Name: Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a visualizar la matriz extracelular hepática en 3D mediante perfusión in situ y microscopía de dos fotones en un modelo de ratón con esteatohepatitis no alcohólica. Este método optimizado permite estudiar la remodelación del ECM y comprender mejor la progresión de la fibrosis hepática.

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Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.

Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con los procedimientos experimentales aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Stanford y el Hospital de Asuntos de Veteranos en Palo Alto. Los ratones machos C57BL / 6J de 6-8 semanas de edad fueron alimentados con comida rápida o una dieta de comida rápida suplementada con jarabe de maíz con alto contenido de fructosa al 4,2% (consulte la Tabla de materiales) en agua potable durante 14 semanas5. Los ratones se mantuvieron en jaulas estándar en un ciclo de oscuridad / luz de 12 h.
1. Preparación quirúrgica y procedimientos de perfusión hepática
<ol><li>Pese el ratón antes del procedimiento.</li>
	<li>Anestesiar al ratón administrando ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) (ver Tabla de materiales) mediante una inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies antes de continuar con el siguiente paso. NOTA: El isoflurano no es necesario aquí ya que esta es una cirugía de no supervivencia.</li>
	<li>Afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%. Coloque el ratón en su espalda e inmovilice las patas en la tabla quirúrgica con cinta adhesiva.</li>
	<li>Después de reconfirmar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, usa unas tijeras Mayo y fórceps Adson (consulta la Tabla de materiales) para hacer una incisión lateral de 3 cm en la parte inferior del abdomen y luego una incisión vertical de 5 cm desde la parte baja del abdomen hasta la apófisis xifoidea. Tenga cuidado de no abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón (consulte la Tabla de materiales) para exponer la vena porta.</li>
	<li>Cateterizar la vena porta con un catéter IV de 24 G. Introduzca el catéter en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.</li>
	<li>Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de 1 ml a través del catéter. NOTA: Tras la perfusión de PBS, todos los lóbulos deben blanquearse inmediatamente. Si el catéter está colocado correctamente, la sangre venosa fluirá rápidamente a través del catéter.</li>
	<li>Use microfórceps Dumont, un soporte para microagujas Castroviejo y sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada 1 cm más abajo para asegurar el catéter.</li>
</ol>2. Descelularización tisular
<ol><li>Conecte el catéter a un tubo de silicona (~1 m de longitud, 3 mm de diámetro interior y 4,1 mm de diámetro exterior) con un conector Luer. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión. Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 ml/min (es decir, 288 ml/24 h).</li>
	<li>Perfundir primero con agua desionizada (~50 mL/ratón) durante 2 h. El color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión. NOTA: El animal caducará después de 10 minutos de perfusión.</li>
	<li>Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% (peso / vol) (DOC, consulte la Tabla de materiales) y continúe durante la noche (18 h, ~ 250 ml / ratón). El hígado se volverá blanco al final de la perfusión (Figura 1).</li>
	<li>Cambie la solución de perfusión a agua desionizada (~ 50 ml / ratón) y perfunda durante 2 h.</li>
	<li>Use microfórceps Dumont y tijeras de microresorte (consulte la Tabla de materiales) para recoger el hígado descelularizado y lávelo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS.</li>
	<li>Cortar el tejido descelularizado en trozos pequeños para obtener imágenes inmediatas o congelarlo a -80 °C para un análisis bioquímico adicional, como espectrometría de masas en tándem, ELISA o western blot.</li>
</ol>3. Preparación del portaobjetos para la obtención de imágenes (con un microscopio de fluorescencia multifotón/confocal)
<ol><li>Transfiera un pequeño trozo de hígado descelularizado (<3 x 3 x 3 mm) a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.</li>
	<li>Añadir 10 μL de medio de montaje antidecoloración (ver Tabla de materiales) al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque.</li>
	<li>Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente (Figura 2). NOTA: Debido a la colocación de los dos fotones verticales a través del microscopio, se utilizó un vidrio de cubierta en la muestra. Sin embargo, las muestras podrían colocarse de manera diferente si se utiliza un microscopio invertido.</li>
</ol>4. Adquisición de imágenes
<ol><li>Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20x hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión.</li>
	<li>Cambie al canal violeta (405 nm), encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.</li>
	<li>Cambie al control de la computadora e inicie el láser de dos fotones. Encienda primero el láser de dos fotones (Figura 3A), luego encienda el controlador láser de dos fotones (consulte Tabla de materiales) y el obturador (Figura 3B, C). Asegúrese de que la potencia de salida sea superior a 2,5 W. Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia. Seleccione y ajuste los detectores (tanto fotomultiplicadores como híbridos) para acomodar los fluoróforos elegidos. NOTA: Las imágenes de dos fotones se realizaron a una longitud de onda de excitación de 860 nm. Se seleccionaron dos canales para las imágenes de colágeno SHG y fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF), respectivamente. Un canal correspondiente al rango de longitud de onda de 415-445 nm detectó la estructura detallada del colágeno a partir de señales SHG. Otro canal cubrió el rango de 465-669 nm para recoger señales TPEF.</li>
	<li>Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto. Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia y el desplazamiento. Ajuste el tiempo de permanencia de los píxeles, el tamaño de píxel, el promedio y el zoom (Figura 4A).</li>
	<li>Desplácese por el controlador z de la computadora y establezca las dimensiones z, defina los puntos inicial y final, y elija el número de imágenes dadas dentro de un volumen (pila z). Adquirir imágenes. NOTA: Aquí, se eligió un volumen Z de 20 μm y un tamaño de paso Z de 1 μm (Figura 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis%3A+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence%2C+incidence%2C+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li>
<li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li>
<li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li>
<li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83(2019).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398(2016).</li>
<li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li>
<li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+cancer%3A+A+strained+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).</li>
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<li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+%28C3A%29+function+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).</li>
<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses con respecto a este artículo.

