Name: Erforschung des Arginin-Methyloms durch Kernspinresonanzspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung des Arginin-Methyloms mittels 1H-NMR-Spektroskopie für Krebsforschung und Biomarker-Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener biologischer Matrices wie Zellen, Gewebe und Biofluide.

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Die Arbeit wurde unterstützt durch die FWF-Förderungen P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (Flaggschiffprojekt DYNIMO), die Österreichische Forschungsförderungsgesellschaft (FFG) Grants 864690 und 870454, das Integrative Metabolism Research Center Graz; Österreichisches Infrastrukturprogramm 2016/2017, des Zukunftsfonds Steiermark und des Startup-Fonds für hochkarätige Talente der Fujian Medical University (XRCZX2021020). Wir danken dem Zentrum für Medizinische Forschung für den Zugang zu Zellkulturanlagen. F.Z. wurde im Rahmen des PhD-Programms Molekulare Medizin an der Medizinischen Universität Graz ausgebildet. Q.Z. wurde im Rahmen des PhD-Programms Metabolische und kardiovaskuläre Erkrankungen an der Medizinischen Universität Graz ausgebildet.

Hefeproteinhydrolysate wurden als Proben für die repräsentativen Ergebnisse dieser Arbeit verwendet. Das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
1. Aufbereitung von Materialien und Reagenzien
<ol><li>Methanol/Wasser: Herstellen einer Mischung aus zwei Teilen 99%igem Methanol (MeOH) und einem Teil H2O, bezeichnet als MeOH/H2O. LagernSie reines MeOH und MeOH/H2Obei -20 °C, um die Alkoholverdampfung zu minimieren und die Probenstabilität zu erhöhen.</li>
	<li>Salzsäure (HCl): 9 mol/L aus konzentriertem HCl (12,0 mol/L oder 37%) sowie 0,1 mol/L HCl verdünnen. Die höher konzentrierte (9 mol/L) Lösung wird für die Proteinhydrolyse verwendet, während die niedriger konzentrierte (0,1 mol/L) für die Festphasenextraktion verwendet wird. VORSICHT: Arbeiten Sie innerhalb des Abzugs.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Ersatzlösung für SPE vor, die 10 % gesättigte Ammoniaklösung (Bestand: 30 % Gew.-% Ammoniak), 50 % Methanol und 40 % Wasser (v/v) enthält.</li>
	<li>NMR-Puffer: 5,56 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4, 0,08 mol/L), 0,4 g 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d4-Natriumsalz (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (w/v) Natriumazid (NaN3) in 500 mL Deuteriumdioxid (D2O) lösen und auf pH 7,4 einstellen (unter Verwendung von HCl oder NaOH, (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Reinheit jeder neuen Puffercharge durch NMR-Spektroskopie. HINWEIS: Die Menge an Verunreinigungen (z. B. Ethanol) sollte so gering wie möglich sein.</li>
	<li>Füllen Sie die Auflöseröhrchen mit Zirkonoxidkügelchen (2 ml Röhrchen und 1,4 mm Kügelchen sind für die meisten Anwendungen geeignet, es sind jedoch verschiedene Varianten erhältlich) (siehe Materialtabelle). Füllen Sie ca. 10-20 Perlen von Hand oder kaufen Sie vorgefüllte Röhrchen, die ebenfalls erhältlich sind.</li>
