Sammlung, Expansion und Differenzierung primärer humaner Nasensepithelzellmodelle zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz

Wir beschreiben die Entnahme von Atemwegsstammzellen aus der Nasenschleimhaut. Diese Zellen werden im Labor zu einem pseudogeschichteten Epithel expandiert und differenziert. Dies ist eine In-vitro-Expansion und -Differenzierung, die unseren Atemwegen in vivo ähnelt, was bedeutet, dass spezialisierte Zellen wie Flimmerzellen vorhanden sind, die zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz verwendet werden können.

Um eine konsistente und reproduzierbare Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz zwischen verschiedenen Individuen und als Reaktion auf verschiedene Medikamente zu ermöglichen, standardisieren wir Kulturbedingungen und Bildaufnahme. Zilienschlagfrequenzmessungen werden als klinische Werkzeuge bei Erkrankungen wie primärer Ziliardyskinesie eingesetzt. Wir hoffen, dies als klinischen Marker für Mukoviszidose zu etablieren.

Katelin Allan und Laura Fawcett, Doktorandinnen aus meinem Labor, und Dr. Sharon Wong, Postdoc aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Beginnen Sie damit, den Teilnehmer zu bitten, durch den Mund zu atmen. Nehmen Sie dann einen Zytologiepinsel in die dominante Hand und legen Sie die fünfte Ziffer auf das Kinn des Teilnehmers, um die Hand zu verankern, führen Sie die Zytologiebürste in den Nasengang des Teilnehmers in einem 45-Grad-Winkel zum Gesicht des Teilnehmers ein und führen Sie ihn durch den Nasengang.

Nachdem Sie die Bürste aufrecht gedreht haben, so dass sie senkrecht zum Gesicht des Teilnehmers steht, bewegen Sie die Bürste sanft, aber fest gegen die seitliche Wand der Nase unter dem unteren Nasenmuscheln, bis sie sich in der Mitte bis zum hinteren Teil der unteren Nasenmuschel befindet. Drehen Sie die Bürste bis zu dreimal um 360 Grad. Entfernen Sie es dann vorsichtig und kehren Sie das Einführmanöver um, damit sich die Zellen nicht von der Bürste lösen.

Legen Sie die Bürste in das vorbereitete Sammelröhrchen mit Nasenzellensammelmedien und legen Sie das Auffangröhrchen auf Eis. Nach einem sanften Wirbeln, um die Zellen von der Bürste zu entfernen, wird das Auffangrohr auf Eis zurück in die Biosicherheitswerkbank überführt. Übertragen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus dem Sammelröhrchen in ein neues Röhrchen und lassen Sie die Zytologiebürsten zurück.

Dann zentrifugieren Sie die Probe. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter bedingt reprogrammierender Zellmedien. Dann führen Sie die Zellen mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette in kreisförmiger Bewegung durch ein Zellsieb, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.

Um eine einzellige Suspension zu erhalten, sammeln Sie die Suspension vom Boden des Röhrchens und führen Sie sie mehrmals durch das Sieb. Dann das Zellsieb verwerfen. Um die Atemwegsepithelzellen auf die vorbereiteten permeablen Stützeinsätze zu impfen, mischen Sie die Zellen gut, ohne Blasen zu erzeugen, und stellen Sie sicher, dass sie homogen und in Suspension sind.

Dann werden 150 Mikroliter der Zellsuspension auf die apikale Seite der vorbereiteten permeablen Stützeinsätze gegeben. Um die Epithelzellen der Atemwege an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu differenzieren, kultivieren Sie sie zwei Tage lang in Differenzierung oder ALI-Medien. Dann saugen Sie das Medium ab und fügen Sie 750 Mikroliter ALI-Medien nur in das Basalfach hinzu, um eine Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle zu erzeugen.

Um die Atemwegsepithelzellen in ECM-Kuppeln zu säen, resuspendieren Sie dissoziierte Atemwegsepithelzellen mit dem entsprechenden Volumen von 90% ECM. Halten Sie dann die Pipette vertikal in einem 90-Grad-Winkel so nah wie möglich am Boden des Bohrlochs und geben Sie 50 Mikroliter der ECM-Zellsuspension in die Mitte des Bohrlochs ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten, bis die ECM erstarrt.

Während sich das ECM verfestigt, erwärmen Sie das Organoid Seeding Media (AOSM) der Atemwege auf Raumtemperatur, um zu verhindern, dass es zu einer erneuten Verflüssigung und zum Zerfall der ECM-Kuppel bei Zugabe kommt. Fügen Sie nach der Inkubation 500 Mikroliter erwärmtes AOSM in jede Vertiefung hinzu, indem Sie die Wand des Bohrlochs abgeben. Pipettieren Sie Medien nicht direkt auf die ECM-Kuppel.

