Name: Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine reproduzierbare Methode zur funktionellen und molekularen Analyse parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Wnt5a-Signalen in neuronalen Kammzellen und Myoblasten.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Auszeichnungen F30HL154324 an O.T. und K08HL121191 und R03HL154301 an S.R.K. unterstützt. Die Autoren möchten anerkennen, dass das Schema in Abbildung 1 in diesem Manuskript mit biorender.com erstellt wurde.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Der nichtkanonische Wnt/Planarzellpolaritäts-Signalweg (PCP) ist ein kritisch wichtiger zellulärer Signalweg, der an multiplen Entwicklungsprozessen 24,25 und Krankheitsprozessen 24,26 beteiligt ist. Während der embryonalen Entwicklung beinhaltet die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung ein ausgedehntes Netzwerk molekularer Signale von signalsendenden Zellen, die letztendlich Veränderungen in de...

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der die zelluläre Filamentorganisation und die gerichtete Migration reguliert. Dieser Signalweg wurde an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der embryonalen Gewebemorphogenese 1,2,3, der lymphatischen und vaskulären Angiogenese4,5,6,7 und des Krebswachstums und der Metastasierung 8,9,10 . Auf zellulärer Ebene wird die nichtkanonische Wnt-Signalisierung durch koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durchgeführt. Diese Wechselwirkungen treten häufig zwischen Zellen verschiedener Linien oder Typen auf und umfassen ein vielfältiges molekulares Netzwerk, das bis zu 19 Liganden und mehrere Rezeptoren, Co-Rezeptoren und nachgeschaltete Signaltransduktionseffektoren umfasst11. Frühere Studien haben gezeigt, dass Liganden-Rezeptor-Kombinationen kontext- und gewebeabhängig variieren können 12,13 und dass dieselben Quellliganden, die die nichtkanonische Wnt-Signalisierung in signalempfangenden Zellen antreiben, von mehreren signalsendenden Zelltypen produziert werden können 14,15 . Angesichts der zellulären und molekularen Komplexität, die mit der nichtkanonischen Wnt-Signalgebung verbunden ist, war die Fähigkeit, individuelle und klinisch relevante Mechanismen in vivo zu untersuchen, begrenzt.
Es wurden Versuche unternommen, die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung mit Zellkulturtechniken in vitro zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Wundheilungsassays, die in zellulären Monoschichten durchgeführt wurden, verwendet, um die zelluläre gerichtete Migration funktionell zu beurteilen 4,16,17,18,19. Immunfärbungstechniken wurden verwendet, um räumliche Analysen der Oberflächenproteinexpression durchzuführen, um nicht-kanonische Wnt-induzierte Veränderungen in der zellulären Morphologie 7,10, Architektur und asymmetrischen Polarisation18,19,20 zu bewerten. Obwohl diese Ansätze wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von Wnt-bezogenen Phänotypen in Signalempfangszellen geliefert haben, schränkt das Fehlen von signalsendenden Komponenten in diesen Protokollen ihre Fähigkeit ein, parakrine Signalmechanismen, die in vivo beobachtet wurden, genau zu modellieren. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an der Entwicklung von In-vitro-Systemen, die eine robuste und reproduzierbare Bewertung parakriner Signalwechselwirkungen zwischen signalsendenden und empfangenden Zellen des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere zwischen Zellen verschiedener Zelltypen, ermöglichen.
