Name: Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Endothelzellen aus Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Reaktionen auf gestörte Blutströmung bei Atherosklerose.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health-Zuschüsse HL119798, HL095070 und HL139757 an HJ unterstützt. HJ wird auch von der Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship unterstützt. Die Dienstleistungen des Emory Integrated Genomics Core (EIGC) wurden von der Emory University School of Medicine subventioniert und teilweise auch von der Georgia Clinical and Translational Science Alliance der National Institutes of Health unter der Award-Nr. UL1TR002378. Der oben bereitgestellte Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Alle unten beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University genehmigt. Nicht-hypercholesterinämische, alters- und geschlechtsangepasste C57BL/6-Mäuse wurden verwendet, um geschlechtsabhängige Variationen zu mildern und Komplikationen hypercholesterinämischer Zustände auszugleichen.
1. Partielle Karotisligatur (PCL)
HINWEIS: Die partielle Karotis-Ligatur der LCA wurde wie zuvor beschrieben und demonstriertdurchgeführt 3.
<ol><li>Betäuben Sie die Maus durch Isofluran-Inhalation (5% Isofluoran in Sauerstoff für die Induktion und 1,5% danach für die Erhaltung) während des gesamten Verfahrens mit einem Anästhesie-Vaporizer. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein isothermes Deltaphase-Pad, um den Verlust von Körperwärme während der Operation zu verhindern.</li>
	<li>Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Keratitis zu verhindern, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Zehenklemmreaktion.</li>
	<li>Injizieren Sie Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan, um Schmerzen präventiv zu behandeln. Desinfizieren Sie den epilierten Bereich durch dreimaliges Auftragen und Reinigen mit Betadin und Isopropanollösung. Stellen Sie sicher, dass Betadin der letzte Schritt zur Sterilisation des Operationsbereichs ist, beginnend in der Mitte und endend an den Seiten.</li>
	<li>Machen Sie mit aseptischen Techniken einen ventralen Mittellinienschnitt (~ 1 cm) im Halsbereich und legen Sie den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion frei.</li>
	<li>Ligiert die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Seidennaht; Lassen Sie die Arteria schilddrüse superior unberührt.</li>
	<li>Nähern Sie sich der Haut an und schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber und / oder Nähten.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig (bei 37 °C) und legen Sie sie bis zu 1 Stunde auf ein sauberes Handtuch, um eine postoperative Unterkühlung zu vermeiden. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist eine präventive Einzeldosis von Buprenorphin (0,05 mg / kg) in der Regel ausreichend für die postoperative Schmerzbehandlung. Eine wiederholte Dosis von Buprenorphin kann verabreicht werden, wenn das Tier nach den ersten 24 Stunden in Not ist. Bei korrekter Durchführung ist mit diesem Verfahren keine Mortalität verbunden, und der postoperative Stress für die Maus ist minimal. Die Mäuse werden in ihre jeweiligen Käfige zurückgebracht und nach der Operation täglich überwacht.</li>
	<li>Bereiten Sie das Perfusions-Setup vor.<ol><li>Verwenden Sie 0,9% NaCl (normale Kochsalzlösung) mit 10 U / ml Heparin in einem IV-Beutel. Haken Sie den Infusionsbeutel 244-274 cm (8-9 Fuß) vom Boden oder etwa 122-152 cm (4-5 Fuß) höher als das Präparierbrett. Befestigen Sie die Schmetterlingsnadel am Ende der Kochsalzlösung und spülen Sie alle Luftblasen aus der IV-Leitung.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung der Halsschlagadern nach dem Opfer
<ol><li>Opfern Sie die Mäuse durch CO2 -Inhalation gemäß dem institutionellen IACUC-Protokoll.</li>
	<li>Sprühen Sie 70% Ethanol auf die Haut der Maus und legen Sie es in Rückenlage auf die Sezierplatte, die Adsorptionspapiertücher enthält. Befestigen Sie die Pfoten der Maus mit Klebeband oder einer 21 G Nadel an den Adsorptionstüchern auf der Präparierplatte.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Schere die Haut der Maus vom Bauch bis zur Spitze des Thorax.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs durch stumpfe Dissektion zu öffnen.</li>
