Modellierung einer Enzym-Aktiv-Site mit Molekularer Visualisierung Freeware
25. Dezember 2021
Eine Schlüsselkompetenz in der biomolekularen Modellierung ist die Darstellung und Annotation aktiver Zentren in Proteinen. Diese Technik wird mit vier beliebten kostenlosen Programmen für die makromolekulare Visualisierung demonstriert: iCn3D, Jmol, PyMOL und UCSF ChimeraX.
Die Visualisierung biologischer Makromoleküle ist eine entscheidende Fähigkeit für Studenten und Fachleute in den Biowissenschaften. In diesem Protokoll demonstrieren wir, wie das aktive Zentrum des Enzyms Glucokinase mit vier frei verfügbaren Programmen zur molekularen Modellierung modelliert werden kann. Dieses Tutorial hebt mehrere Schritte des Protokolls für jedes Programm hervor, einschließlich der Auswahl gebundener Liganden und der Verwendung der Liganden zur Anzeige von Aminosäuren und Wassermolekülen innerhalb von fünf Angströmen.
Die unterstützenden Informationen dieses Manuskripts enthalten ein spezielles Video für jedes Programm, das alle Schritte des Protokolls mit weiteren Erklärungen beschreibt. Die Struktur wird PDBID modellieren. 3FGU stellt den katalytischen Komplex des Enzyms Glucokinase dar.
Das aktive Zentrum des Enzyms ist an zwei seiner Substrate gebunden, Beta-D-Glucose, die den Identifikator BGC und ein Magnesiumion MG erhalten hat. Zusätzlich ist dieses Substratanalogon, ein Phosphoaminophosphorsäure, Adenylatester, ANP an das aktive Glucokinase-Zentrum gebunden. Dieses nicht hydrolysierbare Analogon von Adenosintriphosphat, ATP, verhindert das Auftreten der Phosphorylierungsreaktion, die den Active-Site-Komplex vor der Katalyse einfängt. Die Oberfläche des Modellierungsprogramms UCSF ChimeraX enthält Dropdown-Menüs, eine Symbolleiste, den Struktur-Viewer und eine Kommandozeile.
Wir beginnen das Protokoll mit Schritt 1.4 und wählen Rückstände innerhalb von fünf Angströmen aus, um ein aktives Zentrum zu definieren. Um die Liganden auszuwählen, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf ein beliebiges Atom oder eine Bindung in jedem der drei Liganden. Drücken Sie die Nach-oben-Taste, bis alle drei Liganden mit einem grünen Leuchten markiert sind.
Definieren Sie die Auswahl für die zukünftige Verwendung, indem Sie im Dropdown-Menü klicken, Selektor definieren auswählen, Liganden für den Auswahlnamen eingeben und auf OK klicken. Wählen Sie erneut über das Auswahlmenü die Option Zone aus. Schalten Sie dies auf Rückstände um und stellen Sie sicher, dass das obere Kästchen aktiviert ist.
Klicken Sie auf OK. Beachten Sie, dass die Teile des Cartoons innerhalb von fünf Angströmen dieser Liganden hervorgehoben sind. Um die Seitenketten als Sticks anzuzeigen und die aktiven Wassermoleküle anzuzeigen, verwenden Sie das Menü Aktionen Atombindungen, um sie anzuzeigen.
Oder schalten Sie sie mit diesen Schaltflächen hier ein. Um die Auswahl zu löschen, klicken Sie auf eine beliebige Stelle im leeren Bereich. Das Endergebnis dieses Protokolls sollte ein Modell mit dem aktiven Zentrum des Proteins und den Liganden sein, die als Stäbe kontrastreich gefärbt dargestellt sind.
Wichtige polare Bindungswechselwirkungen werden mit gepunkteten Linien dargestellt und einige der Rückstände, die Kontakte herstellen, sind markiert. Die iCn3D-Oberfläche enthält Dropdown-Menüs, den Struktur-Viewer und ein Befehlsprotokoll. In dieser Ansicht werden die Auswahlsätze sowie die Einblendmenüs für Sequenzen und Anmerkungen angezeigt, die angezeigt werden, wenn der Benutzer Befehle ausführt, die sie erfordern.
