Name: Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die skalierbare Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli mittels Filtration und Größenausschlusschromatographie. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht präklinische und therapeutische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die oben beschriebene Forschung wurde durch NIH TL1 TR002549-03 Training Grant unterstützt. Wir danken Dr. John C. Tilton und Dr. Zachary Troyer (Case Western Reserve University) für die Erleichterung des Zugangs zum Partikelgrößenanalysegerät; Lew Brown (Spectradyne) für technische Unterstützung bei der Analyse der Partikelgrößenverteilungsdaten; Dr. David Putnam von der Cornell University für die Bereitstellung von pClyA-GFP-Plasmid14; und Dr. Mark Goulian von der University of Pennsylvania für die Bereitstellung des E. coli MP113.

<ol><li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li>
<li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li>
<li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197(2009).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand%3A+a+retrospective+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li>
<li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15%2Flactadherin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).</li>
<li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Im obigen Protokoll wird eine Methode beschrieben, die skalierbar ist und EVs zuverlässig von verschiedenen gramnegativen/positiven und aeroben/anaeroben Bakterien isoliert. Es hat mehrere potenzielle Haltepunkte während des gesamten Verfahrens, obwohl es besser ist, nicht länger als 48 Stunden zu benötigen, um EVs aus konditionierten Bakterienkulturmedien zu isolieren.
Erstens besteht es aus der Kultivierung von Bakterien, um ein konditioniertes Bakterienkulturmedium zu erzeugen. Es wurde fes...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanometergroße, liposomenähnliche Strukturen, die aus Lipiden, Proteinen, Glykanen und Nukleinsäuren bestehen und sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen abgesondert werden1. Seit den frühen Studien, die die Freisetzung von EVs aus gramnegativen Bakterien visualisierten2, hat die Anzahl der biologischen Funktionen, die bakteriellen EVs (20-300 nm Durchmesser) zugeschrieben werden, in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen. Zu ihren Funktionen gehören die Übertragung von Antibiotikaresistenz3, Biofilmbildung4, Quorum Sensing5 und Toxinabgabe6. Es besteht auch ein wachsendes Interesse an der Verwendung bakterieller EVs als Therapeutika, insbesondere in der Vakzinologie7 und Krebstherapie8.
Trotz des wachsenden Interesses an der EV-Forschung gibt es immer noch technische Herausforderungen in Bezug auf Methoden der Isolierung. Insbesondere besteht ein Bedarf an Isolationsmethoden, die reproduzierbar, skalierbar und kompatibel mit verschiedenen EV-produzierenden Organismen sind. Um einen einheitlichen Satz von Prinzipien für die Planung und Berichterstattung von EV-Isolierung und Forschungsmethoden zu schaffen, veröffentlicht und aktualisiert die International Society for Extracellular Vesicles das MISEV-Positionspapier9. Darüber hinaus bietet das EV-TRACK-Konsortium eine offene Plattform für die Berichterstattung über detaillierte Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in veröffentlichten Manuskripten verwendet werden, um die Transparenz zu erhöhen10.
In diesem Protokoll wurden frühere Methoden zur Isolierung von EVs aus Säugetierzellkulturen angepasst11,12, um die Isolierung von EVs aus bakteriellen Zellkulturen zu ermöglichen. Wir haben versucht, Methoden einzusetzen, die eine EV-Isolierung von einer Vielzahl von Mikroben ermöglichen, die skalierbar sein können, und EV-Reinheit und -Ausbeute ausgleichen (wie im MISEV-Positionspapier9 diskutiert). Nach dem Entfernen von Bakterienzellen und Trümmern durch Zentrifugation und Filtration wird das Kulturmedium entweder durch Zentrifugalgeräte-Ultrafiltration (für ein Volumen von bis zu ~100 ml) oder pumpengetriebene TFF (für größere Volumina) konzentriert. Elektrofahrzeuge werden dann durch SEC mit Säulen isoliert, die für die Reinigung kleiner Elektrofahrzeuge optimiert sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über den Workflow für die bakterielle EV-Isolierung. