein ortsspezifisches Uracil enthielt, wurde von UDG gespalten und dann einer matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (MALDI-TOF MS) unterzogen. Es wurde ein Protokoll erstellt, um das Produkt der apurinischen / apyrimidinischen Stelle (AP) in der DNA ohne Strangbruch zu erhalten. Die Änderung des m/z-Wertes vom Substrat zum Produkt wurde genutzt, um die Uracilhydrolyse mittels UDG zu bewerten. Für die kinetische UDG-Analyse wurde ein G:U-Substrat verwendet, das Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s und Kcat = 9,31 s-1 ergibt. Die Anwendung dieser Methode auf einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI)-Assay ergab einen IC50-Wert von 7,6 pM. Die UDG-Spezifität unter Verwendung von Uracil an verschiedenen Positionen innerhalb von einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Substraten zeigte unterschiedliche Spaltungseffizienzen. Somit könnte diese einfache, schnelle und vielseitige MALDI-TOF MS-Methode eine ausgezeichnete Referenzmethode für verschiedene monofunktionelle DNA-Glykosylasen sein. Es hat auch das Potenzial als Werkzeug für das DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screening.

Schablonen und Substrate Am Beispiel synthetischer Oligonukleotide mit U in der Mitte (U+9) gepaart mit einer G-Schablone (Abbildung 1A) kann eine Leerkontrolle der äquimolaren Mengen an Schablone und Uracil-haltigem Substrat zur Qualitätskontrolle der Reinheit synthetischer Oligonukleotide verwendet werden (Abbildung 1B; die Signale stimmen mit dem angegebenen m/z und dem geringen Hintergrundrauschen überein). Für die MS-Datenanalyse wurden ...