	<li>Machen Sie mit der Schere vorsichtig einen Einschnitt entlang der Länge des Zwerchfells und fahren Sie durch die Rippen auf beiden Seiten des Thorax, bis das Brustbein abgehoben werden kann. Heben Sie das Brustbein vorsichtig mit einer Pinzette ab; Danach entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Bindegewebe über dem Herzen, um die Hauptgefäße sichtbar zu machen.</li>
	<li>Durchtrennen Sie die Hohlvene mit einer Schere, damit Blut aus dem geschlossenen Kreislauf austreten kann.</li>
	<li>Führen Sie eine 21 G Schmetterlingsnadel, die mit der IV-Leitung verbunden ist, durch die Spitze des Herzens in den linken Ventrikel ein und lassen Sie eine retrograde Perfusion für 2-3 min mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu. Stellen Sie sicher, dass eine konstante Durchflussrate der normalen Kochsalzlösung aufrechterhalten wird, indem Sie den Kochsalzbeutel in der Höhe von 8-9 Fuß über dem Boden halten. HINWEIS: Die Lunge und die Leber werden blass, was auf eine optimale Durchblutung hinweist. Für jede Maus werden ca. 20 ml Perfusionspuffer verwendet.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion und entfernen Sie das gesamte Fett, die Muskeln und das Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen (Abbildung 1A). HINWEIS: Der Rest des Verfahrens wird unter dem Seziermikroskop durchgeführt.</li>
	<li>Passen Sie das Sichtfeld an, um die Ligationsstellen zu lokalisieren. Machen Sie mit der 10-mm-Mikrodissektionsschere einen kleinen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen.</li>
	<li>Durchbluten Sie erneut für weitere 1 min über den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass die LCA gut durchblutet und frei von sichtbaren Blutspuren ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine feine Pinzette und eine kleine Federschere, um das periadventitiale Gewebe, das die Halsschlagader umgibt, vorsichtig zu entfernen, während die Halsschlagader am Körper befestigt ist. HINWEIS: Achten Sie sehr darauf, die Halsschlagadern während dieses Reinigungsschritts nicht zu quetschen oder zu dehnen, da dies die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen erhöhen kann. Bei korrekter Durchführung beträgt die Zelllebensfähigkeit in der endgültigen Zellsuspension in der Regel >93%.</li>
</ol>3. Endothelzell-angereicherte Einzelzellisolierung aus der Carotis-Schicht von Mäusen
ANMERKUNG: Die nachstehend beschriebenen Reagenzien können im Voraus hergestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden: 1x und 0,1x Einzelkernlysepuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einkern-Waschpuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einzelkern Nuclei Buffer Rezeptur mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien. Die Arbeitsbestände dieser Puffer sind nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Zusammensetzung des Verdauungspuffers: Kollagenase Typ II 600 U/ml und DNase I 60 U/ml in 0,5% fetalem Rinderserum (FBS)-haltiger phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
<ol><li>Während die Halsschlagader noch befestigt sind, waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren wegzuspülen.</li>
	<li>Mit einer Insulinspritze, die mit einer 29-G-Nadel ausgestattet ist, injizieren Sie ~ 50 μL des Verdauungspuffers in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader. Wenn der Verdauungspuffer beginnt, die Halsschlagader zu füllen, klemmen Sie das proximale Ende der Halsschlagader mit einem Mikroclip fest (Abbildung 1B). Führen Sie zusätzliche 15-20 μL Verdauungspuffer in das Lumen ein und schneiden Sie das distale Ende ab, um die Freisetzung des Verdauungspuffers zu vermeiden.</li>
