Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Tier frei im Gerät wachsen kann und für hochauflösende Bildgebung gefangen werden kann. Das Gerät kann mehrfach wiederverwendet werden. Bei der Herstellung des Geräts ist die Sauberkeit der wichtigste Faktor, um staubfreie Geräte herstellen zu können, um Leckagen während des Gerätebetriebs zu vermeiden.

Entwerfen Sie Muster eins für die Fließschicht und Muster zwei für die Kontrollschicht mit rechteckigen Formen in einer Textverarbeitungssoftware und drucken Sie die Fotomasken mit Hilfe eines Laserplotters mit einer minimalen Strukturgröße von acht Mikrometern auf Polyesterfolie. Schneiden Sie Siliziumwafer in quadratische Stücke von 2,5 Zentimetern Höhe und Breite. Reinigen Sie sie eine Minute lang mit 20% Kaliumhydroxid und spülen Sie die Wafer in entionisiertem Wasser ab.

Verwenden Sie einen Wafer für den Fluss und den anderen für die Kontrollschicht. Trocknen Sie die Stücke mit 14 P-S-I komprimiertem Stickstoffgas und anschließender Dehydratisierung auf einer Heizplatte bei 120 Grad Celsius für vier Stunden. Nehmen Sie nach dem Abkühlen ein Siliziumstück, legen Sie es auf das Futter eines Spin-Coders und schalten Sie das Vakuum ein, um den Wafer an Ort und Stelle zu halten.

Geben Sie etwa 20 Mikroliter Hexamethyldisilan auf das Silikonstück und beschichten Sie es mit dem Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden und anschließend 3000 R-P-M für 30 Sekunden. Um eine gleichmäßige Fotolackdicke von etwa 40 Mikrometern spezifisch für die Fließschicht zu erhalten, beschichten Sie den Siliziumwafer mit etwa 1,5 Milliliter negativem Fotolack mit einem Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden, gefolgt von 2000 R-P-M für 30 Sekunden. Wiederholen Sie die Beschichtung des Siliziumstücks mit Hexamethyldisilan und negativem Fotolack für den zweiten Wafer, um eine gleichmäßige Fotolackdicke von etwa 40 Mikrometern zu erhalten, die für die Kontrollschicht spezifisch ist.

Alternativ können zur Erhöhung der Dicke der Fließschicht auf etwa 80 Mikrometer für ältere Tiere Siliziumwafer mit etwa 1,5 Milliliter negativem Fotolack zwei beschichtet werden, wobei der Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden gefolgt von 2000 R-P-M für 30 Sekunden verwendet wird. Backen Sie die beiden zuvor fotolackbeschichteten Silikonstücke auf einer heißen Platte bei 65 Grad Celsius für eine Minute, gefolgt von 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Legen Sie nach dem Abkühlen weich gebackene Silikonstücke auf die Belichtungsstufe der U-V-Beleuchtung, wobei die fotolackbeschichtete Oberfläche der U-V-Lampe zugewandt ist.

Besetzen Sie die beiden Teile 15 Sekunden lang separat U-V mit einer 200-Watt-Lampe durch eine Fotomaske mit den Mustern eins und zwei, um Fluss- bzw. Kontrollschichten zu erhalten. Backen Sie die beiden freiliegenden Silikonstücke wie zuvor beschrieben mit beschichteten Schichten nach oben. Nach dem Abkühlen der Teile entwickeln Sie die Muster, indem Sie die Silikonstücke 20 Minuten lang in der Fotolack-Entwicklerlösung einweichen.

Sobald das Muster sichtbar ist, spülen Sie die Stücke mit reinem Isopropylalkohol ab und föhnen Sie sie vorsichtig mit Stickstoffgas trocken. Bewahren Sie die Silikonstücke in einem Exsikkator mit der beschichteten Oberfläche nach oben auf. Setzen Sie die Teile Silandämpfen aus, indem Sie 50 Mikroliter reines T-C-P-F-O-S auf einen Glasobjektträger gießen.