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TFF = tangentiale Strömungsfiltration; SEC = Größenausschlusschromatographie; MWCO = Molekulargewichtsgrenze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ein Mauskommensalstamm von Escherichia coli (d.h. E. coli MP113) wurde als Modellorganismus verwendet und modifiziert, um EV-assoziierte Nanoluciferase durch Fusion zu Cytolysin A zu exprimieren, wie bereits berichtet14. Die hier verwendeten Methoden können mindestens bis zu mehreren Litern Bakterienkulturen verarbeiten und EV-assoziierte von nicht-EV-assoziierten Proteinen effektiv trennen. Schließlich kann diese Methode auch für andere grampositive und gramnegative Bakterienarten angewendet werden. Alle relevanten Daten der gemeldeten Experimente wurden an die EV-TRACK Knowledgebase (EV-TRACK ID: EV210211)10 übermittelt.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL dünnwandige PCR-Röhrchen mit flachem Deckel</td><td>Thermo Scientific</td><td>3430</td><td>Es ist wichtig, dünnwandige PCR-Röhrchen zu verwenden, um genaue Messwerte mit Qubit</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd (Formaldehyd) wässriger Lösung</td> zu erhalten <td>Elektronenmikroskopie sciences</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Fiberlite Zentrifugenflaschen aus Polypropylen</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Fiberlite Zentrifugenflaschen aus Polypropylen</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 mm Adapter für Polypropylen-Flaschen mit rundem Boden/konischem</td><td>Boden Beckman Coulter</td><td>392077</td><td>Ermöglicht den Einbau von Vivacell in Rotor</td></tr><tr><td>Akkermansia mucinophila</td><td></td><td>ATCC BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 XPI Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td>Nicht mehr verkauft von Beckman. Die Avanti J-26XP ist das nächstgelegene zeitgenössische Modell.</td></tr><tr><td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td><td>ATCC</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium breve</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium dentium</td><td>ATCC</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion (BHI) Bouillon</td><td>Himedia</td><td>M2101</td><td>Nach dem Autoklavieren wurden sowohl BHI-Bouillon als auch Agar in die anaerobe Kammer eingebracht, ergänzt mit Menadion (1 & micro; g/L), Hämatin (1,2 &μ; g/L) und L-Cysteinhydrochlorid (0,05 %). Sie wurden dann mindestens 24 Stunden unter anaeroben Bedingungen inkubiert, bevor sie mit den anaeroben Bakterienstämmen inokuliert wurden.</td></tr><tr><td>C-300 Mikrofluidik-Kartusche</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskop</td><td>FEI Firma</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HST08 (Steller kompetente Zellen)</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MP1</td><td>Dr. Mark Goulian (Geschenk)</td><td></td><td>kommensale Bakterien aus dem Darm der Maus</td></tr> Adapter <tr><td>Fiberlite 500 mL auf 250 mL ThermoFisher</td><td></td><td>010-0151-05</td><td>in Verbindung mit dem Fiberlite-Rotor, um die Verwendung von 250-ml-Flaschen für kleinere Startbakterienkulturen zu ermöglichen</td></tr><tr><td>Fiberlite Zentrifugenrotor mit festem Winkel</td><td>ThermoFisher</td><td>F12-6x500-LEX</td><td>passt für 6 x 500 mL Flaschen</td></tr><tr><td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Kupfer</td><td>Elektronenmikroskopie FCF-400-CU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (EM-Qualität, 10 % wässrige Lösung)</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>Hämatin</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>Stammlösung wurde hergestellt in 0,2 M L-Histidin-Lösung als&nbsp; 1,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Infinite M Nano+ Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>Dieses Gerät wurde zur Messung der mCherry-Fluoreszenz-In-Fusion</td></tr>&<tr><td>nbsp; HD Cloning Plus</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>Zum Klonieren der PCR-Fragmente in die PCR-lineraisierten