Identifizierung der Quelle von sezernierten Proteinen in der Niere durch Brefeldin A-Injektion

Unsere Technik ermöglicht es uns, die Quelle und den relativen Beitrag von Zytokin-produzierenden Zellen in verletzten Nieren zu identifizieren. Die Verwendung von Brefeldin A zur Verhinderung der Proteinsekretion ermöglicht es uns, mehr Informationen über die Zellen zu sammeln, die Zytokine in festen Organen produzieren, wie z. B. den Zelltyp und den Zustand dieser Zellen.

Unser Protokoll sollte leicht an viele Organsysteme anpassbar sein. Da es sich bei Brefeldin A um ein zellpermeables kleines Molekül handelt, sollte es die Sekretion in den meisten Zelltypen hemmen und so den Nachweis von Zytokinen und anderen sezernierten Proteinen ermöglichen.

Die Steißbeininjektion ist der technisch anspruchsvollste Schritt, da das Steißbein der Maus recht klein ist. Wir empfehlen, diesen Schritt zu üben, bevor Sie unser Protokoll an Versuchstieren durchführen.

[Dozent] Beginnen Sie damit, den Käfig 10 Minuten lang halb auf, halb vom Heizkissen zu nehmen, um sicherzustellen, dass die Mäuse warm sind. Nachdem Sie die Maus in eine Rückhaltevorrichtung gelegt haben, desinfizieren Sie den Schwanz dreimal mit einem Povidon-Jod- und Alkoholtupfer. Halten Sie den Schwanz waagerecht und visualisieren Sie die seitlichen Schwanzvenen. Führen Sie dann eine 28-Gauge-Nadel ein und halten Sie die Nadel und die Spritze parallel zur Vene in Richtung des Kopfes. Injizieren Sie 200 Mikroliter der BFA-Lösung mit 1,25 Milligramm pro Milliliter. Die Vene sollte frei werden, wenn das Blut durch die Injektionslösung ersetzt wird. Entfernen Sie dann die Nadel und drücken Sie vorsichtig auf den Schwanz, bis die Blutung aufhört. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie auf zusätzliche Blutungen oder Anzeichen von Stress. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze und perfundieren Sie die Maus mit 10 bis 20 Millilitern PBS durch den linken Ventrikel mit einer Flussrate von zwei bis vier Millilitern pro Minute, bis das Perfusat klar wird. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie die Nierenarterie und -vene nahe an der Papille halten und das Gefäß an der von der Niere abgewandten Seite durchtrennen. Entfernen Sie dann vorsichtig die Nierenkapsel, indem Sie sie von Hand oder mit einer feinen sterilen Pinzette abziehen. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrieremarkierungsstift und skizzieren Sie die Gewebeabschnitte mit einem Abstand von mindestens fünf Millimetern zum Umriss der hydrophoben Barriere. Geben Sie dann 50 Mikroliter Blockierungspuffer mit 3 % Eselserum und 0,1 % Triton in 1 % Rinderserumalbumin TBS auf den Abschnitt. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Verdünnen Sie die Primärantikörper mit PBS in der entsprechenden Konzentration. Zum Nachweis von Zytokinen verdünnen Sie Antikörper, die gegen TGF beta one, PDGF-D oder CTGF gerichtet sind, in 50 Mikrolitern PBS. Geben Sie einen mit Cy3 konjugierten Anti-Alpha-SMA-Primärantikörper in Verdünnungen von 1:200 zur primären Antikörperlösung, um die Myofibroblasten zu markieren. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und geben Sie die primären Antikörper in den Schnitt, um sicherzustellen, dass er nicht aus der kreisförmigen hydrophoben Kontur austritt. Über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Nehmen Sie die befeuchtete Kammer aus dem Inkubator und waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang mit PBS. Als nächstes verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper bei eins bis 200 mit PBS. Inkubieren Sie die Proben mit 50 Mikrolitern Sekundärantikörperlösungen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Nehmen Sie die Objektträger aus der befeuchteten Kammer und waschen Sie sie fünf Minuten lang mit PBS. Verdünnen Sie Lotus tetragonolobus Lektin, konjugiert mit Fluorescein in PBS, mit Calcium und Magnesium in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter. Dann inkubieren Sie das Gewebe mit 50 Mikrolitern LTL-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Nehmen Sie die Objektträger aus der befeuchteten Kammer und waschen Sie sie fünf Minuten lang mit PBS mit Kalzium und Magnesium. Inkubieren Sie das Gewebe mit 50 Mikrolitern DAPI, um DNA-Kerne fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben. Einmal mit PBS waschen. Geben Sie 20 Mikroliter Antifading-Eindeckreagenz in das Gewebe, um die Deckgläser zu befestigen, und setzen Sie dann langsam den Deckglas ein. Warten Sie 24 Stunden, bis sich das Antifading-Reagenz verfestigt hat, bevor Sie die Bildgebung durchführen. Schalten Sie das inverse Mikroskop mit einem automatischen XY-Tisch ein und wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und lokalisieren Sie den Gewebeschnitt. Öffnen Sie dann die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf Live, um das Live-View-Fenster zu öffnen. Suchen Sie den Gewebeschnitt und stellen Sie sicher, dass er scharf ist. Klicken Sie auf das Erfassungsmenü und wählen Sie Großes Bild scannen. Richten Sie den zu scannenden Bereich ein, indem Sie den Tisch mit dem Joystick ganz links in den linken Teil des Gewebeschnitts bewegen und dann auf den Pfeil nach links klicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die obersten, rechten und unteren Gewebesegmente. Klicken Sie auf das Erfassungsmenü und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für die Mehrkanalerfassung aktiviert ist. Um Mehrkanalbilder aufzunehmen, klicken Sie auf die Registerkarte Lambda, klicken Sie auf jeden Kanal und stellen Sie die Belichtungszeit auf ein Niveau ein, bei dem die Färbung sichtbar ist, ohne dass ein Teil des Bildes gesättigt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal, der erfasst werden soll. Klicken Sie dann auf Scannen. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf Datei. Klicken Sie dann auf Öffnen und wählen Sie das Bild aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bildfenster und wählen Sie Polygonaler ROI. Skizzieren Sie den ROI mit einem Freihand-Tool. Umreißen Sie dann die LTL-positiven Tubuluszellen oder Alpha-SMA-positiven interstitiellen Zellen. Klicken Sie auf die Registerkarte Messung und dann auf den Schwellenwert. Legen Sie die oberen und unteren Schwellenwerte fest, indem Sie die Schieberegler auf beiden Seiten des positiven Signalbereichs anpassen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte ROI. Klicken Sie abschließend auf das Exportsymbol, um die Werte zu speichern. Verwenden Sie eine Tabellenkalkulationssoftware, um die Prozentsätze des positiven Signalbereichs pro ROI-Bereich zu berechnen.

