Name: Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Isolierung muriner retinaler Endothelzellen aus neonatalen Mäusen für Next-Generation-Sequenzierung. Diese Methode gewährleistet hohe Zellviabilität und Reinheit für genomische Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vielen Dank an die Yale Flow Cytometry Facility, die University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, das Yale Center for Genomic Analysis und den University of Virginia Genome Analysis and Technology Core für ihre Bemühungen, ihr Fachwissen und ihre Beratung bei der Durchführung der vorgestellten Experimente. Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse an N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) und K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) finanziert.

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Yale University und der University of Virginia genehmigten alle in diesem Protokoll aufgeführten Tierversuche.
1. Besorgen Sie sich Mausaugen für die Netzhautisolierung
<ol><li>Bereiten Sie 1x eiskaltes PBS vor und geben Sie 500 μL in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte.</li>
	<li>Euthanasieren Sie neugeborene Mäuse am sechsten postnatalen Tag (P6) gemäß genehmigten institutionellen Richtlinien. Für dieses Experiment werden Würfe von etwa 4-8 neonatalen Mäusen bei P6 durch Isofluran-Inhalation für mindestens drei Minuten nach dem Atemstillstand eingeschläfert, gefolgt von einer Enthauptung.</li>
	<li>Entfernen Sie die Augen von jeder der Mäuse. Schneiden Sie die Haut und die Membran über dem Auge ab, indem Sie mit einer Sezierschere senkrecht zum Augenlid schneiden. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um sanft über und unter das Auge zu drücken, so dass sich das Auge aus der Augenhöhle bewegt.<ol><li>Kneifen Sie vorsichtig mit der Pinzette unter das Auge und schneiden Sie den Sehnerv, der das Auge befestigt hält. Legen Sie dann jedes Auge in die 48-Well-Platte in das vorbereitete 1x eiskalte PBS, bis die Ernte beendet ist. HINWEIS: Verwenden Sie eine Vertiefung pro Maus, wobei sich beide Augen einer einzelnen Maus im selben Vertiefung befinden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Netzhautgewebe der Maus isolieren
<ol><li>Füllen Sie eine Petrischale, die mit einem Präparierpad auf der Unterseite ausgekleidet ist, mit 500 μL 1x eiskaltem PBS, um die Augen einzutauchen, und legen Sie sie unter ein Dissektionsmikroskop, das auf 4,0-fache Vergrößerung eingestellt ist.<ol><li>Hängen Sie die Augen mit einer Transferpipette mit breiter Spitze in das Präparierpad, um die Augen nicht zu beschädigen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Augen vollständig mit PBS bedeckt sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Halten Sie den Sehnerv mit einer der Pinzetten zur Stabilisierung mit zwei feinen Dissektionszangen fest und stechen Sie mit der zweiten Pinzette ein Loch durch die Vorderkammer, wo sich Hornhaut und Sklera verbinden (Abbildung 1B). Reißen Sie das Loch in einem Kreis etwa 75% des Weges um die Hornhaut.<ol><li>Während Sie den Sehnerv noch mit einer der Pinzetten halten, verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Sklera sanft vom Netzhautgewebe abzureißen.</li>
		<li>Verwenden Sie wie oben die zweite Pinzette, um den Glaskörper des Netzhautgewebes vorsichtig abzureißen.</li>
		<li>Entfernen Sie mit der zweiten Pinzette vorsichtig die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße, die sich nicht gelöst haben, als der Glaskörper entfernt wurde. Um dies zu tun, greifen Sie mit einer offenen Pinzette in die Netzhaut, bis Sie fast die Netzhaut berühren, schließen Sie die Pinzette, um die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße zu greifen, und ziehen Sie die Pinzette aus der Netzhaut heraus. Dies kann wiederholt werden, bis alle Gefäße entfernt sind. HINWEIS: Der Plexus hyaloideus ähnelt einer klaren, netzartigen Struktur.</li>
	</ol></li>