	<li>Die Halsschlagadern der Maus vorsichtig explantationieren (Abbildung 1B,C) und in 35-mm-Schalen geben, die warme (bei 37 °C) Hepes-gepufferte Kochsalzlösung enthalten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Klemmen sicher platziert sind. Wenn sich die Klemme löst, kann die Verdauungslösung aus dem Lumen austreten und die erhaltene Zellzahl beeinflussen. In diesem Fall fügen Sie zusätzliche enzymatische Lösung mit einer Insulinspritze mit einer 29-G-Nadel vom offenen Ende der Halsschlagader hinzu und sichern Sie die Klemme erneut (Abbildung 1D). Wenn die Enzympufferlösung erneut ausläuft, ist es wahrscheinlich, dass die Halsschlagader während des Explantationsprozesses durchtrennt wird. Verwerfen Sie in diesem Fall die Halsschlagader und schließen Sie die Probe von der Studie aus. Eine wiederholte grobe Handhabung der Halsschlagader verringert die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Einzelzellpräparation. Achten Sie darauf, die linke und rechte Halsschlagadern zu identifizieren und korrekt zu kennzeichnen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die explantierten Carotiden für 45 min bei 37 °C mit intermittierendem Schaukeln.</li>
</ol>4. Spülung der Halsschlagadern
<ol><li>Nach Abschluss der luminalen enzymatischen Verdauung entfernen Sie die Halsschlagader zusammen mit den Klemmen aus der 35 mm Schüssel. Entfernen Sie vorsichtig jede Klemme und achten Sie darauf, dass der Verdauungspuffer nicht ausläuft.</li>
	<li>Halten Sie vorsichtig ein Ende der Halsschlagader mit einer feinen Pinzette auf einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie mit der anderen Hand eine 29-G-Nadel mit einer Insulinspritze mit 100 μl warmem Verdauungspuffer (37 °C) in das Lumen ein (Abbildung 1D).</li>
	<li>Spülen Sie das Lumen der Halsschlagader schnell in das Mikrozentrifugenröhrchen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,3 ml FBS in das 1,5-ml-Röhrchen geben. Legen Sie die Röhre auf Eis. HINWEIS: Die Spülung enthält die Zellen aus der luminalen enzymatischen Verdauung. Die Zugabe von FBS und die Senkung der Temperatur stoppt den enzymatischen Verdauungsprozess. Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung hoch ist und Ablagerungen oder Fettgewebe enthält, wird die Verwendung eines 50 oder 70 μm großen Zellsiebs dringend empfohlen, um unerwünschte Gewebeablagerungen herauszufiltern. Um die Einzelzellzahl zu erhöhen, wird empfohlen, mehrere Halsschlagader zu spülen. Um hier mindestens 5.000 Zellen zu erhalten, wurden 10-12 Carotiden gespült und als eine Probe gepoolt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Verdauungspuffer, der das Zelldissoziationsreagenz enthält (siehe Materialtabelle), für 5 min bei 37 °C, um alle Zellen in einzelne Zellen zu trennen. HINWEIS: Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung gering ist, erhöhen Sie die Zentrifugengeschwindigkeit auf 2.000-3.000 × g , um die Zellen herunterzudrehen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen eine bessere Visualisierung des Zellpellets am Boden des Röhrchens.</li>
	<li>Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 ml FBS in das 0,5-ml-Röhrchen geben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor, wie in Schritt 4.4.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL eiskalter 1% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in PBS in einem 0,2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die Verwendung von 0,2 ml Zentrifugenröhrchen verbessert die Visualisierung des einzelligen Pellets am Boden des Röhrchens.</li>
</ol>5. Einzelzell- und Einzelkernanalysen
<ol><li>Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scRNAseq ein.<ol><li>Resuspendieren Sie das einzellige Pellet mit 100 μL eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2 ml Röhrchen.</li>
		<li>Nach der Resuspendierung der Zellen für die Einzelzellverkapselung fahren Sie sofort mit der Einzelzellverkapselung und Barcodierung unter Verwendung eines mikrofluidikbasierten Einzelzellpartitionierungs- und Barcodesystems fort (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Bevor Sie die Proben an den Genomics Core senden, zählen und inspizieren Sie die Einzelzellpräparate. Stellen Sie sicher, dass keine Zellaggregate vorhanden sind. HINWEIS: Die Aggregation einzelner Zellen kann weiter minimiert werden, indem die BSA-Menge auf bis zu 2% erhöht wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scATACseq ein.<ol><li>Das Zellpellet wird in 100 μL 0,04% BSA in eiskaltem 1x PBS resuspendiert und die Einzelzellsuspension bei 500 × g bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem 0,1-fach-Lysepuffer lysieren (Tabelle 1) und 5 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Mischen Sie das Lysat 10 mal mit einer P-20 Pipette und inkubieren Sie für weitere 10 min.</li>