Wir beginnen das Protokoll in Schritt 2.4 und wählen Rückstände innerhalb von fünf Angströmen aus, um ein aktives Zentrum zu definieren. Um die Liganden auszuwählen, verwenden Sie das Auswahl-Dropdown-Menü und klicken Sie auf Auf 3D auswählen, stellen Sie sicher, dass die Rückstandszahl aktiviert ist. Halten Sie die Alt-Taste auf einem PC oder die Optionstaste auf einem Mac gedrückt und klicken Sie auf den ersten Liganden.
Drücken Sie dann die Strg-Taste und klicken Sie auf die verbleibenden zwei Ligan, um sie der Auswahl hinzuzufügen. Speichern Sie die Auswahl über das Dropdown-Menü, klicken Sie auf Auswählen, speichern Sie die Auswahl, geben Sie einen Namen ein und klicken Sie auf Speichern. Das Einblendmenü "Auswahlsätze" wird nun mit den drei ausgewählten Liganden angezeigt.
Wählen Sie nun die Reste innerhalb von fünf Angströmen der Liganden aus. Verwenden Sie das Dropdown-Menü und wählen Sie nach Entfernung. Ändern Sie im angezeigten Popup-Menü den zweiten Elementspeer mit einem Radius in fünf Angström, indem Sie den Block eingeben und auf Anzeigen klicken.
Schließen Sie dann das Fenster, indem Sie auf das X in der oberen rechten Ecke klicken. Speichern Sie die fünf angstrom aktive Website, indem Sie auf das Dropdown-Menü klicken, Auswahl speichern auswählen und die Tastatur verwenden, um einen Namen einzugeben. Klicken Sie dann auf Speichern.
Erstellen Sie nun eine neue Auswahl, die die beiden Sätze kombiniert. Diese können im Einblendmenü "Auswahlsätze" kombiniert werden. Klicken Sie auf einem PC bei gedrückter Ctrl-Taste auf die beiden Sätze oder klicken Sie auf einen Mac-Befehl.
Klicken Sie erneut auf das Dropdown-Menü, wählen Sie Auswahl speichern, geben Sie einen neuen Namen ein und klicken Sie dann auf Speichern. Um Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen anzuzeigen, verwenden Sie das Analysemenü und wählen Sie Wechselwirkungen. Wir werden uns hier nur für Wasserstoffbrücken und Salzbrücken interessieren.
Also werden wir den Rest davon deaktivieren. Wir wählen drei Liganden aus. Und für den zweiten Satz die Rückstände innerhalb von fünf Angströmen.
Klicken Sie auf 3D-Anzeigeinteraktionen und schließen Sie das Fenster. Dies zeigt einige der Rückstände, die interagieren, aber es zeigt nicht die gesamte aktive Stelle der fünf Angström. Um dies anzuzeigen, verwenden Sie erneut das Menü "Sets auswählen".
Klicken Sie auf fünf Angstrom voll und klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Seitenketten und Sticks stylen. Um CPK-Färbung anzuwenden, klicken Sie auf das Farb-Dropdown-Menü und klicken Sie auf Atom. Das Endergebnis des Protokolls sollte ein Modell sein, das so aussieht, wobei das aktive Zentrum des Proteins und der Liganden als Stäbe kontrastreich gefärbt dargestellt werden.
Wichtige Bindungswechselwirkungen werden mit gepunkteten Linien dargestellt und alle Reste innerhalb einer der Auswahlen, die während des Protokolls erstellt wurden, werden markiert. Die Jmol-Oberfläche enthält Dropdown-Menüs, eine Symbolleiste, den Struktur-Viewer, ein Popup-Menü und die Jmol-Konsole mit der Befehlszeile. Wir beginnen das Jmol-Protokoll in Schritt 3.4 und wählen Reste innerhalb von fünf Angström aus, um ein aktives Zentrum zu definieren.
Die Jmol-Konsole ist der beste Weg, um die Rückstände innerhalb von fünf Angström auszuwählen. Geben Sie diesen Befehl ein, um Reste innerhalb von fünf Angströmen der drei Liganden auszuwählen. Es werden 193 Atome ausgewählt, die jedoch nicht die vollständigen Aminosäurereste darstellen.