	<li>Füllen Sie 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL 1x eiskaltem PBS und legen Sie die Netzhaut in die Röhrchen. Isolieren Sie alle Netzhäute von den Augen und legen Sie sie in eiskaltes PBS, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: Verwenden Sie eine Röhre pro Maus, wobei sich zwei Netzhäute derselben Maus eine Röhre teilen. Wenn Netzhautgewebe gerissen ist, übertragen Sie es in mehrere Stücke. Die Gesamtzeit der Netzhautgewebedissektion für einen Wurf von Mäusen sollte 15-60 Minuten dauern, beginnend mit der Euthanasie und endend mit der endgültigen Netzhautgewebeisolierung.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über das Isolationsprotokoll. (A) Schematische Darstellung des Zeitplans für die Isolierung mit einer geschätzten Zeit für jeden Schritt: Isolierung von Netzhautgewebe, Verdauung, Antikörperfärbung, FACS und Zelllebensfähigkeitsfenster. (B) Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Isolierung von Netzhautgewebe aus dem Auge, mit nummerierten Dissektionsschritten: 1) Hornhaut durchstechen, 2) Hornhaut reißen, 3) Sklera reißen, 4) Sklera aus der Netzhaut entfernen, 5) Sklera und Bindegewebe aus der Netzhaut entfernen, 6) den Glaskörper und die Glaskörpergefäße von der Netzhaut entfernen. (C) Repräsentative Bilder von Netzhautgewebe während verschiedener Verdauungsschritte: Pre-digest, Post-digest, Pellet (schwarze Pfeile markieren Netzhautgewebe oder Zellpellet). Wiederveröffentlichung mit freundlicher Genehmigung von Chavkin et al. veröffentlicht in S. Karger AG, Basel17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
3. Netzhautgewebe zu einer einzelligen Suspension verdauen
<ol><li>Bereiten Sie 500 μL Aufschlusslösung für jeweils zwei isolierte Netzhäute vor. Fügen Sie FBS und Kollagenase Typ II zu DMEM zu einer Endkonzentration von 10% FBS und 1 mg / ml Kollagenase Typ II hinzu. Die Lösung wird mit einem Wasserbad gemischt und auf 37 °C erwärmt.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges PBS aus den 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen durch vorsichtiges Pipettieren. Lassen Sie genügend PBS, um das Netzhautgewebe vollständig zu bedecken, etwa 100 μL in jedem Röhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 500 μL der Verdauungslösung in jedes Röhrchen mit Netzhautgewebe (Abbildung 1C).<ol><li>Verwenden Sie einen P1000-Pipettierer und eine Pipettenspitze, um das Netzhautgewebe in der Verdauungslösung fünfmal auf und ab zu pipettieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Aufschlussmischung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min inkubieren.<ol><li>Verwenden Sie einen P1000-Pipettierer und eine Pipettenspitze, um die Aufschlussmischung alle 5 Minuten auf und ab zu pipettieren. Nach der Inkubation hat sich das Netzhautgewebe in eine einzellige Suspension aufgelöst, so dass die Verdauungsmischung trüb sein sollte (Abbildung 1C).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Zellen zählen
<ol><li>Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Aufschlussmischröhrchen hinein. Pelletieren Sie die Aufschlussmischung durch Zentrifugieren bei 375 x g für 5 min.</li>
	<li>Die überstehende Verdauungslösung vorsichtig durch Pipettieren entfernen. Stören Sie das Zellpellet nicht (Abbildung 1C). Suspendieren Sie das Pellet in 500 μL eiskaltem 1x PBS durch vorsichtiges Auf- und Abmischen mit der Pipette.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop. HINWEIS: Die Zellzahl beträgt ungefähr 1 x 106 Zellen pro zwei Netzhäute.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Zellen durch sanftes Mischen ordnungsgemäß resuspendiert werden, und aliquot dann 20 μL Zellsuspension in drei Röhrchen zur Kontrolle der Färbung (Röhrchen 1: IgG-Kontrolle, Röhrchen 2: CD31-Kontrolle und Röhrchen 3: CD45-Kontrolle), wie zuvor beschrieben und verwendet17,18.</li>
	<li>Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie Röhrchen mit Zellen hinein. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 375 x g für 5 min.</li>
</ol>5. Immunfärben Sie die Zellen mit Antikörpern
<ol><li>Bereiten Sie 100 μL Färbepuffer pro zwei gefärbte Netzhäute plus vier Kontrollröhrchen vor. Fügen Sie FBS, HEPES und D-Glucose zu HBSS-Puffer auf eine Endkonzentration von 10% FBS, 10 mM HEPES und 1 mg / ml D-Glucose hinzu.</li>