Legen Sie den Objektträger in einen Exsikkator und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang. Machen Sie P-D-M-S in einem Plastikbecher, indem Sie die Elastomerbasis mit dem Härter mischen und drei Minuten lang ständig umrühren. Entgasen Sie die P-D-M-S-Mischung in einem Exsikkator für 30 Minuten, um alle Luftblasen zu entfernen.

Legen Sie die Kontrollschicht Siliziumwafer in eine Petrischale und gießen Sie eine fünf Millimeter dicke P-D-M-S-Mischschicht auf die Siliziumstücke. Nach dem P-D-M-S-Gießvorgang wiederholen Sie die Entgasung der P-D-M-S-Mischung. Legen Sie den Siliziumwafer mit der Fließschicht dem Spinnerwagen zugewandt und legen Sie einen Vakuumdruck von 200 bis 500 Millitorr auf.

Gießen Sie etwa einen Milliliter P-D-M-S auf den Siliziumwafer. Kodieren Sie es mit einem Spin-Coater, um eine etwa 80 Mikrometer dicke Schicht zu erhalten. Die beiden Siliziumwafer mit dem spinbeschichteten P-D-M-S backen und P-D-M-S-Schichten bei 50 Grad Celsius in einem Heißluftkonvektionsofen sechs Stunden lang gießen.

Nach dem Abkühlen schneiden die Stücke mit einer scharfen Klinge die fünf Millimeter dicke P-D-M-S-Schicht aus dem Silikonstück um die Kontrollschicht und ziehen sie vom Siliziumsubstrat ab. Stanzen Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter mit einem Harris-Locher am Reservoir des P-D-M-S-Blocks, um den Immobilisierungskanal und die Isolationskanaleinlässe mit den Gasleitungen für P-D-M-S-Membranauslenkungen zu verbinden. Legen Sie das Silikonstück mit der spinbeschichteten P-D-M-S-Schicht auf Muster eins, wobei die P-D-M-S-beschichtete Oberfläche nach oben auf eine Kunststoffschale zeigt.

Halten Sie den gestanzten P-D-M-S-Block mit Muster zwei auf dem Tablett mit geformter Seite nach oben. Halten Sie die Kunststoffschale in einem Plasmareiniger und setzen Sie die beiden P-D-M-S-Oberflächen zwei Minuten lang 18 Watt Luftplasma aus, indem Sie niedriges Vakuum anwenden. Nehmen Sie die beiden plasmabehandelten Blöcke heraus und binden Sie die Blöcke vorsichtig, indem Sie die plasmabehandelten Oberflächen der Muster eins und zwei zusammendrücken.

Backen Sie die gebundenen Muster bei 50 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Heißluftkonvektionsofen. Nachdem Sie das geklebte Gerät aus dem Ofen genommen haben, schneiden Sie es aus Siliziumwafern mit Muster eins und Muster zwei und stanzen Sie mit dem Harris-Locher Löcher in die Einlass- und Auslassbehälter der Fließschicht. Legen Sie den geklebten P-D-M-S-Block mit der Fließschicht nach oben auf eine Kunststoffschale und bewahren Sie ein sauberes Deckglas auf derselben Schale auf.

Setzen Sie die Blöcke im Deckglas zwei Minuten lang 18 Watt Luftplasma aus. Stellen Sie den Vakuumdruck ein, um eine violette Kammer zu sehen. Legen Sie den plasmaexponierten P-D-M-S-Block auf das Deckglas und backen Sie die gebundene Struktur in einem Ofen bei 50 Grad Celsius für zwei Stunden.

Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Kammer für zukünftige Experimente. Nehmen Sie das Gerät, legen Sie es auf ein Stereomikroskop und befestigen Sie die Schläuche. Schließen Sie einen Microflex-Schlauch an eine komprimierte Stickstoffgasleitung und einen Drei-Wege-Stecker am anderen Ende an.