El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica de la remodelac...

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido3.
La matriz extracelular (MEC) es un microambiente dinámico y complejo que ejerce comunicación bidireccional con las células para regular la homeostasis tisular4. La ECM hepática está compuesta por elementos estructurales como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina y otras proteínas no estructurales (por ejemplo, olfactomedina y trombospondina) para proporcionar soporte físico y estructural4.
La fibrosis hepática es una respuesta crónica de cicatrización de heridas al daño hepático de diversas etiologías, incluida la EHNA3. Es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la matriz ECM y se caracteriza por un exceso de proteínas estructurales en el hígado lesionado4. La fibrogénesis depende de la comunicación dinámica célula-célula entre los diferentes tipos de células hepáticas. Las células estrelladas hepáticas (HSC), cuando se activan, se diferencian en células similares a miofibroblastos que expresan actina, migran y proliferan en músculo liso alfa 2 y sintetizan proteínas ECM como una acción de cierre de heridas. Las HSC activadas son las células productoras de colágeno central en el hígado1.
El mecanismo molecular de la remodelación de la ECM, los patrones de fibrosis y su relación con los eventos celulares no están claros. Todavía se necesita una mejor comprensión de la estructura tridimensional (3D) de la ECM, a pesar de que las técnicas de espectrometría de masas han ayudado a analizar la composición de la proteína ECM4. Tradicionalmente, la tinción tricrómica de Masson, las tinciones de rojo Picro Sirius y las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se han realizado en secciones delgadas del hígado bidimensionales (2D). El patrón típico de fibrosis de NASH se llama "alambre de gallina", que se extiende a la zona 3 y es fibrosis perisinusoidal/pericelular 5,6. Sin embargo, ha habido una falta de estudios centrados en la estructura 3D del hígado nativo, particularmente aquellos que no implican la sección de tejido. Los enfoques de imagen robustos para identificar patrones y características de la fibrosis a través de la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática fortalecerían significativamente la comprensión de los mecanismos de NASH e identificarían nuevos objetivos terapéuticos.
Para abordar estos desafíos, se optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la ECM hepática nativa a través de la descelularización7. La descelularización de todo el hígado es un enfoque para eliminar el contenido celular hepático mientras se mantiene la red 3D ECM nativa a través de la perfusión detergente. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida (FFD) durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión in situ de la vena porta con detergente suave y bajas tasas de flujo para preservar las estructuras de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. Se aplicó microscopía de dos fotones para analizar los cambios en las estructuras de colágeno en la ECM. Se reconstituyeron y analizaron las imágenes 3D de la estructura nativa de ECM en hígados normales y NASH. Realizar la descelularización de perfusión in situ y analizar el andamio mediante microscopía de dos fotones proporciona una plataforma práctica y asequible para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