Um diese auszuwählen, verwenden Sie den eingegebenen Befehl, wählen Sie innerhalb (Gruppe, ausgewählt) und drücken Sie die Eingabetaste. Beachten Sie, dass zusätzliche Auswahlhalose angezeigt werden. Um diese Rückstände als Sticks anzuzeigen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das Popup-Menü aufzurufen, bewegen Sie den Mauszeiger über Stil, Schema und klicken Sie dann auf Sticks.
Beachten Sie, dass es hier immer noch einige leere Halos gibt. Dies sind die Wassermoleküle im aktiven Zentrum. Um nur die Wassermoleküle auszuwählen, können wir diesen Befehl erneut ausführen und dann ändern.
Klicken Sie in die Konsole, verwenden Sie dann die Pfeiltasten nach oben, um diesen Befehl zu finden, und klicken Sie auf die Eingabetaste, um ihn erneut auszuführen. Um die Wassermoleküle als Atome darzustellen, wollen wir die Selektion des Liganden und des Proteins aufheben. Dazu geben wir zwei Befehle ein.
Unsere Ligane werden als Heterogruppen betrachtet, aber Wasser wird auch als eine betrachtet. Innerhalb dieses Befehls müssen wir also definieren, dass wir das Wasser nicht entfernen. Drücken Sie die Eingabetaste und jetzt werden nur noch die Wassermoleküle ausgewählt.
Klicken Sie auf das Dropdown-Anzeigemenü, bewegen Sie den Mauszeiger über Atom und klicken Sie auf 20% des Van der Waals-Radius. Das grüne Magnesiumion wird immer noch als Sticks dargestellt. Häufiger werden Ionen als Kugeln dargestellt.
Klicken Sie in die Jmol-Konsole und geben Sie dann SELECT MG und dann Space Fill 50% ein Die Liganden innerhalb der Ketten sind identisch gefärbt. Um sie voneinander zu unterscheiden, ist es sinnvoll, die Liganden neu einzufärben. In der Konsole führe ich einen mehrzeiligen Befehl aus, den ich aus einem Spickzettel kopiert und eingefügt habe, den ich im Jmol-Ergänzungsvideo nähere.
Das Ergebnis dieses Protokolls sollte ein Modell sein, das so aussieht, wobei das aktive Zentrum des Proteins als Sticks dargestellt wird. Und die Liganden zeigten uns Stöcke in einem weicheren Farbschema. Gelbe Linien zeigen die Bindungswechselwirkungen an und einzelne Reste werden wie gewünscht markiert.
Die PyMOL-Oberfläche enthält Dropdown-Menüs, den Struktur-Viewer, das Namensobjektfenster und das Maussteuerungsmenü. Die Hauptbefehlszeile ist in dieser Abbildung ebenfalls beschriftet. Wir beginnen das Primärprotokoll in Schritt 4.4 und wählen Reste innerhalb von fünf Angströmen aus, um ein aktives Zentrum zu definieren.
Um die Liganden auszuwählen, klicken Sie auf jeden von ihnen. Es erscheint eine neue Auswahl, die durch Klicken auf die Schaltfläche A umbenannt werden kann. Löschen Sie mit der Tastatur die Buchstaben sele und geben Sie an ihrer Stelle Ligan ein.
Drücken Sie die Eingabetaste. Wir können diese Auswahl verwenden, um den Bereich um ihn herum zu definieren. Klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche A und wählen Sie das Menüelement duplizieren aus.
Klicken Sie in dieser neuen Auswahl sel01 auf A, und wählen Sie das Menüelement umbenennen aus. Löschen Sie auf der Tastatur die vorhandenen Buchstaben, und geben Sie active ein. Dies ist immer noch die Auswahl unserer drei Liganden, so dass wir es erneut ändern müssen, indem wir die Schaltfläche A-Aktionen verwenden.
Klicken Sie auf die Schaltfläche, wählen Sie Ändern und erweitern Sie die Auswahl um fünf Angström. Jetzt haben wir die Liganden und die Rückstände innerhalb von fünf Angströmen erfasst. Das S auf der S-Taste steht für Show.
Klicken Sie darauf, um das Protein auf verschiedene Arten anzuzeigen. Wir zeigen dieses Lakritz als Stöcke. Klicken Sie in den leeren Bereich, um die Auswahl zu löschen.