	<li>Erhalten Sie fluoreszenzkonjugierte Antikörper gegen CD31 und CD45. Geben Sie die Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 in den Färbepuffer (Röhrchen 1: Nur IgG-Antikörper, Röhrchen 2: nur CD31-Antikörper und Röhrchen 3: nur CD45-Antikörper). Fügen Sie 1 μL Antikörper pro 100 μL des Färbepuffers hinzu, um eine endgültige Antikörperkonzentration von 2 μg / ml zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren aus dem gewaschenen Zellpellet.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μL Antikörperfärbelösung pro 0,5 x 106 Zellen.<ol><li>Inkubieren Sie die Einzelzellsuspension mit der Antikörperfärbelösung für 30 min auf Eis im Dunkeln. Klopfen Sie alle 10 Minuten auf die Röhrchen, um die Zellen vorsichtig zu mischen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Vorbereitung auf fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
<ol><li>Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Röhrchen mit den Zellen hinein. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 375 x g für 5 min.<ol><li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie diese Zellen in 500 μL 1x PBS zum Waschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Röhrchen mit den Zellen hinein. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 375 x g für 5 min</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5 ml FACS-Puffer vor (1% FBS in 1x PBS).<ol><li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μL FACS-Puffer durch vorsichtiges Mischen mit einem Pipettor.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie Propidiumiodid (PI) zu den Probenröhrchen, die den FACS-Puffer enthalten, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml. PI wird als Lebensfähigkeitsmarker verwendet.</li>
	<li>Die Zellsuspensionen werden durch eine Schnappkappe des Zellsiebs in 5 ml Reagenzgläser überführt und kombiniert. Die Schnappkappe des Zellsiebs sollte einen 35-μm-Filter enthalten, und die Zellsuspensionen können direkt auf den Filter pipettiert werden.<ol><li>Halten Sie die FACS-Röhrchen im Dunkeln auf Eis und übertragen Sie sie in den Zellsortierer.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Einrichtung des FACS-Instruments
<ol><li>Installieren Sie eine 100-μm-Düse in ein FACS-Gerät. HINWEIS: Diese Größendüse minimiert das Sammelvolumen und maximiert die isolierte Zelldichte.</li>
	<li>Bereiten Sie 250 μL 1x PBS in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen als Sammelröhrchen vor, das in das FACS-Gerät eingebaut wird.</li>
</ol>8. Isolieren Sie lebensfähige Endothelzellen über FACS
<ol><li>Schalten Sie das FACS-Instrument und den Computer ein. Klicken Sie auf das FACS-Softwaresymbol, um die FACS-Software auf dem Computer zu öffnen, um das FACS-Gerät auszuführen und zu bedienen. Führen Sie routinemäßige Qualitätskontrolltests durch.</li>
	<li>Legen Sie die kontrollgefärbten Proben in das FACS-Gerät, um die Achsen anzupassen. Beginnen Sie mit reinen IgG-Antikörperzellen, um FSC und SSC zu erzeugen und anzupassen, dann CD31-Antikörper nur, um CD31 zu erzeugen und anzupassen, und dann CD45-Antikörper nur, um CD45 zu erzeugen und anzupassen. Zeichnen Sie Daten aus Kontrollproben auf.</li>
	<li>Laden Sie gefärbte Probenzellen in das FACS-Gerät und führen Sie die Probe aus.</li>
	<li>Gattern Sie die Zellen basierend auf den Parametern Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung (FSC-A bzw. SSC-A) (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Parameter FSC-A und SSC-A werden verwendet, um Zellen basierend auf Größe, Dichte, Granularität, Oberflächeneigenschaften und Brechungsindex auszuwählen.</li>
	<li>Gate-Zellen mittels FSC-A und FSC-H, um Zelldubletten zu identifizieren und nur einzelne Zellen zu sammeln (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Parameter FSC-A und FSC-H werden verwendet, um einzelne Zellen nach dem Prinzip auszuwählen, dass Zelldubletten während der Vorwärtsstreuung Tröpfchen mit einem größeren Verhältnis von Fläche zu Höhe sind.</li>
	<li>Gate-Zellen mittels PI und SSC-A zur Identifizierung lebensfähiger Zellen (Abbildung 2A). HINWEIS: Lebensfähige Zellen sind PI-negativ.</li>
	<li>Erstellen Sie ein CD31+/CD45-Gate mit Bedienelementen und Gate-Zellen von CD31 und CD45 (Abbildung 2A,B).<ol><li>Führen Sie ein Sammelröhrchen mit 250 μL FACS-Puffer ein.</li>
		<li>Sortieren Sie Zellen, die CD31-positiv/CD45-negativ sind, in das installierte Sammelrohr.</li>
		<li>Bewahren Sie die Sammelröhrchen zur weiteren Analyse auf Eis auf. In diesem Schritt1 können Proben für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation verarbeitet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Rentabilitätstest durchführen