	<li>Halten Sie Pipetten und die entsprechenden Spitzen im Bereich von 10-1.000 μL bereit. ANMERKUNG: Während der gesamten Arbeiten wurde hochreines Wasser verwendet, das alsH2O bezeichnetwird und sich durch einen hohen Widerstand von ≥18,2 MΩ·cm-1 auszeichnet. Es entspricht doppelt destilliertem Wasser.</li>
</ol>2. Probenentnahme und Lagerung
<ol><li>Die flüssigen Proben (Serum/Plasma, Zellkulturüberstand etc.) werden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.</li>
	<li>Bereiten Sie die festen Materialien wie unten beschrieben vor.<ol><li>Sammeln Sie die Zellen aus Zellkulturen (3-5 Millionen Zellen) entweder durch Sammeln adhärenter Zellen, nach dem Waschen mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, dem Abkratzen und Zentrifugieren oder dem direkten Zentrifugieren von Zellen, die in Suspension gezüchtet wurden.</li>
		<li>Die Zellüberstände (die für weitere Analysen gesammelt werden können, entweder durch aufeinanderfolgende direkte Messung, siehe Schritt 6, oder nach Fällung löslicher Proteine, siehe Schritt 3.1), werden entfernt, die Pellets werden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Zur weiteren Verarbeitung siehe Schritt 3.2.</li>
		<li>Lagerung und Sammlung der Gewebe gemäß dem Ziel der Studie. Bei sehr homogenen Geweben, wie Leber oder Muskeln, analysieren Sie einen Teil davon. Bestimmen Sie beispielsweise im Falle eines Mäusegehirns die globale Arginin-Methylierung des gesamten Gehirns oder der Gehirnabschnitte. HINWEIS: Das Idealgewicht der zu verarbeitenden Gewebe beträgt 30-60 mg. Es ist ratsam, das gesamte Gehirn einzufrieren und zu pulverisieren und Aliquots davon zu verwenden. Alternativ können bestimmte Gehirnteile (z. B. Stirn-, Kleinhirn-, Okzipitalregionen oder eine Hemisphäre mit einem Gewicht von ~ 250 mg) verwendet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorprobenvorbereitung
HINWEIS: Führen Sie die Arbeit auf Eis durch und halten Sie MeOH kalt. Die Proben müssen auch auf Eis gehalten werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
<ol><li>Bei flüssigen Proben werden 400 μl eiskaltes Methanol zu 200 μl der Probe gegeben. Fahren Sie mit Schritt 3.3 fort. HINWEIS: Wenn weniger Probe verfügbar ist, passen Sie die Lautstärken entsprechend an. Die NMR-Empfindlichkeit ist in der Regel für kleinere Probenmengen hoch genug, muss aber individuell getestet werden.</li>
	<li>Bei Feststoffen sind ausreichend 1,5-ml-Röhrchen für die Lysate vorzubereiten (Verwendung für die Zentrifugation nach der Homogenisierung).<ol><li>Vorsichtig, aber gründlich werden die Zellpellets in 600 μL MeOH/H2Oresuspendiert und die gesamte flüssige Phase in die Aufschlussröhrchen überführt.</li>
		<li>Legen Sie die Tücher in die Aufschlussröhrchen (Sie können sie direkt in die Röhrchen wiegen) und fügen Sie 600 μL MeOH / H2O hinzu (für 30-60 mg; anpassen, wenn das Gewicht erheblich abweicht).</li>
		<li>Die Röhrchen werden in den Gewebehomogenisator (siehe Materialtabelle) gegeben und entweder einmal für 20 s mit starkem Schütteln (für Zellpellets, Weichteile) oder zweimal für jeweils 20 s (oder länger, falls erforderlich) mit einem Abstand von 5 min dazwischen (für steife Gewebe) homogenisiert.</li>