<table><tbody><tr><td>4-0 MONOCRYL SIN TEÑIR 1 x 18" P-3</td><td>MONOCRYL</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura</td> fisher <td>scientific</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>AnaSed Inyección (xilacina)</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>este medicamento para uso por o bajo la orden de un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso BD INSYTE AUTOGUARD CON TECNOLOGÍA BC</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 382612 <tr><td>Chow diet</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>Dieta de control. Una dieta de fórmula fija, no esterilizable en autoclave, fabricada con ingredientes de alta calidad y diseñada para apoyar la gestación, la lactancia y el crecimiento de los roedores.</td></tr><tr><td>Dieta de comida rápida (AIN76A Western Diet)</td><td>Dieta de prueba</td><td>1810060</td><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td></tr><tr><td>Kit de tinción de hematoxilina y eosina</td><td>vectorlabs</td><td>H-3502</td><td></td></tr><tr><td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html Kent Scientific Rata Kit Quirúrgico fisher</td><td>scientific</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>INYECCIÓN DE CLORHIDRATO DE KETAMINA</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td><td>KetaVed se ha estudiado clínicamente en primates subhumanos, además de las especies enumeradas en Administración y dosis.</td></tr><tr><td>Leica SP5 vertical Confocal,</td> conector <td>Leica</td><td>SP5</td><td></td>Luer multifotón</tr><tr><td>(llave de paso de tres vías con SPIN-LOCK&reg;)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td></tr><tr><td>Picrosirius Red Stain Kit</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td></tr><tr><td>Aplicador de rayón</td><td>puritan</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>sigmaaldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Jarabe</td><td>www.target.com</td><td>24 fl oz</td><td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica de Velocidad Variable</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración</td><td>vectorlabs</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

imágenes 3d de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama "alambre de pollo", que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.
El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

Las fibras de colágeno se detectaron con segunda generación armónica y microscopía de dos fotones. La señal proviene de las estructuras frangibles de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. No se utilizaron anticuerpos específicos para analizar los subtipos de colágeno; Sin embargo, esto podría agregarse a la técnica de imagen.
Cuando se estudia el tejido hepático sin descelularización, es difícil obtener imágenes de alta resolución de la red de colágeno (Fi...

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH es una de las enfermedades hepáticas crónicas más importantes del mundo. Puede progresar a fibrosis, cirrosis y, finalmente, cáncer de hígado. Estudiar el cambio dinámico de la ECM en la EHNA puede ayudar a comprender mejor la fibrosis.Las imágenes tradicionales no pueden demostrar cambios en la estructura de la ECM 3D, lo que limita la comprensión del proceso de remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática. Para comenzar, pese el ratón antes del procedimiento. Después de anestesiar al ratón, afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%.Coloque el ratón sobre su espalda e inmovilice las patas en la placa quirúrgica con cinta adhesiva. Use tijeras Mayo y fórceps Adson para hacer una incisión de tres centímetros lateralmente en la parte inferior del abdomen. Y luego una incisión de cinco centímetros verticalmente desde la parte baja del abdomen hasta el proceso xifoide sin abrir la cavidad torácica.Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón para exponer la vena porta. Para cateterizar la vena porta, inducir un catéter IV de calibre 24 en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de un mililitro a través del catéter. Use microfórceps Dumont, una microaguja Castroviejo y sutura 4-0 para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada un centímetro más abajo para asegurar el catéter.Conecte el catéter a un tubo de silicona de un metro de longitud, tres milímetros de diámetro interior y 4,1 milímetros de diámetro exterior con un conector de señuelo. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada. Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión.Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primero con agua desionizada durante dos horas y el color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión. Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% y continúe durante la noche y el hígado se volverá blanco al final de la perfusión.Cambie la solución de perfusión a agua desionizada y perfunda durante dos horas. Use microfórceps Dumont y tijeras de resorte micros para recoger el hígado descelularizado y lavarlo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS. Transfiera una pequeña pieza de hígado descelularizado a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.Agregue 10 microlitros de medio de montaje antidecoloración al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque. Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente.Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20X hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión. Cambie al canal violeta de longitud de onda 405 nanómetros.Encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.Para iniciar el láser de dos fotones, cambie al control de la computadora y encienda primero el láser de dos fotones. Luego encienda el controlador láser de dos fotones y el obturador asegurándose de que la potencia de salida sea superior a 2,5 vatios. Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.Seleccione y ajuste los detectores tanto de fotomultiplicadores como del híbrido para acomodar los fluoróforos elegidos. Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto.Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia, el desplazamiento del tiempo de permanencia de píxeles, el promedio de tamaño de píxel y el zoom. Desplácese por el controlador Z del ordenador y establezca las dimensiones Z. Defina los puntos inicial y final y elija el número de imágenes proporcionadas dentro de un volumen.Adquirir imágenes. Después de realizar la microscopía de dos fotones, las fibras de colágeno sin descelularización revelaron una imagen de baja resolución de la red de colágeno. En la matriz extracelular descelularizada, se observaron diferencias aparentes en la morfología y distribución espacial entre los hígados de comida rápida y comida rápida.Las fibras de colágeno y los ratones en una dieta de comida exhibieron una red entrelazada y bien organizada, mientras que los ratones en la dieta de comida rápida mostraron paquetes de colágeno con menos conectividad. La estructura tridimensional de la matriz extracelular del hígado muestra que las fibras de colágeno en ratones en la dieta chow mostraron una red bien organizada, pero no en ratones de dieta de comida rápida. Para confirmar la calidad del colágeno fibrilar en la matriz extracelular descelularizada, los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina eosina y rojo Picrosirius.La hematoxilina y la eosina muestran que todas las células han sido eliminadas. En las imágenes de tinción roja de Picrosirius, la matriz extracelular de los ratones alimentados con chow reveló una red bien organizada. Y en contraste, los ratones con dieta de comida rápida mostraron fibras de colágeno más densas.Retire con cuidado la burbuja dentro de un tubo antes de la perfusión. La burbuja bloqueará el vaso en el hígado y afectará la perfusión.