Verbinden Sie Rohre eins und zwei der Drei-Wege-Verbinder mit der Falle in Isoliermembranen. Verbinden Sie zwei Microflex-Schläuche mit den beiden Auslassanschlüssen des Dreiwegehahns. Verbinden Sie das andere Ende der beiden Röhrchen mit einer acht Millimeter langen 18-Gauge-Nadel.

Füllen Sie die Fließschicht mit M-9-Puffer mit einer Mikropipette durch den Einlassanschluss. Füllen Sie beide Röhrchen mit entionisiertem Wasser durch das Ende, das mit der Nadel verbunden ist. Führen Sie die beiden Nadeln in die gestanzten Löcher ein, die die Isolier- und Fangmembran verbinden.

Öffnen Sie den Stickstoffgasregler bei 14 P-S-I und drehen Sie das Dreiwegeventil von Rohr eins, um das Wasser durch die mikrofluidischen Kanäle in den Kontrollschichten, nämlich die Fallen- und Isolationsmembranen, in das Gerät zu drücken. Lassen Sie den Druck mit dem Dreiwegehahn ab, sobald die Kanäle mit Wasser gefüllt und grundiert sind. Entfernen Sie die Blasen, indem Sie zusätzliche Medien durch den Strömungskanal fließen lassen.

Die Abbildung zeigt Bilder von P-S-3-2-3-9, einem Tier, das im mikrofluidischen Chip wächst und alle acht bis 10 Stunden immobilisiert wird, um Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Die Variation des Expressionsmusters stellt ein Beispiel für die zeitliche Genregulation dar, bei der dasselbe Gen in verschiedenen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien exprimiert wird. Die Bildgebung des individuellen W-D-I-S-5-1-Genotyps von Caenorhabditis elegans zeigt eine menoraartige verzweigte dendritische Architektur in jedem P-V-D-Neuron, die primäre, sekundäre tertiäre und quartäre Prozesse in den Entwicklungsstadien L-2, Late L-2, L-3 und L-4 umfasst.

Die hierin enthaltene Abbildung vergleicht P-V-D-Entwicklung und in Geräten gezüchtete Tiere mit solchen, die auf N-G-M-Platten gezüchtet wurden. Die Anzahl von S-P und Q-P in verschiedenen Stadien der Wurmentwicklung nahm mit dem Alter zu. Caenorhabditis elegans wurde mit einem Tropfen von drei Millimolar Levamisol behandelt, um eine ausreichende Lähmung zu verursachen, die für hochauflösende Bildgebung erforderlich ist.

Die S-P-Werte unterschieden sich nicht signifikant, wenn sie von ähnlichen inszenierten Tieren gemessen wurden, die auf N-G-M-Platten gezüchtet und mit drei Millimolar-Levamisol auf einem Agar-Objektträger abgebildet wurden. Darüber hinaus vergrößert sich der Abstand zwischen den beiden P-V-C-Zellkörpern, von denen einer im Schwanz und der zweite in der Nähe der Vulva vorhanden ist, wenn sie sich sowohl bei den im Gerät gewachsenen Tieren als auch bei denen, die auf N-G-M-Platten gezüchtet wurden, auseinander bewegen. Die Abbildung stellt das hochauflösende Bild von Berührungsrezeptor-Neuronen von Tieren dar, die im mikrofluidischen Gerät wachsen.

Die Montage stellt den gesamten neuronalen P-L-M-R-Prozess zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten dar und hebt die Mitochondrien und den neuronalen Prozess hervor. Die Grafik stellt die gesamte neuronale Prozesslänge dar, die mit einer Steigung von 10,4 Mikrometern pro Stunde zunimmt. Das mikrogefertigte Gerät verwendet eine dünne P-D-M-S-Membran, die in Gegenwart von Hochdruck-Stickstoffgas abgelenkt wird, um C-Elegane für hochauflösende Bildgebung zu immobilisieren und an Ort und Stelle zu halten.

Dieses Verfahren kann longitudinale Studien von zellulären und subzellulären Prozessen in C-elegans ermöglichen, die intermittierende Beobachtungen über einen langen Zeitraum erfordern.