Vektoren</td></tr><tr><td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Lauria Bertani (LB) Brühe, Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein Hydrochlorid</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>Es sollte gewogen und direkt zu den autoklavierten BHI-Medien im anaeroben </td></tr><tr><td>Kammer Masterflex Fitting, Polypropylen, gerade, weiblich Luer auf Schlauchtülle Adapter, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - spezielle</td><td>HV-30800-08</td><td>Anschlussadapter für Filtrationsschlauchkreislauf</td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, Polypropylen, gerade, männlich Luer auf Schlauchtülle Adapter, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - spezielle</td><td>HV-30800-24</td><td>Anschlussadapter für Filtrationsschlauchkreislauf</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Analoger Konsolenantrieb mit variabler Drehzahl, 20 bis 600 U/min</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load-Kopf für Präzisionsschläuche, 4 Rollen, PARA-Gehäuse, SS-Rotor</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Präzisions-Pumpenschlauch, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06435-16</td><td>Schlauch mit geringer Bindung/geringer Auslaugung</td></tr><tr><td>Menadion (Vitamin K3)</td><td>MP</td><td>102259</td><td>Stammlösung wurde in Ethanol hergestellt als 1 mg/mL</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41,5 CM 100K MPES 0,5 MM FLL X FLL 1/PK</td><td>Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td><td>TFF-Gerät, das wir verwendet haben, um bis zu 2 L E. coli-Kulturüberstand</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>zu filtrieren Dieses Assay-Kit wurde verwendet, um die Lumineszenz des nluc-Reporterproteins</td></tr><tr><td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antikörper zu messen, Klonen 965808</td><td>R& D</td><td>Systems MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Mikrofluidik resistives Pulsmessgerät</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Viewer</td><td>Spectradyne</td><td></td><td>Analysesoftware für die Partikelgrößenverteilung</td></tr><tr><td>OneTaq 2x Master Mix mit Standardpuffer</td><td>NEB</td><td>M0482</td><td>DNA-Polymerase-Mastermix zur Durchführung von Routine-PCR-Reaktionen zur Koloniekontrolle</td></tr><tr><td>Protein LoBind, 2,0 mL, PCR Saubere Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>DNA-Polymerase-Mastermix zur Durchführung der PCR-Reaktionen, die für die Klonierung von</td></tr><tr><td>qEV original benötigt werden, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>maximales Beladungsvolumen von 0,5 mL</td></tr><tr><td>qEV Rack</td><td>Izon</td><td></td><td>zur Verwendung mit den qEV-original SEC Säulen</td></tr><tr><td>qEV-2, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>maximales Ladevolumen von 2 mL</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Artikel nicht mehr lieferbar. Das nächstgelegene verfügbare Produkt ist das Qubit 4.0 Fluorometer (Kat. Nein. Q33238)</td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>Kit bei Raumtemperatur lagern. Normen werden bei 4 °C gelagert.</td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 Zentrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Mikroplatten-Reader</td><td>Molekulare Geräte</td><td></td><td>Dieses Gerät wurde zur Messung der Nanoluziferase-Biolumineszenz</td></tr><tr><td>verwendet Stericup Quick-release-GP Steriles Vakuumfiltrationssystem (150, 250 oder 500 ml)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE</td><td>Ein oder mehrere Filter können verwendet werden, um das Arbeitsvolumen aufzunehmen. Unserer Erfahrung nach können Sie das Doppelte des auf der Produktgröße angegebenen Volumens filtern.</td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobe Vinylkammer</td><td>Coy Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100, 100.000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VC1042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Plus Spritzenvorsatzfilter (0,02 Mikron)</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA68093002</td><td>zum Filtern von MRPS-Verdünnungsmittel</td></tr></tbody></table>