<ol><li>Mischen Sie 10 μL Zellen mit 10 μL 0,4% Trypanblau-Lösung, um die Zelllebensfähigkeit zu beurteilen.</li>
	<li>Zählen Sie lebensfähige Zellen, indem Sie die gefärbte Mischung auf einen Hämozytometerobjektträger pipettieren. Legen Sie den Objektträger unter ein Mikroskop, um genaue Lebensfähigkeitswerte zu erhalten. Zählen Sie blaue Zellen als nicht lebensfähig und zählen Sie klare Zellen als lebensfähig.<ol><li>Teilen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zelle, um die prozentuale Lebensfähigkeit zu berechnen.</li>
	</ol></li>
</ol>10. Genexpressionstest durchführen
<ol><li>Erhalten Sie 10.000-20.000 Zellen pro Probe und führen Sie eine RNA-Isolierung durch, um die Genexpression von retinalen retinalen Endothelzellen zu analysieren. Die RNA-Isolierung wird mit einem kommerziell erhältlichen Kit durchgeführt, das ethanolbasierte RNA-Fällung und dann Zentrifugations- und Membransäulen verwendet, um gereinigte RNA aus Zelllysat zu waschen und zu eluieren. In diesem Schritt1 können Proben für einige Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation verarbeitet werden.</li>
	<li>Wandeln Sie die RNA in cDNA um, indem Sie das Enzym der reversen Transkriptase und unterstützende Reagenzienverwenden 19.</li>
	<li>Quantifizierung mit einem DNA-bindenden Farbstoff und einer quantitativen PCR (qPCR)20. Laden Sie cDNA-Proben in eine 384-Well-qPCR-Platte mit Primern, um Gene von Interesse zu amplifizieren. Das Reaktionsvolumen sollte 10 μL betragen, einschließlich DNA-bindender Farbstoff, der zur Quantifizierung der Genamplifikation verwendet wird.<ol><li>Verwenden Sie CD31, VE-Cadherin, CD45 und β-Aktin-Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um die Genexpression zu messen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie das Beispiel für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation1.</li>
</ol>

<ol><li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li>
<li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Cell+Methods%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li>
<li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
<li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li>
<li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li>
<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
<li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366(2016).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+PartB%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li>
<li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31%3A+beyond+a+marker+for+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li>
<li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li>
<li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li>
<li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li>
<li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+CNS%2C+but+not+non-CNS%2C+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li>
<li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li>
<li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations%3A+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li>
<li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049(2019).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li>
<li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li>
<li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li>
<li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li>
<li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).</li>
<li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li>
<li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCENIC%3A+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine relevanten Angaben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus postnatalem murinem Netzhautgewebe, die für eine hohe Zellzahl, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert wurde. Die Zellreinheit wird durch FACS-Isolierung von Endothelzellpopulationen aus der verdauten Einzelzellsuspension durch CD31+/CD45-Immunfärbung erreicht. Die Qualität der Isolierung wird in Assays auf Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung und Genexpression mittels qPCR für CD31, CD45 und VE-Cadherin quantifiziert (obwohl VE-Cadherin n...