Dies hat die Aminosäuren innerhalb von fünf Angströmen eingefangen, aber nicht das Wasser. Wir können die Auswahl erneut duplizieren und jetzt ändern, um nur das Wasser auszuwählen. Duplizieren Sie in den Aktionen A die Schaltfläche A.
Auswahl 2 wird angezeigt. Benennen wir dies in aktives Wasser um. Dieses Mal verwenden wir die A-Taste, um die Atome um unsere Auswahl herum auszuwählen.
Atome innerhalb von vier Angströmen. Dieser hat das Wasser aber auch einige Atome der Seitenketten ausgewählt. Um dies weiter zu ändern, verwenden Sie die A-Taste, um zu ändern und auf Lösungsmittel zu beschränken.
Jetzt können wir sehen, dass nur die Wassermoleküle beleuchtet sind. Auch in der A-Taste können wir eine Voreinstellung anwenden. Wählen Sie Preset, Ball und Stick und jetzt werden die Wassermoleküle als Kugeln angezeigt.
Das Endergebnis des Protokolls ist ein Modell, das so aussieht, wobei die aktive Stelle in Liganden als Stäbe dargestellt wird, die kontrastreich gefärbt sind. Gelbe Strichlinien zeigen polare Bindungswechselwirkungen und einzelne Rückstände werden mithilfe der im Namensobjektfenster erstellten Auswahl markiert. Fehler bei der Ausführung des Protokolls können zu suboptimalen Ergebnissen führen.
Zum Beispiel wird das gesamte Protein als Sticks dargestellt. Zur Fehlerbehebung muss der Benutzer zunächst die Stick-Darstellung für die gesamte Struktur ausblenden. Zeigen Sie dann die Stick-Darstellung nur für das Objekt an, das mit der Schaltfläche S als aktiv bezeichnet wird.
Hier werden die mit jedem Programm generierten Modelle nebeneinander dargestellt. Obwohl es Unterschiede in der Darstellung des Enzyms gibt, können in jedem der vier Modelle die gleichen Schlüsselmerkmale und Wechselwirkungen beobachtet werden. Ein Benutzer, der daran interessiert ist, eines der Programme zu beherrschen, die eine Befehlszeile enthalten, möchte lernen, wie man eingegebene Befehle anwendet und ändert.
Wie ich im Jmol-Protokoll angedeutet habe, ist ein nützliches Werkzeug ein Befehlsspickzettel. Eine Nur-Text-Datei, die häufig verwendete Codes enthält, auf die verwiesen werden soll. Um ein fortgeschrittener Benutzer zu werden, ist es nützlich zu verstehen, welche Teile des Protokolls angepasst und geändert werden können.
Mit der Praxis können diese Protokolle angewendet werden, um jedes enzymaktive Zentrum von Interesse zu modellieren.
Übersicht
Dieser Artikel demonstriert die Fähigkeit des biomolekularen Modellierens, indem die aktive Stelle des Enzyms Glucokinase mit vier kostenlosen Programmen visualisiert wird: iCn3D, Jmol, PyMOL und UCSF ChimeraX. Das Tutorial bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zum Modellieren und Annotieren der aktiven Stelle mit gebundenen Liganden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomolekulares Modellieren
- Proteindarstellung
- Analysen der aktiven Stelle von Enzymen
Hintergrund
- Das Verständnis von Proteinstrukturen ist entscheidend für die biologischen Wissenschaften.
- Wirkungsstellen sind für die Enzymfunktion und die Wechselwirkung mit Substraten unerlässlich.
- Zur Visualisierung von Makromolekülen stehen verschiedene Software-Tools zur Verfügung.
- Diese Studie konzentriert sich auf Glucokinase, ein Enzym, das am Glucosestoffwechsel beteiligt ist.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung, wie aktive Enzymstellen effektiv modelliert werden können.
- Vergleich unterschiedlicher Werkzeuge zur molekularen Visualisierung.
- Vorlage einer umfassenden Anleitung zur Auswahl und Darstellung von Liganden und Resten.
Verwendete Methoden
- Verwendung von iCn3D, Jmol, PyMOL und UCSF ChimeraX zur Modellierung.
- Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Auswahl von Resten innerhalb von fünf Ångström um Liganden.