skalierbare isolierung und reinigung extrazellulärer vesikel aus escherichia coli und anderen bakterien

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Verschiedene Bakterienarten sezernieren ~20-300 nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykanen und anderen Molekülen bestehen, die von den Elternzellen stammen. EVs fungieren als intra- und interspezielle Kommunikationsvektoren und tragen gleichzeitig zur Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsorganismen im Kontext von Infektion und Besiedlung bei. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die EVs in Gesundheit und Krankheit zugeschrieben werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, EVs für In-vitro- und In-vivo-Studien zu isolieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Trennung von EVs basierend auf physikalischen Eigenschaften, nämlich der Größe, die Isolierung von Vesikeln aus verschiedenen Bakterienkulturen erleichtern würde.
Der Isolationsworkflow besteht aus Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Isolierung von EVs aus Bakterienkulturen. Ein pumpengetriebener Tangential-Flow-Filtrationsschritt (TFF) wurde integriert, um die Skalierbarkeit zu verbessern und die Isolierung von Material aus Litern Ausgangszellkultur zu ermöglichen. Escherichia coli wurde als Modellsystem verwendet, das EV-assoziierte Nanoluciferase und nicht-EV-assoziierte mCherry als Reporterproteine exprimiert. Die Nanoluciferase wurde gezielt auf die EVs gerichtet, indem ihr N-Terminus mit Cytolysin A fusioniert wurde. Frühe Chromatographiefraktionen, die 20-100 nm EVs mit assoziiertem Cytolysin A - nanoLuc enthielten, unterschieden sich von den späteren Fraktionen, die die freien Proteine enthielten. Das Vorhandensein von EV-assoziierter Nanoluciferase wurde durch Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser EV-Isolations-Workflow ist auf andere gramnegative und grampositive Bakterienarten anwendbar, die mit dem menschlichen Darm assoziiert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration/TFF und SEC eine skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten ermöglicht. Die Verwendung eines standardisierten Isolationsworkflows wird vergleichende Studien mikrobieller Elektrofahrzeuge über Spezies hinweg erleichtern.

Um zu beurteilen, welche SEC-Chromatographiefraktionen für EVs angereichert waren, wurde die SEC-Säule mit 2 ml E. coli MP1-konditioniertem Kulturmedium beladen, das 1.000-fach durch TFF konzentriert worden war, und sequentielle Fraktionen wurden gesammelt. Unter Verwendung von MRPS wurde festgestellt, dass die Fraktionen 1-6 die meisten EVs enthielten (Abbildung 2A). Nachfolgende Fraktionen enthielten sehr wenige EVs, die anstelle von EV-freien Proteinen bestanden (<strong class="x...