		<li>Nach der Homogenisierung werden die Proben sofort wieder auf das Eis gelegt und die gesamten Lysate in neue 1,5-ml-Röhrchen überführt.</li>
	</ol></li>
	<li>Lagern Sie die Proben für mindestens 30 Minuten (bis zu mehreren Tagen) bei -20 °C, bevor sie weiterverarbeitet werden.</li>
	<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C. Bereiten Sie in der Zwischenzeit genügend 1,5-ml-Röhrchen vor, um die Überstände zu sammeln. HINWEIS: Dieser Überstand (in Abbildung 1 als "( 1)" bezeichnet) kann verworfen, lyophilisiert und direkt für NMR verarbeitet werden (Schritt 6) oder anderweitig analysiert werden.</li>
	<li>In diesem Protokoll wird der MeOH-Niederschlag (= Pellet, das nach Schritt 3.1 bzw. 3.2.2 erhalten wird) für weitere Analysen verwendet, die unter anderem Komponenten wie Nukleinsäuren und Lipide, Arginin-methylierte Proteine, enthalten. Fahren Sie mit der Proteinhydrolyse fort oder lagern Sie die Pellets einige Tage bei -20 °C.</li>
</ol>4. Proteinhydrolyse
<ol><li>Fügen Sie jeder Probe 500 μL 9 mol/l HCl hinzu. Schneiden Sie dann die Kappen jedes Röhrchens mit einer Schere ab und setzen Sie sie in die Glaskulturröhrchen ein (Abbildung 2A). Verschließen Sie die roten Kappen vorsichtig, aber fest (und überprüfen Sie so die Versiegelung). HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Gebrauch immer jede Versiegelung (graue PTFE-Folie in den roten Schraubverschlüssen) auf ordnungsgemäßes Festziehen und reinigen Sie sie regelmäßig mit Wasser.</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Röhrchen in ein teilweise mit Sand gefülltes Becherglas (für eine bessere Wärmeübertragung) und hydrolysieren Sie die Proben für ca. 16 h bei 110 °C in einer Trockenkammer.</li>
	<li>Nach der Hydrolyse werden die Proben abgekühlt (~1 h).</li>
	<li>Danach wird über Nacht mit einer Zentrifuge im Hochvakuum (unter 100 Pa) lyophilisiert.</li>
	<li>Die Pellets werden - wenn sie vollständig getrocknet sind (wenn nicht, setzen Sie die Lyophilisation fort) - in 1 ml 0,1 mol/L HCl gelöst und 50 μL Chloroform (CHCl 3) in jedes Röhrchen gegeben. das Pellet mit einer 1.000 μL Pipette gründlich auflösen, dabei die Flüssigkeiten vermischen, und anschließend das komplette Volumen in ein neues Röhrchen überführen. VORSICHT: Arbeiten Sie immer mit kleinen Mengen, um eine starke Verdunstung zu minimieren.</li>
	<li>Anschließend wird bei 8.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
	<li>Die obere Phase der zweiphasigen Flüssigkeit, die die wasserlösliche Fraktion enthält (Abbildung 2B, die Fraktion mit der geringsten Dichte), wird vorsichtig mit einer Pipette gesammelt und in neue Röhrchen gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen für manuelle SPE (Abschnitt 5.2) oder Glasfläschchen für Roboter-SPE (Abschnitt 5.3 und Abbildung 2D). Vermeiden Sie das Verschütten vonCHCl 3 und seinem Inhalt (Abbildung 2C).</li>
</ol>5. Festphasenextraktion (SPE)
