Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Diese Methode ermöglicht es den Forschern, optimale Elektroporationspulsbedingungen für den gewünschten Zelltyp zu bestimmen und gleichzeitig den Bedarf an dem traditionellen empirischen experimentellen Ansatz zu minimieren. Diese Methode verwendet Mikroelektroporationstechniken, um eine skalierbare mikrofluidische Betätigungsvorrichtung herzustellen, die in der Lage ist, den Grad der Zellmembranpermeabilisierung während des gesamten Elektroporationsprozesses elektrisch zu überwachen. Das Verfahren wird von Kishankumar Busha, einem Masterstudenten aus meinem Labor, demonstriert.

Um zu beginnen, befestigen Sie den Siliziumwafer mit dem Vakuumsystem des Spin-Coaters am Chuck des Wafer-Spin-Coaters. Dann programmieren Sie den Spinner. Als nächstes geben Sie vier Milliliter SU-8 2010 Fotolack auf die Mitte des Siliziumwafers und führen das Programm aus.

Sobald das System zum Stillstand kommt, schalten Sie das Vakuum aus. Befestigen Sie dann die Fotomaske mit den mikrofluidischen 2D-Kanaldesigns auf dem Maskenhalter und legen Sie den Siliziumwafer mit der SU-8-Beschichtung nach oben auf das Waferfutter. Stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf 150 Millijoule pro Quadratzentimeter ein und lassen Sie das Gerät laufen.

Nach der UV-Bestrahlung tauchen Sie den Siliziumwafer mit sanftem Rühren für drei bis vier Minuten in die SU-8-Entwicklerlösung. Entfernen Sie dann den Wafer aus der Lösung und spülen Sie die Oberfläche mit Isopropanol ab. Als nächstes legen Sie den Siliziumwafer für 30 Minuten in einen 150 Grad Celsius heißen Ofen für ein hartes Backen.

Lassen Sie es dann auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Stiftprofilometrie verwenden, um die genaue Höhe und Neigung der Seitenwände des Kanals zu messen. Als nächstes geben Sie einen Milliliter Fotolack auf die Oberfläche des Glasobjektträgers und führen das Programm erneut aus. Sobald das System zum Stillstand kommt, schalten Sie das Vakuum aus und entfernen Sie den Glasschieber.

Nachdem Sie die Fotomaske mit den 2D-Elektrodendesigns auf dem Maskenhalter befestigt haben, setzen Sie den Glaswafer mit der S-1818-Beschichtung nach oben auf das Waferfutter ein und richten Sie es aus. Stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf 215 Millijoule pro Quadratzentimeter ein und lassen Sie die Maschine laufen. Nach der Belichtung tauchen Sie den Objektträger für zwei Minuten in MF-319 Entwicklerlösung und rühren Sie sanft an.

Entfernen Sie dann den Glaswafer und spülen Sie seine Oberfläche mit entionisiertem Wasser. Zum Schluss legen Sie den Glasschieber für ein hartes Backen in den 150-Grad-Ofen und stellen Sie sicher, dass die interessierende Oberfläche der Substrate nach oben zeigt. Nach 30 Minuten den Objektträger aus dem Ofen nehmen und vor Licht schützen.

Um den Glasobjektträger zu ätzen, tauchen Sie ihn für eine Minute in eine 10 zu 1 gepufferte Flusssäurelösung in einem Polytetrafluorethylenbehälter. Anschließend die Glasobjektträger dreimal in entionisiertem Wasser eintragen und waschen. Als nächstes wird Titan mit einem physikalischen Gasphasenabscheidungssystem acht Minuten lang mit einer Rate von 100 Angström pro Minute und Platin für 10 Minuten mit 200 Angström pro Minute gestottert.

Um dann den Fotolack abzuheben, tauchen Sie die metallbeschichteten Glasdias für 10 Minuten in ein Acetonbad und beschallen Sie das Bad, um Bewegung einzuleiten. Verwenden Sie bei Bedarf ein mit Aceton getränktes Tuch, um Rückstände zu entfernen. Als nächstes für Polydimethylsiloxan Replikat Formgebung macht die PDMS-Elastomerbasis mit einem Härter in einem 10 zu 1 Gewichtsverhältnis in einem Einwegbehälter auf einer elektronischen Waage platziert.

Gießen Sie dann die PDMS-Lösung über den Siliziumwafer und stellen Sie die Mischung unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. Nachdem Sie die Mischung mindestens vier Stunden bei 65 Grad Celsius ausgehärtet haben, schneiden Sie das geformte PDMS mit der Spitze einer Rasierklinge aus und ziehen Sie es vom Siliziumwafer ab. Entfernen Sie dann mit einem geschärften Biopsiestempel das PDMS aus dem Einlass und den Auslässen des Geräts.

Als nächstes programmieren Sie den Plasmagenerator für das PDMS-Bonding. Legen Sie dann den PDMS- und Elektrodenglasschieber mit den Funktionen nach oben in das System und führen Sie das Programm aus. Entfernen Sie nach Abschluss des Programms die Geräte und verwenden Sie ein Stereoskop, um die Kanalmerkmale schnell an den Elektroden auszurichten.