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Dieses Protokoll ist wichtig, da es eine Möglichkeit bietet, extrazelluläre Vesikel aus einer Vielzahl von Bakterien auf hochreproduzierbare Weise zu isolieren. Das Tolle an dieser Technik ist, dass sie verwendet werden kann, um EVs aus ziemlich großen Umgebungen von Bakterienkulturen zu isolieren, was In-vivo-Studien ermöglicht. Während die Daten, die wir zeigen, präklinische Anwendungen widerspiegeln, ist es absehbar, dass dieses Protokoll an die Herstellung bakterieller EVs für Therapeutika angepasst werden könnte.Diese Methode kann mit geringfügigen Modifikationen auf jedes skalierbare Zellkultursystem angewendet werden. Aufgrund der Skalierbarkeit des Protokolls ist es wichtig, Filter und SEC-Spalten in geeigneter Größe zu haben, um die gewünschten Startvolumina der bakteriellen Zellkultur zu bewältigen. Die Verfahren demonstrieren Sadie Johnson, eine stellvertretende Technologin im Labor von Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, ein Onkologie-Stipendiat im Labor von Dr. Justin Lathia, und Akeem Santos, ein Forschungstechnologe in meinem Labor.Beginnen Sie mit der Impfung einzelner Kolonien von Escherichia coli in 250 bis 1000 Milliliter Luria-Bertani oder LB-Brühe mit einer sterilen Schleife. Dann inkubieren Sie die Kultur aerob in einem Schüttelinkubator bei 300 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden Inkubation klären Sie das Bakterienkulturmedium, indem Sie die Zellkulturen in saubere 500-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenflaschen überführen, um sie 15 Minuten lang in einem großvolumigen Rotor mit festem Winkel bei vier Grad Celsius und 5.000 mal G zu zentrifugieren.Den Überstand in saubere Zentrifugenflaschen überführen, indem Sie ihn 15 Minuten lang vorsichtig bei 10.000 mal G zentrifugieren. Als nächstes wird der Überstand in eine 0,2-μm-Polyethersulfon-Vakuumfiltervorrichtung geeigneter Größe überführt und die Filtervorrichtung an eine Vakuumwandversorgung angeschlossen. Wenn die Filtrationsrate deutlich sinkt, bewegen Sie das ungefilterte Material in ein neues Gerät.Das gefilterte Medium kann über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Um die vollständige Entfernung der lebensfähigen Zellen zu überprüfen, verteilen Sie ein Aliquot des gefilterten Überstands auf geeigneten Agarplatten und stellen Sie sicher, dass nach der Inkubation unter optimalen Bedingungen für den Bakterienstamm keine Kolonien vorhanden sind. Zum Aufkonzentrieren des gefilterten Mediums mit einem Volumen von 100 Milliliter werden 90 Milliliter gefiltertes Kulturmedium auf das Reservoir der Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 100-Kilodaltonnen-Molekulargewichtsabschaltung geladen und das Medium im schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15- bis 30-Minuten-Intervalle zentrifugiert, bis das Volumen des im oberen Reservoir befindlichen Reservoirs auf weniger als 0,5 Milliliter konzentriert ist.Um das Reservoir mit dem verbleibenden gefilterten Kulturmedium aufzufüllen, entfernen Sie den Durchfluss in der Unterseite des Geräts, um das Gleichgewicht wiederherzustellen. Wenn die Viskosität des konzentrierten Mediums im Reservoir sichtbar erhöht ist, verdünnen Sie das Medium mit PBS und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation erneut, um nicht-extrazelluläre Vesikel oder EV-Proteine zu reduzieren, die kleiner als der Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton sind. Dann das konzentrierte Medium in ein proteinarmes Binderohr überführen, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern Um das gefilterte Medium mit einem Volumen von mehr als 100 Milliliter zu konzentrieren, wählen Sie eine entsprechend große tangentiale Durchflussfiltration oder TFF-Vorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton.Nach dem Zusammenbau eines Filtrationskreislaufs, wie im Manuskript erläutert, pumpen Sie 200 Milliliter PBS in ein graduiertes Gefäß, um die geeignete Geschwindigkeit entsprechend der gewünschten Durchflussrate zu bestimmen. Wenn die Geschwindigkeit eingestellt ist, zirkulieren Sie das gefilterte konditionierte Medium mit etwa 200 Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur und sammeln Sie die Moleküle, die kleiner als 100 Kilodalton sind, wobei die Ultrafiltrationsmembran als Abfall in einem separaten Gefäß durchquert wird, bis das Volumen des konditionierten Mediums auf 100 bis 200 Milliliter reduziert wurde. Verdünnen Sie das gefilterte Volumen nacheinander um das Zweifache mit PBS und zirkulieren Sie das Medium mit der Pumpe in kleineren Gefäßen, um das Volumen auf 75 bis 100 Milliliter und dann auf 25 Milliliter und 10 Milliliter zu konzentrieren.Heben Sie den Zufuhrschlauch aus dem