		<li>500 μL gekühlten Waschpuffer (Tabelle 1) zu den lysierten Zellen geben und 5-mal mit einer Pipette mischen. HINWEIS: Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um Ablagerungen aus der Zellsuspension zu filtern und in ein 2-ml-Röhrchen zu überführen.</li>
		<li>Das Lysat wird bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Kernpellet im verdünnten Kernpuffer (150 μL) resuspendiert (siehe Materialtabelle und Tabelle 1). Zählen und untersuchen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer11.</li>
		<li>Senden Sie die Einzelkernprobe an den Genomics-Kern zur Transposition, Kernpartitionierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung. HINWEIS: Wenn die anfängliche Zellzahl niedrig ist, ist es üblich, Trümmer entlang der Kerne zu beobachten. Daher wird empfohlen, mit einer hohen Zellzahl zu beginnen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).</li>
<li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li>
<li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).</li>
<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJ ist der Gründer von FloKines Pharma. Andere Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Einzelzellpräparaten aus den Halsschlagadern der Maus. Der Einfluss von d-flow auf die Endothelzellen kann genau untersucht werden, wenn die PCL-Operation korrekt durchgeführt wird. Es ist wichtig, die Äste der gewöhnlichen Halsschlagader, wie die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die Okzipitalarterie und die Arteria thyroidea superior, korrekt zu identifizieren. Die Validierung von Strömungsmustern durch Ultraschall validiert d...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

Dieses Labor zeigte zuvor, dass die Induktion von d-flow zu einer schnellen und robusten Atheroskleroseentwicklung bei hyperlipidämischen Mäusen führt 1,2. Das neuartige Mausmodell der d-Flow-induzierten Atherosklerose wurde mittels partieller Carotisligatur (PCL) möglich 3. Die PCL-Chirurgie induziert einen niedrigen und oszillatorischen Blutfluss oder D-Fluss in der ligierten linken Halsschlagader (LCA). Im Gegensatz dazu ist die kontralaterale rechte Halsschlagader (RCA) weiterhin einer stabilen laminaren Strömung (s-flow) ausgesetzt. Um die Wirkung des d-Flusses auf Endothelzellen zu verstehen, wurden die Halsschlagadern nach einer partiellen Ligaturoperation seziert und mit einem auf Phenol- und Guanidinisothiocyanat basierenden Lysemittel (luminale RNA/DNA-Spülmethode)2,4 gespült, das endothelial angereicherte "gepoolte Bulk"-RNAs oder DNAs lieferte. Diese gepoolten Bulk-RNAs oder DNAs wurden dann für transkriptomische Studien oder epigenomische DNA-Methylom-Studien bzw. 4,5,6 verarbeitet. Diese Studien halfen, mehrere flussempfindliche Gene und microRNAs zu entdecken, deren Rolle in der Endothelbiologie und Atherosklerose umfassend untersucht wurde 4,6,7.
Trotz der endothelialen Anreicherung konnten diese RNA/DNA-Massenstudien jedoch nicht die spezifische Rolle jedes Zelltyps in der Arterienwand bei d-flow-induzierter Atherosklerose unterscheiden. Umdiese Einschränkung zu überwinden, wurden endothelial angereicherte Einzelzellisolierungen (sc) sowie scRNA- und scATAC-Sequenzierungsstudien durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden C57Bl6-Mäuse der PCL-Operation unterzogen, um einen d-Flow in der LCA zu induzieren, während die s-flow-exponierte RCA als Kontrolle verwendet wurde. Zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation wurden die Mäuse geopfert und die Halsschlagader seziert und gereinigt. Das Lumen sowohl von LCAs als auch von RCAs wurde mit Kollagenase infundiert, und die luminalen Kollagenase-Verdauungen, die ECs als signifikante Fraktion enthielten, und andere arterielle Zellen wurden gesammelt. Die Einzelzellsuspension (scRNAseq) oder Einzelkernsuspension (scATACseq) wurde hergestellt und mit eindeutigen Identifikatoren für jede Zelle oder jeden Kern unter Verwendung eines 10-fachen Genomics-Setups versehen. Die RNAs wurden einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unterzogen und sequenziert.