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA-Reparaturmechanismen sind sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität in allen lebenden Organismen. Uracil-DNA-Glykosylase ist ein entscheidendes DNA-Reparaturprotein im grundlegenden Gewebereparaturweg. Mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie können wir das AP-Produkt für den Enzymaktivitätsassay direkt nachweisen.Der konventionelle Glykosylase-Assay erfordert Substratarbeit. Diese Methode ist markierungsfrei und erkennt direkt die Massenänderung von einem Uracil-Substrat zu einem AP-Produkt. Weitere Vorteile sind hohe Spezifität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit, Schnelligkeit und einfache Leistung.Wir haben E.coli Uracil-DNA-Glykosylase als Beispiel verwendet. Diese Methode kann leicht für andere DNA-Glykosylase-Assays modifiziert werden. Gut ausgebildetes Laborpersonal mit genauen Pipettier- und Verdünnungsfähigkeiten ist unerlässlich.Frisch zubereitete Reagenzien und salzarme Puffer sollten für bessere Signale und weniger Hintergrundgeräusche verwendet werden. Demonstrieren wird das Verfahren von Hui-Lan Chang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Für einen DNA-Glykosylase-Assay unter Verwendung eines Guanin-Uracil-basentragenden Substrats aus T1 U+9-Duplex fügen Sie 70 Mikroliter Wasser, 10 Mikroliter 10-fachen Uracil-DNA-Glykosylase- oder UDG-Reaktionspuffer, fünf Mikroliter T1-Stamm und fünf Mikroliter U+9-Stamm in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.Schließen Sie die Röhre, bevor Sie sie in einem Wasserbad für 30 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schließlich auf Eis für drei Minuten, um ein ordnungsgemäßes Glühen der Substratschablone Duplex zu gewährleisten. Als nächstes fügen Sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 49 Mikroliter eiskalten UDG-Reaktionspuffer und einen Mikroliter verdünntes UDG hinzu, bereiten dann serielle Verdünnungen mit dem UDG-Puffer für die gewünschten Enzymkonzentrationen vor und legen das verdünnte UDG auf Eis. Als nächstes fügen Sie in einem weiteren 1,5-Milliliter-Röhrchen neun Mikroliter der vorbereiteten Substratmischung hinzu und wärmen sie bei 37 Grad Celsius vor, fügen dann einen Mikroliter des verdünnten UDG hinzu und streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen.Das Reaktionsgemisch kurz zentrifugieren und das Röhrchen sofort zur Inkubation bei 37 Grad Celsius platzieren. Verwenden Sie den Timer, um die Reaktion zu timen. Für den Reaktionsabschluss werden 0,25 molare Salzsäure und 0,23 molare Tris-Basenlösung hergestellt.Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert bei der Herstellung des Reagenzes und der Prüfung mit dem pH-Streifen zu bestätigen, bevor Sie den Reaktionsabschlussschritt ausführen, dann 10 Mikroliter Tris-EDTA mit einem Mikroliter 0,25 molare Salzsäure ansäuern und sicherstellen, dass der pH-Wert etwa zwei plus oder minus 0,5 beträgt. Neutralisieren Sie die Lösung mit einem Mikroliter Tris-Base und stellen Sie sicher, dass der endgültige pH-Wert etwa 6,5 plus oder minus 0,5 beträgt. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 0,25 molare Salzsäure zu der Reaktionsmischung hinzu, um das Enzym zu inaktivieren, und legen Sie die Röhre für sechs Minuten auf Eis, dann fügen Sie einen Mikroliter Tris-Base hinzu, um die DNA-Produkte zu neutralisieren und einen Bruch der AP-Stelle durch längere Säureeinwirkung zu vermeiden.Nachdem Sie 13 Mikroliter Tris-EDTA hinzugefügt haben, um das Volumen der Produktmischung für den Matrixchiptransfer zu erhöhen, legen Sie die Tube auf Eis. Übertragen Sie schließlich alle 25-Mikroliter-UDG-Reaktionsprodukte aus Mikrozentrifugenröhrchen auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte. Öffnen Sie die Tür des Nanoliter-Spenders und laden Sie die 384-Well-Mikrotiterplatte auf den Plattenhalter des Decks, dann setzen Sie das Matrix-Chip-Array in die entsprechende Scout-Plattenposition ein.Legen Sie die geladene Scout-Platte auf das Verarbeitungsdeck des Nanoliter-Spenders und schließen Sie die Tür. Berühren Sie die Ausführungstaste auf dem Übertragungsbildschirm und warten Sie, bis das Gerät mit der Abgabe von Proben von der Mikrotiterplatte an den Matrixchip beginnt. Als nächstes zeigen Sie mit der Option Vision Tab das Bild des Chips und die Dosiervolumina für jede Stelle während der Dosierung an.Stellen Sie sicher, dass das gefleckte Volumen auf dem Chip im Bereich von fünf bis 10 Nanolitern liegt. Bereiten Sie mit dem entsprechenden Anwendungsprogramm eine xlsx-Datei mit dem vorhergesagten Signalwert M by Z für den Import vor. Verwenden Sie dann das Anwendungsprogramm, um einen neuen UDG-Assay zu erstellen und zu definieren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option Assaygruppe im Designerformat importieren klicken und die Excel-Datei aus der Dropdown-Liste auswählen.Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Kundenprojektplatte und klicken Sie oben im Dropdown-Optionsbaum, um eine neue Assay-Platte einzurichten. Geben Sie dann im Dialogfeld einen Dateinamen ein. Wählen Sie im Dropdown-Menü Plattentyp den Plattentyp mit 384 Vertiefungen aus.Drücken Sie OK und warten Sie, bis rechts auf dem Bildschirm eine leere Platte angezeigt wird. Klicken Sie anschließend auf die Assay-Option und wählen Sie den Assay aus der Dropdown-Liste aus. Um den ausgewählten Assay jeder Position des Probenflecks auf der Platte zuzuweisen, bewegen Sie den Cursor an jede Position der leeren Platte, klicken Sie, um den Brunnen zu markieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Plaketten hinzufügen auszuwählen.Bereiten Sie mit einem Desktop- oder Laptop-Computer eine Arbeitsliste im xlsx-Format ohne Header für alle Proben auf dem Chip vor, klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neues Beispielprojekt hinzufügen und wählen Sie die Datei aus der Dropdown-Liste aus, um die Arbeitsliste zu importieren. Suchen Sie nach allen Testbeispielcodes in der Arbeitsliste auf der linken Seite des Bildschirms, klicken Sie dann auf einen Beispielcode in der Arbeitsliste und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Position der Platte, um die Tests mit jeder Position zu verknüpfen. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste des Massenspektrometers, um das Deck auszufahren und den Chiphalter herauszunehmen.Stecken Sie den Probenchip in den Chiphalter, legen Sie den geladenen Chiphalter auf das verlängerte Deck und drücken Sie die Ein-/Aus-Taste erneut, damit der Probenchip in das Instrument gelangt. Doppelklicken Sie im Massenspektrometer-Steuerungsprogramm auf das Erfassungssymbol. Klicken Sie im Erfassungsfenster auf die Registerkarte Auto-Run, um das Instrument zu starten und Massenspektren aus den Proben auf dem Chip zu erfassen.Führen Sie für die Datenanalyse das Datenanalyseprogramm aus, durchsuchen Sie dann den Datenbankbaum und wählen Sie die Chip-ID aus.Klicken Sie, um eine Zielvertiefung auf dem Chip zu markieren, und klicken Sie auf das Spektrumsymbol, um das Massenspektrum anzuzeigen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das Anpassungsdialogfeld auszuwählen und einen bestimmten Spektrumbereich in einem neuen Fenster zuzuschneiden, klicken Sie dann auf die x-Achse, um die oberen und unteren Grenzen von M by Z einzugeben, und drücken Sie OK, um das angegebene Bereichsspektrum einschließlich der interessierenden Signale anzuzeigen. Um die Spitzenhöhe der Signale M by Z-Werte zu messen, die dem Uracil-Substrat, dem AP-Produkt und der Vorlage entsprechen, klicken Sie auf den Peak und sehen Sie sich die Peakhöhe in der oberen linken Ecke des Bildschirms an.Um das Spektrum für die Aufzeichnung zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren und wählen Sie in der Dropdown-Liste Dateityp als JPEG aus. Klicken Sie auf Ziel und durchsuchen Sie die Festplatte, um das Speichergerät in der Dropdown-Liste auszuwählen, geben Sie dann den Dateinamen ein und klicken Sie auf Exportieren. Hier wird das Modellsystem für einen DNA-Glykosylase-Assay gezeigt.Die 19 Nukleotid-Template-DNA blieb nach der Glykosylase-Hydrolyse unverändert. Daher könnte das Signal als Referenz für die Quantifizierung des AP-Produkts dienen. Die Differenz eines Nukleotids zwischen dem Substrat und der entsprechenden Schablone ergab für beide ein gut getrenntes Signalprofil.Auch das Signal des AP-Produkts war gut von dem des Uracil-haltigen Substrats getrennt. Für die MS-Datenanalyse wurden die Spitzenhöhen gemessen. Die Zeitverlaufsanalyse für die UDG-Aktivität bei 0,01, 0,02, 0,05 und 0,1 zeigte sowohl Dosis- als auch Zeitabhängigkeit.Ein Beispiel für die Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit mit relativen MS-Signalintensitäten des Produkts und des Substrats in nanomolaren Konzentrationen ist hier dargestellt. Die UDG-Reaktionsgeschwindigkeit wird als Nanomol der pro Sekunde produzierten AP-Stelle dargestellt. KM und VMAX wurden aus dem Lineweaver Burk-Diagramm berechnet.Die gemessene Einheit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie war proportional zur definierten Einheit von 0,001 Einheiten bis 0,02 Einheiten mit einem nennenswerten Bestimmtheitskoeffizienten. Hier wird die Hemmung der UDG-Aktivität durch einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor gezeigt. In Gegenwart von 100 Picomolen des Inhibitors wurde die Aktivität von 0,05 Einheiten UDG auf ein nicht nachweisbares Niveau gehemmt und der IC50 wurde als 7,6 Picomolen befunden.Da die AP-Größe labil ist und durch eine Beta-Eliminationsreaktion bei extremem pH-Wert und erhöhter Temperatur hydrolysiert werden kann, sollte die Assay-Abschreckung für den definierten Zeitraum auf Eis durchgeführt werden. Verwenden Sie auch ein pH-Messgerät, um sicherzustellen, dass HCL den Reaktionspuffer auf den gewünschten pH-Wert ansäuert und Tris-Base die Produktmischung richtig neutralisiert. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um die bifunktionelle DNA-Glykosylase zu analysieren.Zum Beispiel ist U+2 T3 ein geeignetes Substrat für den Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase-Assay. Die Spaltprodukte der FPG AP-Ligaseaktivität können leicht durch MALDI-TOF-Masse nachgewiesen werden. Diese Methode hat das Potenzial, die Referenzmethode für die monofunktionelle Glykosylasemessung zu werden und kann auch als Werkzeug für das Glykosylase-Inhibitor-Screening für die pharmazeutische Entwicklung verwendet werden.