<ol><li>Reinigen Sie die SPE-Kartuschen vor dem ersten Gebrauch zweimal mit 1 ml der Ersatzlösung (Schritt 1.3), gefolgt von einer Zentrifugation bei 800 x g für 1 min bei Raumtemperatur (in 15-ml-Röhrchen). Sie können jeweils 10-20 Mal verwendet werden.</li>
	<li>Manuelle SPE<ol><li>Die Kartuschen (siehe Materialtabelle) werden bei jedem Durchlauf mit 1 ml reinem Methanol und 2 x 1 ml PBS vorkonditioniert, jeweils gefolgt von einer Zentrifugation bei 800 x g für 1 min bei Raumtemperatur (in 15 ml Röhrchen).</li>
		<li>Danach werden die Proben (aus Schritt 4.7) auf die SPE-Kartuschen geladen und bei 600 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
		<li>Wenden Sie dann einen Waschgang an, wie unten beschrieben.<ol><li>Dreimal 1 mlH2Ozugeben (jeweils gefolgt von Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).</li>
			<li>Fünfmal 1 ml 0,1 mol/L HCl zugeben (jeweils gefolgt von Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).</li>
			<li>Geben Sie zweimal 1 ml MeOH hinzu (jeweils gefolgt von einer Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).</li>
		</ol></li>
		<li>Dann werden Arginin und seine Derivate mit 3 x 1 ml Ersatzlösung (gefolgt von Zentrifugation 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur) in ein einzelnes 15-ml-Röhrchen eluiert. HINWEIS: Die Ersatzlösung dient als Elutionsmittel für Arginin und Derivate und wird auch zur Reinigung der Kartuschen verwendet (alle Substanzen werden entweder vor der Elution oder beim basischen pH-Wert der Ersatzlösung ausgewaschen). Um eine Kontamination im Laufe der Zeit zu vermeiden, sollte die Wiederverwendung jedoch begrenzt werden (siehe Schritt 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Roboter-SPE HINWEIS: Hier wird ein Pipettierroboter (der Hauptteil besteht aus einer Pipettiernadel, einer Waschstation für die Nadel, einer Reagenzienversorgung und Positionen für Proben und Eluate, siehe Materialtabelle) mit einem Kartuschenhalter für die SPE-Säulen geliefert. Stellen Sie bei anderen Instrumenten sicher, dass Sie mit allen aufgeführten Dingen ausgestattet sind.<ol><li>Füllen Sie den Überstand (aus Schritt 4.7) direkt in Glasfläschchen mit PTFE-Versiegelung (Abbildung 2D), bereiten Sie genügend Reagenzien (jeweils 100 ml, d. h. Ersatzlösung, 99% MeOH, PBS,H2Ound 0,1 mol/L HCl), 5 ml-Röhrchen für die Elution und Waschlösung für die Nadel des Roboters (normalerweiseH2O) vor.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Anwendung oder Methode in der Software des Roboters, die genau auf den Schritten basiert, die für die manuelle SPE (Schritt 5.2) beschrieben sind. HINWEIS: Die Details können je nach Gerätelieferant sehr unterschiedlich sein, daher finden Sie im Software-Handbuch des jeweiligen Roboters Informationen zur Programmierung. Ein Pipettierroboter arbeitet normalerweise, indem er Luftdruck auf die Kartuschen ausübt, anstatt zu zentrifugieren, was der Hauptunterschied ist. Wenn das Protokoll erstellt und zum ersten Mal ausgeführt wird, schließen Sie Kontrollen (z. B. L-Arginin mit bekannter Konzentration) ein, um einen optimalen Arbeitsablauf zu überprüfen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Abschließende Vorbereitung für die NMR