Die Datensätze scRNAseq und scATACseq wurden mit der Cell Ranger Single-Cell Software verarbeitet und von den Seurat und Signac R Paketen 9,10 weiter analysiert. Jeder Zelle und jedem Zellkern wurde aus diesen Analysen ein Zelltyp zugeordnet und basierend auf den Markergenen und einzigartigen Genexpressionsmustern in den Zelltyp gruppiert. Die Ergebnisse der scRNAseq und scATACseq zeigten, dass diese Einzelzellpräparate mit ECs angereichert sind und auch glatte Muskelzellen (SMCs), Fibroblasten und Immunzellen enthalten.
Weitere Analysen ergaben, dass die EC-Population in der luminalen Verdauung sehr divergent und plastisch (8 verschiedene EC-Cluster) ist und auf den Blutfluss reagiert. Am wichtigsten ist, dass diese Ergebnisse zeigten, dass d-flow ECs von einem athero-geschützten entzündungshemmenden Phänotyp zu pro-atherogenen Phänotypen umprogrammiert, einschließlich entzündungsförderndem, endothelialem zu mesenchymalem Übergang, endothelialem Stamm / Vorläuferzellübergang und überraschenderweise endothelial-zu-immunzellähnlichem Übergang. Darüber hinaus zeigen scATACseq-Daten genomweit neuartige flussabhängige Chromatin-Zugänglichkeitsänderungen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die die Grundlage für mehrere neue Hypothesen bilden. Die Methodik und das Protokoll zur Vorbereitung einzelner Endothelzellen für Einzelzell-Multi-Omics-Studien aus den Halsschlagadern der Maus sind unten aufgeführt.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Zellkulturqualität)</td><td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen - Schaumstoffgestell, steril</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>50 mL SuperClear Zentrifugenröhrchen</td><td>Labcon</td><td>3191-335-028</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Seidennaht steril</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Cell Strainer, weiß, steril, einzeln verpackt</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase-Lösung, steril gefiltert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>ATAC-Puffer (Komponente I des Transpositionsmixes)</td><td>10x Genomics</td><td>2000122 ATAC-Enzym</td><td></td></tr><tr><td>(Komponente II des Transpositionsmixes)</td><td>10x Genomics</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>Chrom-Controller & Weiter GEM Zubehör-Kit</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Next GEM Single Cell 3' Reagenzien-Kits v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Next GEM Einzelzell-ATAC-Reagenzien-Kits v1.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100502.5</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Tischmodell # 5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Premium Select</td><td>R& D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td><td></td></tr><tr><td>HEPES gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze (3/10 mL 29 G Spritze)</td><td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 & Mikro; m)</td><td>&nbsp; Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid)</td><td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei Buffer (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Schere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Micro Clip zum Anlegen einer Pinzette mit Schloss</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5480</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Typ II Kollagenase</td><td>MP biomedizinisch</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scATACseq FastQ Dateien</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq FastQ Dateien</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Beitritt # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software und Algorithmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td><td></td></tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019</td><td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monokel 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ Monokel-Release</td><td></td></tr><tr><td>R Version 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von endothelzellen aus dem lumen von maus-halsschlagadern für einzelzell-multi-omics-experimente