Die hohe Durchsatzkapazität der Sequenzierung von Nukleinsäuren über Next-Generation-Sequencing-Ansätze hat das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erheblich erweitert. Diese fortschrittlichen Techniken umfassen die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA, die DNA-Sequenzierung von Zielregionen zur Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die DNA-Sequenzierung gebundener Transkriptionsfaktoren bei der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Sequenzierung oder offene Chromatinregionen in der ATAC-Sequenzierung (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung1 . In der Gefäßbiologie haben diese Fortschritte es den Forschern ermöglicht, komplizierte Mechanismen der Entwicklung und Krankheit aufzuklären und Genexpressionsmuster entlang eines Kontinuums unterschiedlicher Phänotypen zu unterscheiden 2,3. Zukünftige Experimente können komplexe Mechanismen weiter definieren, indem sie die Sequenzierung der nächsten Generation mit evaluierten Modellen der vaskulären Entwicklung kombinieren, aber die Methoden zur Probenvorbereitung müssen mit den fortschrittlichen Sequenzierungstechniken kompatibel sein.
Die Qualität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen hängt von der Methode der Probenvorbereitung ab. Bei der Isolierung einer Untergruppe von Zellen oder der Erzeugung einzelliger Suspensionen aus Geweben sind optimale Verdauungs- und Reinigungsmethoden unerlässlich, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellpopulation zu maximieren 4,5. Dies erfordert ein Gleichgewicht in der Verdauungsmethode: Eine starke Verdauung ist notwendig, um Zellen aus dem Gewebe zu befreien und genügend Zellen für nachgeschaltete Ansätze zu erhalten, aber die Zelllebensfähigkeit wird negativ beeinflusst, wenn die Verdauung zu stark ist 6,7. Darüber hinaus ist die Reinheit der Zellpopulation für robuste Ergebnisse und eine genaue Analyse der Daten erforderlich, die durch FACS erreicht werden kann. Dies unterstreicht die Bedeutung der Optimierung von Zellisolationsmethoden, um die Next-Generation-Sequenzierung auf etablierte Modelle der vaskulären Entwicklung anzuwenden.
Ein gut charakterisiertes Modell zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung ist das murine retinale vaskuläre Entwicklungsmodell. Das murine retinale Gefäßsystem entwickelt sich postnatal in einem zweidimensionalen oberflächlichen Plexus mit anfänglichem angiogenem Sprießen aus dem Sehnerv, sichtbar am postnatalen Tag (P)3, angiogener Front mit Stiel- und Spitzenzellen und anfänglicher Gefäßreifung sichtbar bei P6 und Reifung des vaskulären Plexus sichtbar nach P9 8,9. Während des Umbaus des anfänglichen vaskulären Plexus werden Endothelzellen in verschiedenen Gefäßen in Richtung arterieller, kapillarer und venöser Phänotypen spezifiziert, um ein Kreislaufnetzwerkzu erzeugen 10,11. Daher ermöglicht diese Methode den Forschern, die angiogene Gefäßplexusbildung und die endotheliale arteriell-venöse Spezifikation und Reifung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung sichtbar zu machen9. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen transgener Manipulation auf die Angiogenese und die Entwicklung des vaskulären Plexus, die zur Untersuchung von Gefäßentwicklung, arteriell-venösen Fehlbildungen und sauerstoffinduzierter Neovaskularisation eingesetzt wurde 12,13,14,15,16 . Um Next-Generation-Sequenzierungsansätze mit dem murinen retinalen vaskulären Entwicklungsmodell zu kombinieren, ist ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Endothelzellen aus Netzhautgewebe notwendig.