<ol><li>Lyophilisieren Sie die Proben über Nacht, um die Trocknung zu vervollständigen, um Ammoniak und H2O loszuwerden.</li>
	<li>Jede Probe wird in 500 μL NMR-Puffer gelöst (Schritt 1.4) und in NMR-Röhrchen überführt. Wichtig ist, dass das Volumen in allen Röhrchen gleich ist und die Proben homogen sind (frei von Rückständen und Lipiden, die zur Aggregation neigen). ANMERKUNG: Die Einzelheiten der NMR-Spektroskopie gehen über diese Methodenübersicht hinaus und werden an anderer Stelle27 ausführlicher beschrieben. Hier werden nur die wichtigsten Anforderungen und Schritte erläutert. Die Quantifizierung von Arginin und seinen Metaboliten erfolgt auf einem 600 MHz NMR-Spektrometer (siehe Materialtabelle). Prinzipiell können beliebige andere NMR-Spektrometer/NMR-Feldstärken verwendet werden, sofern die NMR-Signale von Arginin und methylierten Argininen mit ausreichender Empfindlichkeit und ohne Signalüberlappung detektiert werden können. Jeder Sondenkopf mit z-Achsen-Gradienten, der 1H-Spektren aufzeichnen kann, kann verwendet werden, sofern die Pulssequenzen entsprechend eingestellt sind.</li>
	<li>Aufnahme eines 1D-Spektrums mit der CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) Pulssequenz33,34 (cpmgpr1d, 512 Scans, Größe von fid 73728, 11904,76 Hz spektrale Breite auf einem 600 MHz NMR, Recyclingverzögerung 4 s) mit Wassersignalunterdrückung mittels Präsättigung.</li>
	<li>Entfernen Sie in diesen Experimenten die 1-H-Skalarkopplungen durch virtuelle Entkopplung, wodurch die Signalüberlappung reduziert wird. Zeichnen Sie zusätzliche Spektren für spezifische Fragestellungen und/oder komplexe Proben oder Matrizen auf, z. B. 1 H-13C-heteronukleare Einzelquantenkohärenzspektren (HSQC)27. ANMERKUNG: Für komplexere Matrices, in denen 1 H NMR-Signale von methylierten Argininen teilweise mit 1 H NMR-Signalen anderer Metaboliten (z. B. Lysin) überlappt werden können, sind 1H homonukleäre J-aufgelöste Spektren (JRES)35 erforderlich.</li>
	<li>Führen Sie eine absolute Quantifizierung durch, indem Sie die jeweiligen Spitzenintensitäten von Standards einer bekannten Konzentration, z. B. 100 μmol/Arginin, integrieren. HINWEIS: Routinemäßig werden ADMA, SDMA und MMA (siehe Materialtabelle) als Verhältnis zu Arginin angegeben. Dies hat den entscheidenden Vorteil, dass keine separate Normalisierung (z.B. Zellzahl, Gewebemasse, Proteinkonzentrationen) durchgeführt werden muss. In diesem Fall dient Arginin als interner Standard, und eine relative Quantifizierung ist ausreichend, um biologisch relevante Informationen zu erhalten.</li>
	<li>Zur Differenzierung von SDMA und MMA werden die Proben erneut lyophilisiert, umD2Oloszuwerden (wenn sie zuvor in NMR-Puffer resuspendiert wurden), das dann durch deuteriertes Dimethylsulfoxid (d6-DMSO) ersetzt wird, was die Auflösung von Methylresonanzenermöglicht 27. Daher werden die Proben aus den NMR-Röhrchen mit Pasteur-Pipetten abgesaugt, lyophilisiert und in 500 μLd6-DMSO gelöst.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel bestehen.