Probenbehälter und pumpen Sie, um den Filter zu reinigen, um die maximale Menge der Probe zu gewinnen. Die konzentrierte Probe wird in eine 15-Milliliter-Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton gebracht und in einem schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15 bis 30 Minuten zentrifugiert, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir weniger als zwei Milliliter beträgt. Das konzentrierte Medium wird in ein proteinarmes Binderohr überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern.Führen Sie zur Isolierung der EVs eine Größenausschlusschromatographie (SEC) durch, wobei eine kleine Säule mit einem 10-Milliliter-Bettvolumen für weniger als 100 Milliliter Ausgangsmaterial und eine größere Säule mit einem 47-Milliliter-Bettvolumen für mehr als 100 Milliliter Ausgangsmaterial verwendet wird. Einige Stunden vor dem Experiment bringen Sie die SEC-Säule und PBS auf Raumtemperatur und stabilisieren Sie die Säule anschließend in vertikaler Position mit einem Standard-Laborständer und -halter. Bevor Sie es an die SEC-Säule anschließen, hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie fünf Milliliter PBS durch die Fritte in einen Abfallbehälter fließen lassen.Schrauben Sie dann die Einlasskappe der Säule ab, um dem Probenreservoir zwei Milliliter PBS hinzuzufügen, und verbinden Sie das Reservoir vorsichtig mit der Säule, während das PBS durch die Fritte tropft. Für die Äquilibrierung der Säule fügen Sie 47 Milliliter PBS in das Probenreservoir hinzu, gefolgt von der Entdeckelung der Unterseite der SEC-Spalte. Lassen Sie dann den gesamten geladenen Probenpuffer durch die Spalte fließen und verwerfen Sie den Durchfluss.Nachdem Sie zwei Milliliter der Probe auf das Probenreservoir geladen haben, lassen Sie die Probe vollständig in die Säule eindringen und sammeln Sie den Durchfluss. Sofort PBS in das Probenreservoir mit einem Volumen von 14,25 Milliliter abzüglich des Probenvolumens geben, damit die Lösung durch die Säule fließen kann, während die Menge verworfen wird, die dem Volumen des Säulenhohlraums entspricht. Als nächstes positionieren Sie ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen mit niedriger Bindung direkt unter der SEC-Säule, um den ersten Durchfluss oder die erste Fraktion zu sammeln, nachdem zwei Milliliter PBS durch die Säule laufen können.Fügen Sie dem Probenreservoir weiterhin zwei Milliliter PBS hinzu, um jede nachfolgende Fraktion zu sammeln. Lagern Sie die gesammelten Fraktionen bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Für die Sterilitätsprüfung der gesammelten EV-Fraktionen werden drei Milliliter des Kulturmediums mit 100 Mikrolitern der in Assays zu verwendenden Fraktionen beimpft.Dann kultivieren Sie das Medium unter optimalen Bedingungen unter Beobachtung der Trübung für mindestens drei Tage. Alternativ können die Fraktionsproben auf Agarplatten aufgetragen werden, die das Medium enthalten, das zum Züchten der produzierenden Bakterien verwendet wird, und dann auf Koloniebildung prüfen. Als nächstes lagern Sie die EVs, indem Sie 25 bis 50% der einzelnen oder gepoolten Fraktionen bei minus 80 Grad Celsius in proteinarme Binderöhrchen übertragen, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.Die repräsentative Analyse zeigt die Elution von Escherichia coli MP1 EVs in den frühen Chromatographiefraktionen. Die Fraktionen eins bis sechs enthielten die meisten EVs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 100 Nanometern. Gleichzeitig enthielten die nachfolgenden Fraktionen EV-freie Proteine und sehr wenige EVs.Die EV-Anreicherung und -Größe wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt, insbesondere in den Fraktionen zwei bis sechs. Es wurde beobachtet, dass EV-angereicherte Fraktionen zwei bis sieben eine hohe Nanoluciferase-Aktivität aufwiesen, aber nur ein sehr niedriges Fluoreszenzsignal von nicht-EV-assoziiertem mCherry im Vergleich zu dem der späteren Fraktionen. Die Immunogold-Markierung bestätigte die EV-Assoziation von Nanoluciferase in Fraktionen zwei bis fünf.Die Anwendbarkeit des Protokolls auf die anderen Bakterienarten wurde bewertet, indem EVs aus den Kulturen verschiedener anaerober Bakterien isoliert wurden. Es wurde beobachtet, dass die frühen Chromatographie-Fraktionen eins bis vier für EVs mit einer Durchmessergröße von weniger als 100 Nanometern angereichert waren. Die komplexe Hirn-Herz-Infusion (BHI) enthielt die EV-großen Partikel bei weniger als 25% der gesamten EV-Ausbeute.Es ist wichtig, TFF-Geräte zu verwenden, die in der Lage sind, das Startvolumen der bakteriellen Zellkultur zu handhaben. Diese Technik ermöglicht es uns, genügend EVs zu erzeugen, um biologische Fragen zu ihrer Funktion in komplexen Tiermodellen zu stellen.

