Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Die Technik, die wir hier vorschlagen, ermöglicht es uns, die Einschränkungen manueller Läsionsprotokolle zu überwinden, indem wir Schäden an benachbarten Geweben reduzieren und die Reproduzierbarkeit verbessern, selbst für unerfahrene Bediener. Diese Technik ermöglicht es uns, genau zu wählen, wo die Läsion induziert werden soll, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen, dank der rotierenden Glaskapillare in Kombination mit einem gezielten UV-Laser. Viele Schritte sind mit dem Betrieb der VAST-Ausrüstung verbunden, daher würde ich empfehlen, jeden Schritt abzuhaken, um sicherzustellen, dass alles korrekt ausgeführt wird.

Beginnen Sie mit der Betäubung der Larven mit dem Medium, das das Anästhetikum enthält, und übertragen Sie sie dann auf eine 96-Well-Platte, die 300 Mikroliter Medium pro Well enthält. Schalten Sie alle Systemkomponenten einschließlich des Lasers für die Ablation ein. Starten Sie dann die automatisierte Zebrafisch-Bildgebung oder die VAST-Software, wählen Sie im ersten Fenster Platte und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig.

Ein kleines Fenster öffnet sich und fragt, ob die Kapillare leer und sauber ist. Überprüfen Sie das Bild der Kapillare auf Luftblasen im Inneren. Wenn sich keine Luftblasen im Inneren befinden, klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja.

Gehen Sie als Nächstes im LP Sampler-Fenster zum Menü Datei und wählen Sie die Option Skript öffnen. Wählen Sie eine Datei aus, die das Skript enthält, das dem auszuführenden Experiment entspricht. Gehen Sie dann im Hauptfenster der VAST-Software zu Datei und wählen Sie Experiment öffnen.

Wählen Sie die Experimentdatei aus, die dem geplanten Experiment entspricht. Starten Sie die ImageJ/Fiji-Software, gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Neues Skript, um das Skriptfenster zu öffnen. Gehen Sie dann zum Menü Datei und wählen Sie Öffnen, um das Laserläsionsskript zu laden.

Um die Python-IDE zu starten, gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Datei öffnen, um das Skript zur Verwaltung des Lasers zu laden. Klicken Sie dann auf das Menü Ausführen und wählen Sie Ohne Debuggen ausführen, um das Skript auszuführen. Stellen Sie sicher, dass eine Abfolge von Meldungen im Klemmenbedienfeld zusammen mit etwas Rauschen angezeigt wird, während das Laserdämpfungsglied initialisiert wird.

Klicken Sie im Hauptfenster der VAST-Software auf die Pfeiltasten, um die Bühne zu bewegen und die Kapillare relativ zum Mikroskopobjektiv zu zentrieren. Schauen Sie durch die Okulare und fokussieren Sie sich mit dem Durchlicht des Mikroskops auf die Oberseite der Kapillare. Legen Sie eine 96-Well-Platte, die die Larven enthält, auf den linken Plattenhalter des LP-Probenehmers.

Legen Sie dann eine weitere Platte zur Sammlung auf den rechten Plattenhalter des Probenehmers. Stellen Sie sicher, dass sich der A1-Brunnen der Platte in der vorderen linken Ecke des Halters befindet. Klicken Sie im LP Sampler-Fenster der VAST-Software auf die Schaltfläche Plattenvorlage und wählen Sie alle Vertiefungen aus, die Larven enthalten.

Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um das Fenster zu validieren und zu schließen. Klicken Sie dann im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Platte ausführen, um das Laden der Larve zu starten. Gehen Sie als Nächstes zur Mikroskopsoftware und klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Larve abzubilden.

Schalten Sie den Fokusknopf des Mikroskops ein, bis der zentrale Kanal des Rückenmarks sichtbar ist. Machen Sie einen Schnappschuss in Fluoreszenz und speichern Sie das Bild in einem Ordner. Öffnen Sie das Bild in ImageJ und passen Sie bei Bedarf den Kontrast an.

Klicken Sie auf das Linienwerkzeug "Region of Interest" und zeichnen Sie eine kurze Linie, die auf dem Rückenmark zentriert ist. Schalten Sie das Mikroskop auf eine 100% reflektierende Spiegelposition. Laden Sie das ImageJ-Skript, und legen Sie Wiederholung auf 2, Beispiel auf 1, Breite auf 40 Mikrometer und Abschwächung auf 89 fest.

Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Wenn die Laserschusssequenz abgeschlossen ist, wechseln Sie in der Bildgebungssoftware zur Fluoreszenzbildgebung und passen Sie den Fokus an. Machen Sie einen neuen Schnappschuss und speichern Sie ihn.

Öffnen Sie dieses neue Bild in ImageJ und zeichnen Sie eine neue Linie, die größer ist als das Rückenmark selbst. Schalten Sie das Mikroskop auf eine 100% reflektierende Spiegelposition. Wechseln Sie zum ImageJ-Skriptfenster, und legen Sie Wiederholung auf 2, Beispiel auf 1, Breite auf 40 Mikrometer und Dämpfung auf 89 fest.

Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Wenn die Laserschusssequenz abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Transsektionsqualität, indem Sie Fluoreszenz und Fokussierung abbilden. Stellen Sie sicher, dass keine Zellen oder Axone in der Läsionsstelle intakt bleiben.

Gehen Sie zum Hauptfenster der VAST-Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um die läsionierten Larven in die leere 96-Well-Platte zu sammeln. Klicken Sie dann auf das Kontrollkästchen Fachleuchte, um die VAST-Systemleuchte wieder einzuschalten. Nehmen Sie die Larve so schnell wie möglich von der 96-Well-Platte und geben Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fischwasser, damit sich die Larve nach der Läsion erholen kann.

Die Petrischale bei 28 Grad Celsius in einen Inkubator stellen. Acetyliertes Tubulin-Immunfärben und Kalziumbildgebung deuten darauf hin, dass die Laserläsion die Kontinuität des Wirbelsäulengewebes vollständig stört. Ein intaktes Rückenmark ist in diesem Bild zu sehen.

Eine vollständige Störung der Axone zwischen der kaudalen und der rostralen Seite der Läsion bestätigt die vollständige Durchtrennung des Rückenmarks. Ein Beispiel für eine unvollständige Transsektion ist hier dargestellt. Das transektorierte Rückenmark an einer NBTG cAMP 6-S Larve ist in diesem Bild dargestellt.

Die Rechtecke zeigen die ROIs, die zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in den rostralen und kaudalen Seiten der Läsionen verwendet werden. Das grafische Bild stellt die Fluoreszenzintensitätsänderung im Laufe der Zeit in den ROIs der Rostral- und Schwanzanalyse dar. Die Fluoreszenzbilder einer NBT:dsRed-Larve mit maximaler Intensität vor der Laserläsion, nach drei Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden der Laserläsion sind hier dargestellt.

Nach 24 Stunden nach der Verletzung begannen sich die Wunden zu schließen, was nach 48 Stunden zu einer teilweisen Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur des Rückenmarks führte. Eine teilweise funktionelle Rekonnektion wurde nach 48 Stunden nach der Verletzung mittels Kalziumbildgebung bestätigt. Das Verhältnis zwischen der Amplitude der Spikes im kaudalen Bereich und im rostralen Bereich zeigte einen Anstieg zwischen 3, 24 und 48 Stunden nach der Verletzung.

Die Makrophagenrekrutierung wurde nach Laserläsionen mit NBT:dsRed mpeg1 GFP-Larvenlaserläsionen beobachtet. Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der markierten Zellen zwischen manuellen und Laserläsionen beobachtet. Unlesionierte Fische zeigten bei beiden Läsionsbedingungen weniger doppelt markierte Zellen als läsionierte Fische.

Laserläsion verursacht weniger Muskel- und Hautschäden als manuelle Läsionen. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Läsion vollständig ist oder nicht. Keine intakte Zelle oder Struktur sollte im Läsionsbereich sichtbar sein, nur ein dunkler Hintergrund.

Um die Regeneration des Rückenmarks zu untersuchen, verwenden wir viele Methoden, einschließlich Immunhistochemie und Kalziumbildgebung. Wichtig ist, dass wir auch Elektrophysiologie betreiben können, da das Gewebe im Gegensatz zu manuell läsionierten Tieren einer Dissektion standhalten kann. Diese neue Technik ermöglicht es uns, die strukturelle und funktionelle Gewebeorganisation im Rückenmark nach einer Verletzung quantitativ zu untersuchen, indem wir reproduzierbare und kontrollierte Läsionen zulassen.