Zu diesem Zweck war das primäre Ziel dieser Studie, ein Protokoll zur Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu erstellen. Wir entwickelten ein berührungsloses Kokultursystem, das signalsendende und signalempfangende Komponenten dieser Interaktionen rekapituliert und die Verwendung molekularer, genetischer oder pharmakologischer Standardansätze ermöglicht, um spezifische Ligandenrezeptormechanismen im nichtkanonischen Wnt-Signalweg unabhängig voneinander zu untersuchen. Mechanismen der NCC-vermittelten Wnt-Signalübertragung wurden in Myoblasten mit etablierten murinen Zelllinien untersucht. Als Beweis des Prinzips wurde dieses Modell verwendet, um Ergebnisse früherer In-vivo-Studien an Mäusen zu bestätigen, die die Wnt5a-ROR2-Achse als relevanten nicht-kanonischen Wnt-Signalweg zwischen NCCs21 und SHF-Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen 3,22,23 implizieren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>C2C12 murine Myoblasten-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4 Wells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt (4,5 g/L), L-Glutamin (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Falcon konische Zentrifugenröhrchen, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon permeable Halterung für 24-Well-Platten mit 0,4 &; Mikro; M transparente PET-Membran</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Gelagert in 50 mL Aliquoten bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Gelatinelösung, 0,1%</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>Graduierte und sterile Pipettenspitzen, 10 & Mikro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 106 Einheit/ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Antihaft-Deckgläser aus Autoglas, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 Neuralleisten-Zelllinie</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Lösung in PBS, 4%</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-281692</td><td>Gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin und 10.000 &mu; g/mL Streptomycin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Gelagert in 10 mL Aliquoten bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Gelagert bei -20 &de; C, ohne Licht aufbewahren</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), 1x, ohne Calcium und Magnesium, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Gelagert bei 4 &de; C</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (rhFGF-basisch)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Mensch/Maus-Wnt5a-Protein</td><td>F& T & D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale mit Gitter</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO murine Fibroblasten-Feederzellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Gelagert bei 4 Grad; C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss invertiertes Lichtmikroskop Axio Vert.A1</td> Carl <td>Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 Mikroskopie-Software</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Bildgebungssoftware</td></tr></tbody></table>

modellierung parakriner nichtkanonischer wnt-signalwege in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg reguliert die intrazelluläre Aktinfilamentorganisation und die polarisierte Migration von Vorläuferzellen während der Embryogenese. Dieser Prozess erfordert komplexe und koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen. Da diese Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Linien auftreten können, kann die In-vivo-Bewertung zellspezifischer Defekte eine Herausforderung darstellen. Die vorliegende Studie beschreibt eine hochreproduzierbare Methode zur Bewertung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. Dieses Protokoll wurde mit der Fähigkeit entwickelt, (1) funktionelle und molekulare Bewertungen der nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung zwischen zwei beliebigen Zelltypen von Interesse durchzuführen; (2) die Rolle von signalsendenden versus signalempfangenden Molekülen im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg analysieren; und (3) phänotypische Rettungsexperimente mit molekularen oder pharmakologischen Standardansätzen durchführen.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung in Myoblasten zu bewerten. Das Vorhandensein von NCCs ist mit einer erhöhten Anzahl von Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien in Myoblasten und einer verbesserten Myoblastenmigration in einem Wundheilungstest verbunden. Die Wnt5a-ROR2-Achse wurde als entscheidender nichtkanonischer Wnt-Signalweg zwischen NCC- und Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds (SHF) identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies ein sehr gut handhabbares Protokoll ist, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalmechanismen in vitro zu untersuchen.

Auswirkungen von NCCs auf die Migrationsfähigkeit von murinen Myoblasten Dieser Assay wurde zuerst angewendet, um den Einfluss von NCCs auf die Migrationskapazität von Myoblasten zu bewerten. Abbildung 1 zeigt das schematische Modell des Assays. Um diese Wirkung zu testen, wurden Kratztests mit Myoblasten durchgeführt, die isoliert (ohne NCC-Einsätze) im Vergleich zu denen in Gegenwart von Einsätzen gezüchtet wurden. Als Positivkontrolle wurden 500 ng/mL rekombinantes Wnt...

Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.

Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Dieses Protokoll beschreibt eine hochgradig reproduzierbare Methode zur funktionellen und molekularen Bewertung der parakrinen nicht-kanonischen Wnt-Signalisierung in jeder Zellpopulation von Interesse. Funktionelle und molekulare Bewertungen werden in derselben Zellpopulation durchgeführt und können angewendet werden, um jede Komponente des Wnt/PCP-Signalwegs zu untersuchen. Um zu beginnen, resuspendieren Sie die zuvor pelletierte C2C12-Zelle in 10 Milliliter C2C12-Medium.Um die Zellen im Verhältnis 1:20 zu verdünnen, fügen Sie 0,5 Milliliter Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 9,5 Milliliter frischem C2C12-Medium hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer serologischen Pipette unter Verwendung einer P1000-Pipette, geben Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung eines neuen Vierkammerbrunnens und legen Sie ihn in den Inkubator. Für die Beschichtung von O9-1-Zelleinsätzen resuspendieren Sie das O9-1-Zellpellet in 10 Milliliter O9-1-Wachstumsmedium. Und ähnlich wie bei der C2C12-Zellverdünnung verdünnen Sie die O9-1-Zellen im Verhältnis 1:20.Als nächstes platzieren Sie einen einzelnen durchlässigen Einsatz in jeder Vertiefung eines neuen Vierkammerbrunnens, der mit einem Milliliter O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist. Fügen Sie jedem Einsatz 300 Mikroliter der verdünnten O9-1-Zellsuspension hinzu und stellen Sie sicher, dass der Einsatz vollständig eingetaucht ist. Dann inkubieren Sie das Bohrloch bei 37 Grad Celsius.Um einen siRNA-Knockdown in den O9-1-Zellen durchzuführen, verdünnen Sie die siRNA und das Transfektionsreagenz im reduzierten Serummedium gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den gewünschten Konzentrationen. Mischen Sie vorsichtig die verdünnte siRNA und das Transfektionsreagenz und inkubieren Sie die Mischung sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 18 bis 24 Stunden Zellplattierung fügen Sie die siRNA-Lipidkomplexe zu den O9-1-Zelleinsätzen hinzu und inkubieren für etwa 34 bis 48 Stunden.Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80% erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus der C2C12-Kammer und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Beginnen Sie nach dem Entfernen des PBS mit dem Kratzen der Zellen, indem Sie eine sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung führen, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen. Sobald die Zellen zerkratzt sind, fügen Sie schnell einen Milliliter PBS hinzu.Schalten Sie als nächstes den Computer und das Mikroskop ein. Platzieren Sie den Kammerschieber auf der Bühne und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung. Öffnen Sie die Imaging-Software.Klicken Sie auf die Registerkarte Kamera und dann auf die Schaltfläche Live, um die Zellen auf der Registerkarte AxioCam IC anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann, bewegen oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den Wundbereich in der Mitte des Livebildes auf der AxioCam IC-Lasche zu positionieren. Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf Ausrichten, um eine neue Registerkarte neben der Registerkarte AxioCam IC zu öffnen, die das Bild enthält.Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie auf die Datei, wählen Sie Speichern unter, wählen Sie Desktop in der Leiste auf der linken Seite, um die Datei auf dem Desktop zu speichern, geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein und speichern Sie die Abbildung im czi-Dateiformat. Um das Bild als TIFF-Datei zu speichern, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Speichern unter, und geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Als Typ speichern" und wählen Sie tiff aus dem Dropdown-Menü.Positionieren Sie den Kammerschieber manuell, um zwei bis drei weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde im selben Vertiefung aufzunehmen. Entfernen Sie nach der Bildgebung das PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie einen Milliliter C2C12-Medium hinzu. Setzen Sie das Kokultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammermulde legen.Drücken Sie die Einsätze vorsichtig in die Vertiefung, so dass der Boden des Einsatzes knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen liegt. Bringen Sie die Brunneneinsatzkonstrukte in den Inkubator zurück und lassen Sie die Zellen insgesamt neun bis 12 Stunden wandern. Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen sechs Stunden nach der Wundbildung, danach alle zwei bis drei Stunden.Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontrollbedingungen die Wunde vollständig bedecken. Beginnen Sie mit der Beendigung des Migrationsassays und der Dekonstruktion des Bohrlocheinsatzes, indem Sie die O9-1-Zelleinsätze nach neun bis 12 Stunden der Migrationsperiode entfernen. Saugen Sie das C2C12-Medium vorsichtig ab.Fügen Sie 0,5 Milliliter PBS in die Kammermulden hinzu und machen Sie endgültige Bilder der Zellen nach der Migration. Saugen Sie alle PBS, die mit Medium gemischt sind, vorsichtig ab und entfernen Sie die Kunststoffkammern aus den Kammerschächten gemäß den Kit-Anweisungen. Verlassen des darunter liegenden Objektträgers mit den C2C12-Zellen.Zur Immunfärbung sofort den Objektträger mit 4% paraformem Aldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann Paraformaldehyd entfernen und den Objektträger mit 0,1% Triton X-100 PBST für 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Nach 15 Minuten PBST ausgießen und den Objektträger zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten waschen.Erstellen Sie dann eine hydrophobe Grenze mit einem hydrophoben Stift um den Objektträger, um zu verhindern, dass Lösungen aus dem Objektträger verschüttet werden, wodurch eine Störung der Adhärenzzellen verhindert wird. Als nächstes fügen Sie dem Objektträger innerhalb der hydrophoben Grenze etwa 0,5 Milliliter 1% BSA-Blockierungslösung hinzu und inkubieren den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Objektträgerkammer. Am Ende der Inkubation die blockierende Lösung entfernen und den Phalloidin-Antikörper zu diesem Objektträger innerhalb der hydrophoben Grenze hinzufügen und bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren.Am nächsten Tag legen Sie das Dia in einen Diahalter, der vor Lichteinwirkung geschützt ist. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie DAPI-haltiges Montagemedium hinzu, montieren Sie die Objektträger mit Glasabdeckungsgläsern und erfassen Sie die Zellen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop.In der vorliegenden Studie beschleunigte die Zugabe von rekombinantem Wnt5a zu Co-Kultur-Wells die Myoblastenmigration mit vollständiger Erholung einiger Gebiete um neun Stunden. Die wandernden Myoblasten zeigten unter allen drei Bedingungen eine normale wandernde Zellmorphologie, einschließlich gut geformter und hervorstehender Filopodien und Lamellipodien und asymmetrischer Polarisation von Aktin-Zytoskelettprojektionen. Die parakrine Wirkung von NCC-abgeleitetem Wnt5a auf die Myoblastenmigration wurde untersucht.Die Behandlung mit 50 nanomolaren siRNA gegen Wnt5a reduzierte die Wnt5a-Genexpression um 64% im Vergleich zur Negativkontrolle. Die Migration von C2C12-Meilenblasten mit signifikant reduziertem Wnt5a-Knockdown in NCCs und die Zugabe von exogenem rekombinantem Wnt5a retteten dieses Migrationsdefizit und den morphologischen Defekt in diesen Myoblasten. Um die Signalempfangszellmechanismen im parakrinen Modell besser zu verstehen, wurde der ROR2-Rezeptor abgeschaltet und die Genexpression um 54% reduziertKnockdown von ROR2 in Myoblasten reduziert ihre Migrationskapazität trotz des Vorhandenseins von NCCs.Exogenes rekombinantes Wnt5a konnte die Migration der Myoblasten nach dem ROR2-Knockdown nicht retten, was darauf hindeutet, dass die ROR2-Depletion die Fähigkeit von Myoblasten, Wnt5a-Signale zu empfangen, stört. Kulturzellen auf ausreichende Dichte kratzen mit P10-Spitze nur einmal montiert und demontiert Co-Kultursystem mit Vorsicht, ohne die darunter liegende Zelle zu stören. Diese Technik wurde als Machbarkeitsnachweis verwendet, um eine spezifische molekulare Signalachse innerhalb des komplexen Wnt/PCP-Signalwegs mit Relevanz für die Neuralleistenzell- und Zweitherrenfeldbiologie zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Wundassay zur Bewertung der Migrationskapazität von murinen Myoblasten in Co-Kultur

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