scalable-isolation-purification-extracellular-vesicles-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Watson, D. C., et.al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von extrazellulären Vesikeln (EVs), die aus der äußeren Membran von gentechnisch veränderten Bakterien gewonnen werden. Der Prozess umfasst die Kultivierung der Bakterien, um EVs freizusetzen, gefolgt von sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten, um Zellen und Ablagerungen...

Isolierung und Anreicherung von extrazellulären Vesikeln aus der äußeren Membran aus Bakterien

Quelle: Watson, D. C., et al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Verwendung der Größenausschlusschromatographie mit porösen Harzkügelchen zur Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus einem Bakterienkulturfiltrat. Größere EVs eluieren früh, indem sie die Harzporen umgehen, während kleinere Proteine in die Poren eindringen und später eluieren.

Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie 

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik – Größenausschlusschromatographie – um eine heterogene Population von äußeren Membranvesikeln oder OMVs zu trennen, die von Bakterien abstammen. Diese Vesikel sind kugelförmige Strukturen in Nanogröße und werden durch Size Exclusion Chromatography in große und kleine Subpopulationen unterteilt, die auf ihrer Größe basieren.

Größenausschlusschromatographie-basierte Trennung bakterieller extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Trennung heterogener Populationen gramnegativer bakterieller Vesikel der äußeren Membran anhand ihrer Größe

Dieses Video zeigt die Größenausschlusschromatographie (SEC) Technik zur Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus dem Kulturfiltrat von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Bei der Technik wird eine poröse, mit Harz gefüllte Säule verwendet, um gereinigte Fraktionen von EVs zu erhalten. Die porösen Partikel lassen selektiv kleinere Proteine in die Poren eindringen, was zu einer langsameren Elution führt. Gleichzeitig werden EVs aufgrund ihrer größeren Größe vom Eindringen in die...

Eine Größenausschlusschromatographie-Technik zur Reinigung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel

Ein Protokoll für die Produktion, Reinigung und Verwendung von enzymverpackten äußeren Membranvesikeln (OMV), das eine verbesserte Enzymstabilität für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen bietet, wird vorgestellt.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur bakteriellen Herstellung von rekombinanten Proteinen, einschließlich typischerweise unlöslicher oder Disulfidbrücken-haltiger Proteine, die in extrazellulären membrangebundenen Vesikeln verpackt sind. Dies hat das Potenzial, auf vielseitige Bereiche der wissenschaftlichen Forschung angewendet zu werden, einschließlich der angewandten Biotechnologie und der Medizin.

Optimierte Herstellung und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.

Isolierung und Aufreinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation

Lernen Sie die skalierbare Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli mittels Filtration und Größenausschlusschromatographie. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht präklinische und therapeutische Anwendungen.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Weitere Videos entdecken