Im folgenden Abschnitt liegt das Hauptaugenmerk auf der Methode selbst; Die biologischen Implikationen der Arginin-Methylierung werden im Abschnitt Einleitung beschrieben.
Erstens können Gewebe mit unterschiedlicher Steifigkeit eine Anpassung der Probenlyse erfordern: Zellen aus Zellkulturen (einschließlich Bakterien, Hefe usw.) und Gewebe wie Gehirn, junge Leber, glatte Muskulatur usw. können schnell homogenisiert werden. Bei Geweben mit hoher Steifigkeit (einschließlich Leber älterer Proband...

In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Methylierung von Argininresten als wesentliche posttranslationale Modifikation von Proteinen erkannt. Es beeinflusst grundlegende biologische Prozesse wie die Regulation der Transkription, die Signaltransduktion und vieles mehr1. Die Hauptproteine, die an der Regulation der Arginin-Methylierung beteiligt sind, sind Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs)2. Die wichtigsten Derivate von Arginin sind ω-(N G,N G)-asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) und ω-N G-Monomethylarginin (MMA)2.
PRMTs verwenden S-Adenosyl-l-Methionin, um Methylgruppen auf die terminale Guanidinogruppe (mit zwei äquivalenten Aminogruppen) des proteingebundenen Arginins1 zu übertragen. Zwei Hauptenzyme können unterschieden werden: Sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Enzyme katalysieren den ersten Methylierungsschritt zur Bildung von MMA (das dadurch seine Symmetrie verliert). Nach diesem Schritt verwenden Typ-I-Enzyme (z. B. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA als Substrat zur Bildung von ADMA, während Typ-II-Enzyme (hauptsächlich PRMT5 und PRMT9) SDMA produzieren. PRMT1 war das erste Protein Arginin-Methyltransferase, das aus Säugetierzellen isoliert wurde3. Dennoch wurden PRMTs evolutionär konserviert4 in anderen Tieren wie Nicht-Säugetier-Wirbeltieren, wirbellosen Chordatieren, Stachelhäutern, Arthropoden und Nematoden Nesseltiere5, Pflanzen6 und Protozoen, einschließlich Pilzen wie Hefe7. In vielen Fällen führt der Knockout eines der PRMTs zum Verlust der Lebensfähigkeit, was die wesentliche Rolle methylierter Argininspezies aufzeigt, die an grundlegenden zellulären Prozessen wie Transkription, Translation, Signaltransduktion, Apoptose und Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (d.h. der Bildung membranloser Organellen, z. B. Nukleolen) beteiligt sind, an denen regelmäßig Arginin-reiche Domänen beteiligt sind 8,9,10 . Dies wiederum beeinflusst die Physiologie und die Krankheitszustände, einschließlich Krebs 11,12,13, multiples Myelom 14, Herz-Kreislauf-Erkrankungen15, virale Pathogenese, spinale Muskelatrophie 16, Diabetes mellitus 17 und Alterung1. Es wird angenommen, dass erhöhte ADMA-Spiegel im Blutkreislauf, z. B. aus der Lunge18 aufgrund eines Proteinabbaus, mit endothelialer Dysfunktion, chronischer Lungenerkrankung19 und anderen Syndromen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen20 verbunden sind. Es wurde festgestellt, dass eine Überexpression von PRMTs die Tumorentstehung beschleunigt und mit einer schlechten Prognose verbunden ist21,22. Außerdem löst die Ablation von PRMT6 und PRMT7 einen zellulären Seneszenz-Phänotyp23 aus. Eine signifikante Abnahme von ADMA und PRMT1 wurde während der Alterung von WI-38-Fibroblastengefunden 24.
Die Herausforderung besteht darin, zu verstehen, wie die Methylierung in (patho)physiologischen Prozessen wirkt, indem sie die Protein-Arginin-Methylierung identifiziert und quantifiziert. Die meisten aktuellen Ansätze verwenden Antikörper, um methylierte Arginine nachzuweisen. Diese Antikörper sind jedoch immer noch kontextspezifisch und können möglicherweise verschiedene Motive von Arginin-methylierten Proteinen nicht erkennen25,26. In dem beschriebenen Protokoll können alle oben genannten Arginin-Derivate zuverlässig durch Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) quantifiziert werden, d.h. allein, in Kombination oder, wie in den meisten Fällen, innerhalb komplexer biologischer Matrices wie eukaryotischen Zellen (z.B. aus Hefe, Maus oder menschlichem Ursprung) und Geweben27 sowie Serum28. Für Proteine und diese komplexen Matrices ist die Proteinhydrolyse29 eine Voraussetzung, um freie (modifizierte) Aminosäuren wie Arginin, MMA, SDMA und ADMA zu erzeugen. Die Festphasenextraktion (SPE)30 ermöglicht die Anreicherung der interessierenden Verbindungen. Schließlich ermöglicht die 1-H-NMR-Spektroskopie den parallelen Nachweis von Arginin und allen wichtigen Methylderivaten von Arginin. Die NMR-Spektroskopie hat den Vorteil, dass sie wirklich quantitativ, hoch reproduzierbar und eine robuste Technik ist31,32. Die abschließenden NMR-Messungen können anschließend durchgeführt werden, wenn viele Proben entnommen und vorbereitet wurden. Schließlich konzentriert sich dieses Protokoll hauptsächlich auf die Probenvorbereitung, da hierfür kein eigenes NMR-Spektrometer erforderlich ist. Es kann in den meisten biochemischen Laboratorien durchgeführt werden. Dennoch werden in dieser Arbeit einige Hinweise gegeben, welche NMR-Spektroskopie-Messungen durchgeführt werden sollten.