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Verdauung von Netzhautgewebe von Mäusen bei P6, um die Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit zu maximieren. Netzhautgewebe wird aus P6-Mäusen isoliert, für 20 min verdaut, für CD31 und CD45 immungefärbt und durch FACS gereinigt, um eine Einzelzellsuspension von Endothelzellen in etwa 2,5 h zu isolieren (Abbildung 1A). Es wurde festgestellt, dass diese Endothelzellen 60 Minuten nach der Isolierung eine hohe Lebensfähigkeit aufrechterhalten17, was Bibliothekspräparate für Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation ermöglicht. Darüber hinaus werden repräsentative Ergebnisse für FACS-Gating- und Qualitätskontrollergebnisse aus zwei separaten Next-Generation-Sequenzierungsmethoden unter Verwendung dieses Isolationsprotokolls bereitgestellt: die gesamte Transkriptom-RNA-Sequenzierung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht es, Next-Generation-Sequenzierungsansätze in Verbindung mit dem retinalen Vaskularisationsmodell zu verwenden, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzuklären.

<table><tbody><tr><td>2 mL Eppendorf&nbsp; safe-lock</td> tubes <td>USA Scientific<</td><td>em>4036-3352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Falcon Reagenzgläser mit Zellsieb Schnappverschluss</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Nicht TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratte Anti-Maus CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a & Kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSChorus Software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten, einzeln verpackt, steril</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Messpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Dissektion Pan Wax</td><td>Carolina</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Dissektions-Stereomikroskop M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Flex-Tubes Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Feine Dissektionszange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthese-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Allzweck-Deluxe-Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>Grundierung: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Grundierung: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Zentrifuge, gekühlt</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 Ratte Anti-Maus CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 Ratte IgG2b, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von retinen retinalen endothelzellen für die sequenzierung der nächsten generation

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Jüngste Verbesserungen in der Next-Generation-Sequenzierung haben das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erweitert, wobei mehrere Studien neue Paradigmen in der vaskulären Biologie aufdecken. Die Anwendung dieser Methoden auf Modelle der vaskulären Entwicklung erfordert die Optimierung von Zellisolierungstechniken aus embryonalen und postnatalen Geweben. Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit müssen alle maximal sein, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse aus Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation zu erhalten. Das retinale Vaskularisationsmodell der neonatalen Maus wird von Forschern verwendet, um Mechanismen der vaskulären Entwicklung zu untersuchen. Forscher haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der Angiogenese und der arteriell-venösen Schicksalsspezifikation während der Blutgefäßbildung und -reifung zu untersuchen. Die Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungstechniken zur Untersuchung des retinalen vaskulären Entwicklungsmodells erfordert die Optimierung einer Methode zur Isolierung von retinalen Endothelzellen, die die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit maximiert. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Verdauung und Reinigung von retinem retinalem Gewebe unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FACS-gereinigte CD31+/CD45-Endothelzellpopulation für die Genexpression von Endothelzellen stark angereichert ist und keine Veränderung der Lebensfähigkeit für 60 Minuten nach FACS aufweist. Enthalten sind repräsentative Ergebnisse von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen an Endothelzellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, einschließlich Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zeigen, dass diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen kompatibel ist. Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken.