uracil-dna-glycosylase-assay-matrix-assisted-laser

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Urease-Methode der Probenvorbereitung für die GC / MS-Analyse der Vermittler Metaboliten von seinem Erfinder vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht in einem Schritt Follow-up der Neugeborenen-Screening auf angeborene Störungen durch Tandem-Massenspektrometrie durch Quantifizierung Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren alle in einem einzigen Prozess.

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Ein Molekularstrahl gekoppelt abstimmbaren Vakuum-Ultraviolett-Photoionisation Massenspektrometer an einem Synchrotron bietet ein geeignetes Werkzeug für die elektronische Struktur von isolierten Gasphase Molekülen und Clustern zu erkunden. Proton Transfer-Mechanismen in DNA-Base Dimere wurden mit dieser Technik aufgeklärt.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur DNAzyme-abhängigen Spaltung der RNA vor. Dies ermöglicht eine schnelle und standortabhängige Analyse der RNA 2'-O-Methylierung. Dieser Ansatz kann für die vorläufige oder größere Bewertung der SnoRNA-Aktivität verwendet werden.

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Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

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Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Freisetzung von O-Glykanen aus Muzinen und die anschließende Entsalzung, Permethylierung und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie vor.

Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Erfahren Sie einen markierungsfreien Assay zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die direkte Detektion von AP-Stellen-Produkten mit hoher Spezifität.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

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