<table><tbody><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak Lösung 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz NMR-Spektrometer, ausgestattet mit einem TXI Sondenkopf</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, gekühlt, z.B. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge; 99% p.a.</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>Wärmeträgerflüssigkeit für SpeedVac System</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trockenkammer-Bindemittel</td><td></td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Kulturröhrchen, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Tiefvakuum-Ölpumpe RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>Teil des SpeedVac Systems</td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL Röhrchen</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipettierroboter GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-Arginin</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Methanol &ge; 99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasserspender</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL Kartuschen</td><td>Wasser</td><td></td><td>186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Gewebehomogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Precellys Röhrchen (Aufschlussröhrchen)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1,4 mm Zirkonoxidkügelchen</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Heiz-, Rühr- und Verdampfungsmodule</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td><td></td></tr><tr><td>Rotor für 1,5 mL Röhrchen, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Kühlkühlfalle</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>Teil des SpeedVac Systems</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Vakuumkonzentrator SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>Teil des SpeedVac Systems; ausgestattet mit Rotor für 1,5 ml Röhrchen</td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse für Glasfläschchen mit PTFE-Dichtung, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Kurzgewinde Glasfläschchen 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-Monomethylarginin (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-symmetrisches Dimethylarginin (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

erforschung des arginin-methyloms durch kernspinresonanzspektroskopie

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Proteingebundenes Arginin ist häufig in vielen Proteinen methyliert und reguliert ihre Funktion, indem es die physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihre Wechselwirkung mit anderen Molekülen, einschließlich anderer Proteine oder Nukleinsäuren, verändert. Diese Arbeit stellt ein leicht implementierbares Protokoll zur Quantifizierung von Arginin und seinen Derivaten vor, einschließlich asymmetrischem und symmetrischem Dimethylarginin (ADMA bzw. SDMA) und Monomethylarginin (MMA). Nach der Proteinisolierung aus biologischen Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zelllysaten wird eine einfache Methode zur Homogenisierung, Fällung von Proteinen und Proteinhydrolyse beschrieben. Da die Hydrolysate viele weitere Komponenten enthalten, wie z.B. andere Aminosäuren, Lipide und Nukleinsäuren, ist ein Reinigungsschritt mittels Festphasenextraktion (SPE) unerlässlich. SPE kann entweder manuell mit Zentrifugen oder einem Pipettierroboter durchgeführt werden. Die Empfindlichkeit für ADMA nach dem aktuellen Protokoll liegt bei etwa 100 nmol/L. Die obere Nachweisgrenze für Arginin liegt aufgrund der SPE-Sättigung bei 3 mmol/L. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode, die von der biologischen Probenvorbereitung bis zum NMR-basierten Nachweis reicht und wertvolle Hinweise und Fallstricke für eine erfolgreiche Arbeit bei der Untersuchung des Arginin-Methyloms liefert.

Routinemäßig werden 1H 1D-Projektionen von 2D J-aufgelösten (JRES), virtuell entkoppelten NMR-Spektren für Peakzuordnungen und Quantifizierungen in unserem Laborverwendet 36. Abbildung 3 zeigt repräsentative JRES-Spektren von Hefeproteinhydrolysaten, die unter Verwendung des vorliegenden SPE-Protokolls gereinigt wurden. Wenn auch in sehr unterschiedlichen Konzentrationen, können beide Substanzen in einer zellulären Matrix getrennt und quantifiziert werden. ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und quantitative Messung von freiem und proteingebundenem Arginin und Methyl-Argininen mittels 1H-NMR-Spektroskopie.