- Visualisierung von Aminosäuren und Wassermolekülen in der Nähe von Liganden.
- Kennzeichnung wichtiger Wechselwirkungen und struktureller Merkmale.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Modellierung der aktiven Stelle der Glucokinase mit gebundenen Liganden.
- Deutliche Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substraten.
- Veranschaulichung der Funktionen jedes Software-Tools.
- Erstellung eines detaillierten Lehrvideos für jedes Programm.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert wertvolle Einblicke in biomolekulare Modellierungstechniken.
- Sie unterstreicht die Bedeutung von Software-Tools in der Strukturbiologie.
- Forscher können Enzym-Aktivzentren effektiv visualisieren und analysieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die biomolekulare Visualisierung ermöglicht die Zielvalidierung, indem sie die strukturellen Bestimmungsfaktoren der Ligandenbindung und der Enzymfunktion aufzeigt. Die Modellierung von Wirkstellen unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase, indem sie Struktur-Funktions-Beziehungen klärt. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen in Workflows zur Identifizierung von Leitstrukturen und zur Entwicklung von Assays.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Liganden-Bindungswechselwirkungen in der aktiven Stelle der Glucokinase.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem er Schlüssel-Aminosäurereste und Wassermoleküle identifiziert, die an der Substraterkennung beteiligt sind.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung durch strukturelle Erkenntnisse, die die Beurteilung von Zielvertrauen und Arzneimittelwirksamkeit unterstützen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte biologische Modelle für die nachgeschaltete Analyse, indem aktive Zentren-Reste innerhalb von fünf Ångström gebundener Liganden definiert werden.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch konsistente Visualisierung von Bindungswechselwirkungen in iCn3D, Jmol, PyMOL und UCSF ChimeraX.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform für Screening-Kampagnen, indem übertragbare Protokolle zur Modellierung beliebiger Enzym-Aktivzentren bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet strukturelle Erkenntnisse aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem die Konsistenz bei der Modellierung der Wirkstelle über verschiedene Arbeitsabläufe hinweg gewahrt bleibt.
- Mechanistische Ent风险minimierung: Hebt polare Bindungswechselwirkungen und Restmarkierungen hervor, um die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung und die Optimierung von Leitstrukturen zu unterstützen.
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die humane Glucokinase, ein Schlüsselenzym des Glucosestoffwechsels, das für Zielprogramme bei Diabetes und Stoffwechselerkrankungen relevant ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung, indem sie die strukturelle Analyse von Enzym-Ligand-Komplexen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem dargestellt wird, wie Liganden an die aktive Stelle der Glucokinase binden.
- Screening: Stellt die Bereitschaft des Assays sicher, indem standardisiert Reste und Wassermoleküle in der Nähe von Liganden ausgewählt und dargestellt werden.
- Analytik: Erzeugt quantitative strukturelle Ergebnisse wie die Visualisierung von Wasserstoffbrückenbindungen und die Beschriftung von Resten, die beim Vergleich von Liganden-Bindungsmodi helfen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem ein wiederverwendbares Framework zur Modellierung enzymatischer aktiver Stellen in krankheitsrelevanten Systemen bereitgestellt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare Fähigkeit zur Modellierung beliebiger enzymatischer aktiver Stellen, reduziert redundante Schulungen und erhöht die Konsistenz zwischen Teams.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei Enzym-Ligand-Wechselwirkungen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und plattformübergreifende Konsistenz in der biomolekularen Visualisierung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz in der frühen Entdeckungsphase und reduziertes biologisches Risiko in der Lead-Optimierung.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf struktureller Zuverlässigkeit und Zugänglichkeit der Bindungsstelle.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Grundkenntnisse in der Strukturbiologie und bei Protein-Ligand-Wechselwirkungen.
- Benötigt Zugang zu einer Recheninfrastruktur, die in der Lage ist, iCn3D, Jmol, PyMOL oder UCSF ChimeraX auszuführen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise im Team bei Visualisierungsprotokollen, um eine konsistente Interpretation von Aktivstellenmodellen sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf verschiedene Enzymsysteme oder Ligandentypen angewendet wird.
- Ist durch die Benutzerkompetenz in Befehlszeilenschnittstellen und Selektionswerkzeugen der vier Softwareplattformen begrenzt.