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung der arteriellen Regionen, die einem gestörten Blutfluss (D-Flow) ausgesetzt sind. D-flow reguliert die Expression von Genen im Endothel auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene, was zu proatherogenen Reaktionen führt. Vor kurzem wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und Einzelzell-Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (scATACseq) Studien durchgeführt, um die transkriptomischen und chromatin-Zugänglichkeitsänderungen bei einer Einzelzellauflösung unter Verwendung des Maus-PCL-Modells (Partial Carotisligation) zu bestimmen. Da Endothelzellen (ECs) nur einen geringen Teil der gesamten Zellpopulationen in der Arterienwand ausmachen, wurde eine luminale Verdauungsmethode verwendet, um EC-angereicherte Einzelzellpräparate zu erhalten. Für diese Studie wurden Mäuse einer PCL-Operation unterzogen, um einen d-Fluss in der linken Halsschlagader (LCA) zu induzieren, während die rechte Halsschlagader (RCA) als Kontrolle verwendet wurde. Die Halsschlagadern wurden zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation seziert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder einzelne Kerne wurden erhalten. Diese Einzelzell- und Einzelkernpräparate wurden anschließend mit einem 10-fachen mikrofluidischen Aufbau von Genomics mit einem Barcode versehen. Die mit Barcodes versehenen Einzelzellen und Einzelkerne wurden dann für die RNA-Vorbereitung, Bibliotheksgenerierung und Sequenzierung auf einem Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierer verwendet. Nach der bioinformatischen Verarbeitung identifizierten die Datensätze scRNAseq und scATACseq verschiedene Zelltypen aus dem luminalen Aufschluss, die hauptsächlich aus ECs bestanden. Glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Immunzellen waren ebenfalls vorhanden. Diese EC-Anreicherungsmethode half dabei, die Wirkung des Blutflusses auf das Endothel zu verstehen, was mit der Methode der Gesamtarterienverdauung schwierig gewesen sein könnte. Die EC-angereicherte Einzelzellpräparationsmethode kann verwendet werden, um Einzelzell-Omics-Studien an EC-Knockouts und transgenen Mäusen durchzuführen, bei denen die Wirkung des Blutflusses auf diese Gene nicht untersucht wurde. Wichtig ist, dass diese Technik angepasst werden kann, um EC-angereicherte Einzelzellen aus menschlichen Arterienexplantaten zu isolieren, um ähnliche mechanistische Studien durchzuführen.

Partielle Carotis-Ligaturoperationen wurden an 44 Mäusen durchgeführt, und der Beginn des d-Flows in der LCA wurde durch Ultraschall einen Tag nach der partiellen Ligatur validiert. Eine erfolgreiche partielle Ligatur bewirkt eine verminderte Durchblutungsgeschwindigkeit und kehrt den Blutfluss (gestörter Fluss) in der LCA3 um. Die Halsschlagadern wurden entweder zwei Tage oder zwei Wochen nach der Ligatur präpariert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterz...

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

In einem Blutgefäß ist die Anzahl der Endothelzellen sehr gering, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Unser Protokoll beseitigt diese Einschränkung und ermöglicht es uns, neuartige molekulare Wege und Therapeutika zu untersuchen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, endothelial angereicherte Proben zu erhalten und zu untersuchen, wie akute und chronische Flussstörungen diesen Zelltyp beeinflussen.Die Fähigkeit, Endothelzellen genauer zu untersuchen, ermöglicht es, Zielgene und damit potenzielle Therapeutika für Atherosklerose zu definieren, die auf Endothelzellen abzielen. Die Isolierung der Halsschlagader ist schwierig und erfordert Geduld und Erfahrung. Um zu beginnen, bereiten Sie das Tier vor, indem Sie 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan injizieren.Sterilisieren Sie den epilierten Bereich dreimal mit Betadine und Isopropanollösung. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt von etwa einem Zentimeter im Halsbereich. Belichten Sie dann den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion.Ligieren Sie die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Nähten, wobei die obere Schilddrüsenarterie unberührt bleibt. Verschließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber oder Nähten. Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird.Legen Sie die Maus bis zu einer Stunde lang auf ein sauberes Handtuch, um eine Unterkühlung nach der Operation zu vermeiden. Führen Sie eine 21-Gauge-Nadel in die IV-Linie ein, die durch die Herzspitze mit dem linken Ventrikel verbunden ist. Lassen Sie die retrograde Perfusion für zwei bis drei Minuten mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu.Halten Sie eine konstante Durchflussrate aufrecht, indem Sie während der Injektion oder Verwendung einer IV-Leitung einen gleichmäßigen Druck ausüben und den Kochsalzbeutel in einer Höhe von acht bis neun Fuß halten. Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion mit allem Fett, Muskeln und Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen. Entfernen Sie dann das periadventitiale Gewebe um die Halsschlagader herum, so dass die Halsschlagader am Körper befestigt bleibt.Machen Sie einen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen. Durchbluten Sie die LCA durch den linken Ventrikel für eine weitere Minute, um Blutspuren zu entfernen. Waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren zu entfernen.Verwenden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel, um 50 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader zu injizieren. Verwenden Sie einen Mikroclip, um das proximale Ende der Halsschlagader mit Verdauungspuffer gefüllt zu klemmen. Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen hinzu und schneiden Sie das distale Ende ab, um eine Freisetzung von Verdauungspuffer zu vermeiden.Übertragen Sie die Halsschlagadern von der Maus in 35-Millimeter-Schalen mit warmer 37 Grad Celsius HEPES-gepufferter Kochsalzlösung. Und brütet sie für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius mit intermittierendem Schaukeln. Entfernen Sie die Halsschlagader mit den Klemmen aus der 35-Millimeter-Schale, nachdem die luminale enzymatische Verdauung abgeschlossen ist.Lösen Sie die Klemmen vorsichtig, damit der Verdauungspuffer nicht ausläuft. Halten Sie ein Ende der Halsschlagader auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem Lumen 100 Mikroliter warmen Verdauungspuffer hinzu, indem Sie eine 29-Gauge-Nadel einführen, die mit einer Insulinspritze ausgestattet ist.Spülen Sie schnell das Lumen der Halsschlagader in der Mikrozentrifugenröhre und fügen Sie dann 0,3 Mikroliter FBS in das Röhrchen hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einer Zentrifuge mit einem Rotor mit festem Winkel und verwerfen Sie den Überstand.Suspendieren Sie die Zellen im Verdauungspuffer, der ein Zelldissoziationsreagenz enthält, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um sie in einzelne Zellen zu trennen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 Milliliter FBS in das 0,5-Milliliter-Röhrchen geben und die Zentrifugation wiederholen. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern eiskalter 1% BSA-Lösung in PBS in einem 0,2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Für die Einzelzellanalyse resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen. Für die Einzelkernanalyse resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern 0,04% BSA in eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 500 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem Lysepuffer zersetzen und fünf Minuten auf Eis inkubieren.Mischen Sie das Lysat mit einer P20-Pipette und inkubieren Sie weitere 10 Minuten. Anschließend wird das Lysat in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Ly-Zellen mit 500 Mikrolitern Puffer und mischen Sie sie mit einer Pipette.Wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kernpellet in 150 Mikrolitern des verdünnten Kernpuffers. Zählen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer.Im Anschluss an die Einzelkernsequenzierungsstudie wurden Einzelzell- und Einzelkerne erhalten und mittels Hellfeld- und Phasenkontrastmikroskopie visualisiert. Die Wirksamkeit der Einzelkernpräparation aus der Einzelzellsuspension wurde ebenfalls nachgewiesen. Nach der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudie wurden verschiedene Parameter wie die Verteilung von Genen pro Zelle, eindeutiger molekularer Identifikator pro Zelle, mitochondriale Messwerte pro Zelle und Sequenzierungssättigungsdaten erhalten.Für die Einzelzell-ATAC-Sequenzstudie wurde die Insertgrößenverteilung einschließlich des Nukleosomenbandenmusters beobachtet. Der normalisierte TSS-Anreicherungswert wurde ebenfalls beobachtet. Darüber hinaus liest das prozentuale Fragment in den Spitzenwerten.Die Fragmente der Spitzenregion, der TSS-Anreicherungswert, das Verhältnis der Lesevorgänge in den genomischen Stellen der Blacklist und das Nukleosomensignalverhältnis wurden bestimmt. Der enzymatische Aufschluss ist eine Belastung für die Zellen, daher ist es wichtig, die Proben auf Eis zu halten und das Verfahren so schnell wie möglich durchzuführen. Wir können diese Methode verwenden, um Endothelzellen aus Mäusen zu gewinnen und zu platten.Wir können diese Technik auch verwenden, um Omix-basierte Massenstudien durchzuführen. Diese Technik ebnete den Weg, um die Wirkung eines gestörten Blutflusses auf Endothelzellen in vivo in einer einzigen Zellweise zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Ein Modell des Disturbed Flow-Atherosklerose in Maus Halsschlagader durch partielle Ligation und eine einfache Methode zur RNA-Isolierung aus Carotid Endothelium

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Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

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