[Moderator] TGF beta-positive Vesikel am dritten Tag nach Verabreichung von Cisplatin oder Kochsalzlösung sind in den repräsentativen Bildern zu sehen. TGF-beta-positive Vesikel werden in PTCs, die mit LTL markiert sind, in Cisplatin-behandelten Nieren in Gegenwart von BFA beobachtet. Diese Vesikel wurden jedoch nicht in unverletzten oder BFA-unbehandelten Nieren beobachtet.

[Dozent] Die Modifikation zeigte eine Zunahme des TGF-beta-positiven Bereichs bei BFA-Behandlung bei Cisplatin-induziertem akutem Nierenversagen. Ähnlich wie bei TGF beta akkumulierten auch PTGF-D-positive oder CTGF-positive Vesikel bei der Cisplatin-induzierten AKI. Die Quantifizierung zeigte, dass PDGF-D-positive und CTGF-positive Bereiche auch signifikant mit BFA erhöht waren. Bei LTL-positiven proximalen Tubuluszellen erhöhte die BFA-Injektion die BUN-Plasmaspiegel am dritten Tag nach der Cisplatin-Injektion nicht signifikant. TGF beta-positive Vesikel wurden in alpha-SMA-markierten interstitiellen Zellen in Cisplatin AKI unter BFA-Behandlung beobachtet. Die Modifikation zeigte, dass die TGF-beta-positiven Areale im alpha-SMA-positiven Areal durch die BFA-Behandlung bei Cisplatin AKI signifikant erhöht waren. Ähnlich wie bei TGF-Beta-positiven Vesikeln nahmen auch CTGF-positive Vesikel unter der BFA-Behandlung zu. Die Quantifizierung zeigte, dass die BFA-Behandlung das Verhältnis von CTGF-positiver Fläche zu alpha-SMA-positiver Fläche bei Cisplatin-induzierter AKI erhöhte. Im Vergleich zu einer Cisplatin-induzierten Schädigung waren TGF-beta-positive Vesikel in PTCs in der chronischen Phase der AA viel kleiner. Es gab eine minimale positive Färbung bei LTL-positiven PTCs. Die Signalintensität von TGF beta in positiven PTCs mit Nierenverletzungsmolekülen war jedoch unter der BFA-Behandlung erhöht. Die mittlere Intensität von TGF beta war bei BFA-Injektion dreimal höher als ohne BFA.

Der wichtigste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Schwanzveneninjektion erfolgreich ist. Eine fehlgeschlagene Injektion würde die Ergebnisse verschlechtern. Achten Sie also bitte auf die Anzeichen des Erfolgs, wie z.B. die Vene, die durch die Injektion frei wird, und suchen Sie bitte nach den Anzeichen des Versagens wie Schwellungen über den Schwänzen.

Die Brefeldin A-Injektion könnte mit einer Reihe von Assays kombiniert werden, einschließlich Western Blot oder Durchflusszytometrie, um die Zytokinproduktion auf Organ- oder Einzelzellebene zu bewerten.

Mit dieser Technik konnten wir neuartige Zytokine identifizieren, die von Nierenepithelzellen sezerniert werden und von denen bisher angenommen wurde, dass sie aus anderen Zelltypen stammen. Es kann verwendet werden, um langjährige Debatten über den Beitrag bestimmter Zelltypen zur Schädigung beizulegen.