Erforschung des Arginin-Methyloms durch Kernspinresonanzspektroskopie

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, den Grad und die Dynamik der Arginin-Methylierung zu quantifizieren. Diese Modifikation spielt eine wichtige regulatorische Rolle und könnte als Biomarker für Krankheiten dienen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie einen einfachen Arbeitsablauf für eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Matrices bietet, die von Zellen, Medien bis hin zu Geweben und Bioflüssigkeiten reichen.Die Arginin-Methylierung ist bei vielen menschlichen Krebsarten erhöht, und die ersten Inhibitoren von Arginin-Methodentransferasen werden in klinischen Studien getestet. Diese Methode könnte bei der Stratifizierung von Patienten und der Risikobewertung helfen. Hansjörg Habisch, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.Bei flüssigen Proben 400 Mikroliter eiskaltes Methanol zu 200 Mikrolitern der Probe geben, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie diese Probe bei 10.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Bewegen Sie den Überstand und sammeln Sie das Pellet in 1,5-Milliliter-Röhrchen.Für feste Materialien geben Sie 600 Mikroliter 66% Methanolwasser in Zellstoffröhrchen mit 30 bis 60 Milligr

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Es werden zwei Verfahren zur Zuordnung der α- und ε-Dimethylamin-Kernspinresonanzsignale eines reduktiv 13C-methylierten N-terminalen Lysins beschrieben. Eine Methode nutzt die pH-induzierte Selektivität der reduktiven Methylierungsreaktion, und die andere verwendet Aminopeptidase, um das N-terminale Lysin selektiv zu entfernen.

Methoden, um die NMR-Resonanzen von Identify<sup&gt; 13</sup&gt; C-Dimethyl-N-terminalen Amins auf reduktiv methylierte Proteine

Protein-Arginin-Methylierung durch eine Klasse von Enzymen katalysiert viz., Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), ist das Verfahren der enzymatischen Addition von Methyl-Gruppe (n) Arginine in Proteinen. Die in-vitro-Methylierungstest ist die zuverlässigste Werkzeug für die Beurteilung der Methylierungsstatus von bekannten oder neuen PRMT Substraten.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Peptid-Arrays, die mit der SPOT-Methode synthetisiert werden, können verwendet werden, um die Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen (PKMTs) zu analysieren und das Substratspektrum von PKMTs zu definieren, um ihre biologische Rolle zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Peptidarrays synthetisiert, mit PKMTs methyliert und die Ergebnisse analysiert werden.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

DNA-Methylierung ist in der Lage, ein stabiles Niveau der Genexpression aufrechtzuerhalten und dynamische Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen zu ermöglichen. Wir beschreiben Techniken, die es ermöglichen, genspezifische Veränderungen der DNA-Methylierung und die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Genexpression zu untersuchen.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Diese Protokolle liefern die Methodik zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität einzelner Mitglieder der Protein-Arginin-Methyltransferase-Familie (PRMT) in Zellen. Detaillierte Richtlinien zur Bewertung der PRMT-Aktivität unter Verwendung endogener und exogener Biomarker, Methyl-Arginin-erkennender Antikörper und Inhibitor-Werkzeugverbindungen werden beschrieben.

Quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Arginin-Methyltransferase-1-9-Aktivität in Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.

Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um globale m⁶A-Niveaus halb-quantitativ mittels Dot-Blot zu bewerten. Total RNA wird extrahiert, denaturiert, auf einer Nylonmembran gespottet, mit Anti-m⁶A-Antikörper untersucht und durch Chemilumineszenz visualisiert. Die Signalintensität, quantifiziert durch die ImageJ-Graustufenanalyse, spiegelt die relative Methylierungshäufigkeit wider und bietet so einen reproduzierbaren Forschungsfluss.

Dot-Blot-Assay zur Erkennung globaler N6-Methyladenosin-RNA-Modifikationsniveaus

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Erfahren Sie die Quantifizierung des Arginin-Methyloms mittels 1H-NMR-Spektroskopie für Krebsforschung und Biomarker-Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener biologischer Matrices wie Zellen, Gewebe und Biofluide.

Erforschung des Arginin-Methyloms durch Kernspinresonanzspektroskopie

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