Die Verdauung von Netzhautgewebe und die Immunfärbung für CD31 und CD45 führt zu einer identifizierbaren Population von CD31+/CD45-Endothelzellen nach Gating für Zellen, einzelne Zellen und Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Eine CD45-Immunfärbung ist erforderlich, um CD31+/CD45+-Zellen zu eliminieren, zu denen Blutplättchen und einige Leukozyten gehören21. Für jedes Experiment sollten Kontrollen durchgeführt werden, um die Antikörperspezifität und die Gating-Strategie z...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken. Das beschriebene Protokoll ist für hohe Lebensfähigkeit und Reinheit optimiert, die für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation unerlässlich sind. Das Verfahren wird von Shelby Cain, einem Doktoranden des Hershey Laboratory, demonstriert.Beginnen Sie, die Augen von der euthanasierten Neugeborenenmaus zu entfernen, indem Sie die Haut und die Membran über dem Auge mit einem senkrechten Schnitt zum Augenlid mit einer Sezierschere abschneiden. Verwenden Sie dann die Pinzette, um über und unter das Auge zu drücken, so dass sich das Auge aus der Augenhöhle bewegt. Kneifen Sie vorsichtig mit der Pinzette unter das Auge und schneiden Sie den Sehnerv, der das Auge befestigt hält.Dann legen Sie beide Augen der Maus bis zur Ernte in eine Vertiefung der 48-Well-Platte im frisch zubereiteten eiskalten PBS. Um das Netzhautgewebe der Maus zu isolieren, hängen Sie die Augen in der Präparierplatte in einer Petrischale auf, die mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBS gefüllt ist, indem Sie ein Transferrohrpad mit breiter Spitze verwenden. Arbeiten Sie unter dem Dissektionsmikroskop, halten Sie den Sehnerv mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie die zweite Pinzette, um das Loch durch die Vorderkammer des Auges zu stechen, wo sich Hornhaut und Sklera verbinden.Dann reißen Sie das Loch in einem Kreis etwa 75% des Weges um die Hornhaut. Während Sie den Sehnerv mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Sklera und den Glaskörper sanft vom Netzhautgewebe abzureißen. Um Linsen- und Hyaloidplexusgefäße zu entfernen, greifen Sie mit einer offenen Pinzette in die Netzhaut, bis Sie sie fast berühren, und schließen Sie dann die Pinzette, um die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße aus der Netzhaut zu greifen und herauszuziehen.Wenn alle Gefäße entfernt sind, legen Sie die Netzhaut in die zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die mit 500 Mikrolitern eines x eiskaltem PBS gefüllt sind. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus dem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, wobei etwa 100 Mikroliter PBS in der Röhre verbleiben, um das Netzhautgewebe vollständig zu bedecken. Dann 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Aufschlusslösung in das Röhrchen geben.Verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipettenspitze, um das Netzhautgewebe in der Verdauungslösung fünfmal auf und ab zu pipettieren. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie die Verdauungsmischung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 20 Minuten, wobei die Verdauungsmischung alle fünf Minuten auf und ab pipettiert wird, wie zuvor beschrieben. Nach der Inkubation löst sich das Netzhautgewebe in eine einzellige Suspension auf, wodurch die Verdauungsmischung trüb wird.Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation das PBS aus dem gewaschenen Zellpellet durch Pipettieren entfernen und dann die Zellen immunfärben, indem Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Antikörperfärbelösung pro 0,5 mal 10 zu den sechsten Zellen resuspendieren. Inkubieren Sie die einzellige Suspension mit der Antikörperfärbelösung für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln, indem Sie alle 10 Minuten auf das Röhrchen klopfen, um die Zellen vorsichtig zu mischen.Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands waschen und pelletieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben in 500 Mikrolitern PBS. Und dann resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikroliter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer durch vorsichtiges Mischen mit der Pipette.Als nächstes fügen Sie Propidiumiodid oder PI als Lebensfähigkeitsmarker zu den Probenröhrchen hinzu, die den FACS-Puffer enthalten, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspensionen durch eine Schnappkappe des Zellsiebs, die einen 35-Mikron-Filter enthält, in ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas zu überführen. Nach der Filtration halten Sie das FACS-Rohr im Dunkeln auf Eis und übergeben Sie das Röhrchen dann in den Zellsortierer.Schalten Sie das FACS-Instrument und den Computer ein und öffnen Sie die FACS-Software, um das FACS-Instrument auszuführen und zu bedienen. Führen Sie routinemäßige Qualitätskontrolltests durch. Legen Sie die Kontrollfleckenproben in das FACS-Instrument, um die Achsen anzupassen.Beginnen Sie mit reinen IgG-Antikörperzellen, um Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung zu erzeugen und anzupassen. Dann CD31-Antikörper nur, um CD31 zu erzeugen und anzupassen. Und dann CD45-Antikörper nur, um CD45 zu erzeugen und anzupassen.Notieren Sie die Daten aus den Kontrollproben. Als nächstes laden Sie die gefärbten Probenzellen in das FACS-Instrument und führen die Probe aus. Gang der Zellen basierend auf Vorwärtsstreuung oder FSC und Seitenstreuung oder SSC-Parametern.Gangzellen von FSCA und FSCH zur Identifizierung von Zelldubletten und zur Entnahme von nur Einzelzellen. Gangzellen durch PI und SSCA zur Identifizierung lebensfähiger Zellen. Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen und gehen Sie die Zellen mit CD31 und CD45.Führen Sie ein Sammelröhrchen mit 250 Mikrolitern FACS-Puffer in das Gerät ein. Als nächstes beginnen Sie mit der Sortierung von Zellen CD31+CD45 in das installierte Sammelrohr. Bewahren Sie die Sammelröhrchen zur weiteren Analyse auf Eis auf.Die Proben können für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation aufbereitet werden. In der Studie beeinflusste die Variation der Verdauungszeit den Zellertrag und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit. Die Verdauungszeit von 20 Minuten führte zu einer optimalen Ausbeute mit einem geringen Anteil an nicht lebensfähigen Endothelzellen.Die anschließende Propidiumiodid-Färbung zeigte, dass die isolierten Endothelzellen nach der Isolierung 60 Minuten lang lebensfähig blieben. Die Reinheit der Zellpopulation wurde durch quantitative PCR- oder qPCRR-Analyse der Expression von Endothelzellgenen bewertet, die eine starke Anreicherung für Endothelzellgene in der CD31+CD45-Population zeigten. Reinigung von RNA aus den isolierten Endothelzellen, die cDNA durch Bibliothekspräparation und Sequenzierung umwandeln und amplifizieren Die cDNA-Bibliothek führte zu mehr als 16.000 Genen, die in neun unabhängigen Proben identifiziert wurden.Ein Abfall der Transkripte pro Million Lesevorgänge oder TPM wurde in Genen unterhalb dieser Schwelle beobachtet. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung der isolierten retinalen Endothelzellen durch die 10x Genomics-Pipeline führte zu einem Median von 1.171 Genen pro Zelle, 15.247 nachgewiesenen Genen und einem Median von 2.255 eindeutigen molekularen Identifikatoren oder UMI-Zählungen pro Zelle in 917 Zellen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Netzhautgewebeisolierung und die Gewebeverdauung, die genau wie beschrieben durchgeführt werden sollten, um den Zellertrag und die Lebensfähigkeit zu optimieren.Die isolierten Endothelzellen können in fortgeschrittenen Sequenzierungstechniken wie der Ganztranskriptom-RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung und Assay für Transposase-zugängliche Chromatinsequenzierung verwendet werden. Der Einsatz dieser optimierten Methode in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierungsmethoden und durch computergestützte Ansätze kann die Mechanismen miteinander verbundener Signalwege, die vaskuläre Entwicklungen regulieren, weiter aufklären.

isolation-murine-retinal-endothelial-cells-for-next-generation

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung von primären retinalen Ganglienzellen (RGCs) von Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die zukünftige Untersuchung von RGCs mit dem Ziel, den starken Rückgang der Sehschärfe besser zu verstehen, der aus dem Verlust funktioneller RGCs bei neurodegenerativen Erkrankungen resultiert.

Isolierung von murinen retinalen Ganglienzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung.  Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Erfahren Sie die optimierte Isolierung muriner retinaler Endothelzellen aus neonatalen Mäusen für Next-Generation-Sequenzierung. Diese Methode gewährleistet hohe Zellviabilität und Reinheit für genomische Analysen.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Weitere Videos entdecken