Üben Sie festen Druck von der Mitte des PDMS zu den Seiten aus, um unerwünschte Luftblasen an der Klebeschnittstelle zu entfernen. Ernten Sie die HEK293-Zellen, zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet im Elektroporationspuffer bei etwa fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Als nächstes fügen Sie Plasma-DNA, die für GFP kodiert, zu einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie vorsichtig.

Dann wird die Plasma-DNA-Zellsuspension zum Experimentieren in eine Ein-Kubikzentimeter-Spritze überführt. Stellen Sie das Mikrogerät über einen Objektträgerhalter auf den Tisch des Mikroskops. Schalten Sie dann das geladene gekoppelte Gerät, die CCD-Kamera, ein und bringen Sie den mikrofluidischen Kanal in den Fokus.

Als nächstes stellen Sie für die Einzelzellenelektroporation die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 0,1 bis 0,3 Mikroliter pro Minute ein, um den Fluss einzelner Zellen durch den Elektrodensatz sicherzustellen. Stellen Sie dann die Pulsparameter für den anfänglichen und niedrigsten elektrischen Energieelektroporationsimpuls ein. Folgen Sie einer vorgegebenen Anzahl von Zelldetektionen pro Pulsanwendung.

Am Ende jedes getesteten Zustands saugen Sie die Zellen aus dem Mikrogeräteauslass ab und füllen Sie den Auslass mit Wiederherstellungsmedien auf. Iterieren Sie zur nächsten Elektroporationspulsbedingung und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Elektroporationspulsbedingungen getestet sind. Bestimmen Sie dann die Elektroporationspulsparameter für eine populationsbasierte Rückkopplung mit hohem Durchsatz.

Für eine populationsbasierte rückkopplungsgesteuerte Elektroporation stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf ein bis drei Mikroliter pro Minute ein und stellen Sie die Pulsamplitude auf den optimierten Zustand ein. Schalten Sie dann den Triggermodus aus und stellen Sie die Pulsbreite an die Sendezeit der Zelle an. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen galoppiert wurde, schalten Sie sowohl die Spritzenpumpe als auch den Funktionsgenerator aus.

Anschließend werden die Zellen aus dem Auslassreservoir in einen Zellkulturkolben oder eine mit vorgewärmtem Auffangmedium gefüllte Zellkulturflasche oder -platte überführt und der Kulturkolben oder die Kulturplatte in einen Inkubator überführt. Laden Sie für die Datenanalyse die Daten in eine Analysesoftware und generieren Sie für jede pulsierende Bedingung ein Diagramm des Stroms über die Zeit. Bestimmen Sie dann den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran, erstellen Sie die Permeabilisierungskarte der Zellmembran über alle getesteten Pulsbedingungen und überprüfen Sie die optimale Pulsbedingung.

Nach der Inkubation nehmen Sie Epifluoreszenzbilder mit FITC und fernroten Filtern auf und analysieren die Bildsätze manuell oder über einen Algorithmus. Die Funktionsprinzipien hinter der Permeabilisierungsdetektion auf Einzelzellebene für eine einzelne Pulsamplitude werden hier hervorgehoben. Nach jedem Elektroporationspulsparameter wird der nächsthöhere Energie-Elektroporationspuls getestet.

Die Permeabilisierungskarte der Zellmembran für HEK293-Zellen zeigte eine deutliche Korrelation zwischen der angelegten elektrischen Energie und dem Grad der Permeabilisierung der Zellmembran. In diesem Experiment wurde eine elektrische Feldstärke von 1,8 Kilovolt pro Zentimeter und ein 670-Mikrosekunden-Puls als optimal bestimmt. Bei diesen Werten wurde ein Elektrotransfektionswirkungsgrad von 70% erreicht.

Im Gegensatz zu einer elektrischen Feldstärke von 0,4 Kilovolt pro Zentimeter und einer Pulsdauer von drei Millisekunden betrug die Elektrotransfektionseffizienz nach 24 Stunden weniger als 5%Der Begriff Rezept, der oft verwendet wird, um die spezifischen des Mikrofabrikationsprozesses zu beschreiben, fügt die Wichtigkeit ein, jeden Schritt zu befolgen oder zu optimieren, um ein funktionierendes Gerät erfolgreich herzustellen. Diese Elektroporationstechnologie kann in weiteren biomedizinischen Forschungsprojekten wie der Erzeugung und Erprobung von CAR-T-Zellen oder der Optimierung und Erprobung von CRISPR-Cas9-Gen-Editing-Techniken eingesetzt werden. Diese Mikroelektroporationstechnologie ermöglicht die elektrische Abfrage der Reaktionen verschiedener Zelltypen, um die elektrischen Pulsbedingungen anzuwenden und diese Informationen mit der Abgabe klinisch relevanter molekularer Fracht zu korrelieren.