Wechseln Sie die Medien alle zwei Tage für vier bis sieben Tage. Um das Medium abzusaugen, neigen Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel und saugen Sie von der Unterkante des Bohrlochs von der ECM-Kuppel weg. Beginnen Sie nach vier bis sieben Tagen die Organoiddifferenzierung, indem Sie 500 Mikroliter erwärmtes Atemwegs-Organoid-Differenzierungsmedium (AODM) zu jeder Vertiefung hinzufügen und sieben Tage lang alle zwei Tage das Medium wechseln.

Legen Sie die Kulturplatte mit den Atemwegepithelzellmodellen in den Einsatz der Mikroskopplatte und schließen Sie die Mikroskop-Klimakammer. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang in der vorgewärmten, mit 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gefüllten Mikroskopkammer bahibieren. Am Mikroskopokular fokussieren Sie sich auf das Zellmodell.

Klicken Sie dann mit der Erfassungssoftware auf L100, um den Lichtpfad zu dem Anschluss zu wechseln, an dem die Kamera montiert ist. Klicken Sie auf den grünen Play-Button, um das Sichtfeld des Mikroskops über die Software zu visualisieren. Überprüfen Sie, ob die Zilien scharf sind, und passen Sie sie bei Bedarf an.

Um Zeitrafferbilder aus dem Menü zu erfassen, klicken Sie auf Erfassen und dann auf Schneller Zeitraffer. Wählen Sie im Popup-Fenster einen Speicherort und einen Dateinamen aus, um 1.000 Frames zu erfassen. Um eine Vorschau der Zilien im Sichtfeld des Mikroskops anzuzeigen, klicken Sie auf Übernehmen, gefolgt von der grünen Play-Taste.

Passen Sie bei Bedarf den Z-Fokus an. Klicken Sie dann auf Jetzt ausführen, um den Fast TimeLapse aufzunehmen. Kopieren Sie nach der Installation der erforderlichen Software und Toolboxes die entsprechenden benutzerdefinierten Analyseskripts und den Ordner für Supportskripts auf das lokale Laufwerk des Computers.

Klicken Sie anschließend in der Computersoftware auf die Registerkarte Home und anschließend auf Set Path. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Mit Unterordnern hinzufügen. Wählen Sie unter dem MATLAB-Suchpfad den angezeigten Ordner aus.

Klicken Sie dann auf Speichern und schließen. Vergewissern Sie sich, dass die Analyseskripte mit der Computersoftware verknüpft sind, indem Sie überprüfen, ob sie im linken Bereich angezeigt werden. Übertragen Sie als Nächstes die abgerufenen RAW-Image-Beispieldateien auf das lokale Laufwerk des Computers.

Klicken Sie dann auf die BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. M-Analyseskriptdatei in der Computersoftware. Um das Skript auszuführen, klicken Sie auf die Registerkarte Editor, gefolgt von der grünen Schaltfläche Play.

Wählen Sie im angezeigten Eingabeaufforderungsfenster die zu analysierenden Rohbilddateien aus. Geben Sie die Belichtungszeit für die Aufnahmezeit pro Bild ein. Klicken Sie dann auf OK. Führen Sie GetFirstAmplitude aus.

m Skript für den Ordner, der die AveSpectrum-Dateien enthält. Warten Sie, bis das Skript FirstAmplitudeStacked ausgegeben hat. XLSX-Datei, die die höchste Amplitudenfrequenz enthält und sich im physiologischen Bereich der Atemwegepithelzilienschläge befindet.

Kopieren Sie die Frequenzwerte aus FirstAmplitudeStacked. xlsx-Datei und plotten Sie sie mit wissenschaftlicher Analysesoftware. Die Ergebnisse der Zilienschlagfrequenz, gemessen in Atemwegsepithelzell-ALI-Modellen, die von drei Teilnehmern mit Mukoviszidose und drei gesunden Kontrollteilnehmern abgeleitet wurden, werden vorgestellt.

Am Tag 14 der Kulturdifferenzierung waren schlagende Zilien anwesend. Ab Tag 14, Tag 21 der Kulturdifferenzierung wurde kein statistisch signifikanter Anstieg der Zilienschlagfrequenz zwischen den Kohorten beobachtet. Am Tag 21 der Kulturdifferenzierung war die mittlere Zilienschlagfrequenz für gesunde Kontrollteilnehmer signifikant höher als die von Teilnehmern mit Mukoviszidose.

Wenn die Schlagfrequenz der Zilien in den gleichen Zellmodellen nach der Entfernung von Schleim abgebildet wurde, gab es einen statistisch signifikanten Anstieg der Zilienschlagfrequenz, wenn Schleim in ALI-Modellen sowohl von gesunden Personen als auch von Personen mit Mukoviszidose entfernt wurde. Die Bildgebungsumgebung muss streng reguliert werden, da die Zilienfunktion extrem anfällig für Veränderungen der Umweltfaktoren ist. Diese Plattform hat das Potenzial, für ein patientenspezifisches Medikamentenscreening eingerichtet zu werden, um Medikamente identifizieren zu können, die die CFTR-Funktion modulieren.