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Medicine

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La obtención de imágenes intravitales estables de alta resolución de las células inmunitarias en el hígado es un reto. Aquí proporcionamos un método altamente sensible y confiable para estudiar la migración y las interacciones célula-célula de las células inmunitarias en el hígado de ratón durante largos períodos (alrededor de 6 horas) mediante microscopía de escaneo láser multifotónico intravital en combinación con monitoreo de cuidados intensivos.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Este protocolo presenta un modelo biomimético 3D con compartimento estromal fibromático que lo acompaña. Preparado con hidrogeles fisiológicamente relevantes en proporciones que imitan las propiedades biofísicas de la matriz extracelular estromal, un mediador activo de interacciones celulares, crecimiento tumoral y metástasis.

Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

Este protocolo describe el uso de una técnica de ultrasonido mejorada para observar y cuantificar de manera no invasiva los cambios en el tejido hepático en modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico.

Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

Las enfermedades hepáticas son inducidas por muchas causas que promueven la fibrosis o la cirrosis. El trasplante es la única opción para recuperar la salud. Sin embargo, dada la escasez de órganos trasplantables, se deben explorar alternativas. Nuestra investigación propone la implantación de andamios de colágeno en tejido hepático a partir de un modelo animal.

Implantación de andamio de matriz de colágeno tridimensional como estrategia de regeneración hepática

Utilizando un modelo de ratón de enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) inducida por la dieta, describimos el uso de nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo como método no invasivo para evaluar las etapas de progresión de la EHGNA, centrándonos predominantemente en la red vascular hepática debido a su participación significativa en la desregulación hepática relacionada con la EHGNA.

Nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo para evaluar la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico

El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo digital tridimensional para el diagnóstico precoz de la fibrosis hepática, que incluya la rigidez de cada vóxel en el hígado del paciente y, por lo tanto, pueda utilizarse para calcular la relación de distribución del hígado del paciente en diferentes etapas de fibrosis.

Un modelo digital tridimensional para el diagnóstico precoz de la fibrosis hepática basado en la elastografía por resonancia magnética

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) con disfunción metabólica, cambios en la expresión génica hepática y alteraciones histopatológicas hepáticas que se asemejan a la MASLD humana, incluida la fibrosis que progresa a la fase 3 de fibrosis avanzada. Este modelo se puede utilizar en estudios de fisiopatología de MASLD y en estudios preclínicos de nuevas terapias.

Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica con fibrosis

Este protocolo introduce una herramienta de imagen hepática reutilizable (RHIT) de última generación para la microscopía intravital (IVM) de ratones vivos, que mejora la estabilidad tisular para experimentos rápidos y agudos. El diseño impreso en 3D del RHIT ofrece producción, escalabilidad y versatilidad rentables, permitiendo una observación prolongada de los procesos metabólicos en ratones de diversos tamaños.

Herramienta reutilizable de imagen hepática: Una herramienta reutilizable impresa en 3D para microscopía intravital hepática

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Aprende a visualizar la matriz extracelular hepática en 3D mediante perfusión in situ y microscopía de dos fotones en un modelo de ratón con esteatohepatitis no alcohólica. Este método optimizado permite estudiar la remodelación del ECM y comprender mejor la progresión de la fibrosis hepática.

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

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