Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem

Diese Technik ermöglicht es uns, die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf Immunzellen zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie sich Aspekte der Weltraumumgebung auf die menschliche Physiologie auf molekularer Ebene auswirken. Diese Technik ist wirtschaftlich machbar und relativ einfach einzurichten und zu warten, verglichen mit der Entsendung von Zellkulturen in den Weltraum oder anderen Methoden, bei denen Zellkulturen auf der Erde simulierter Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Es wird empfohlen, beim Befüllen der Gefäße langsam vorzugehen, um ein Überlaufen und Verschütten zu vermeiden.

Stellen Sie nach dem ersten Entfernen der Blase sicher, dass die Gefäße vollständig gefüllt sind, indem Sie die Spritzen verwenden. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit einer großen Blasenbildung während der gesamten Behandlung minimiert. Nehmen Sie zunächst die Kulturgefäße aus der Plastikverpackung.

Beschriften Sie jedes Gefäß am Rand entsprechend dem verwendeten Zelltyp oder der verwendeten Linie, ob es sich um die Kontrolle oder Behandlung handelt, und nach anderen relevanten Informationen. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Stift der Einfüllöffnungskappe oder den O-Ring zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift oder O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt ist.

Entfernen Sie die Kappen nicht von den Spritzenanschlüssen. Befüllen Sie das Gefäß mit 10 ml des für die Zellkultur geeigneten Komplettmediums mit einer sterilen serologischen Pipette und setzen Sie die Kappe vorsichtig auf die Einfüllöffnung. Stellen Sie sicher, dass die Kappen der Spritzenöffnung und die Einfüllöffnung sicher verschlossen sind.

Legen Sie dann die gefüllten Gefäße in einen Inkubator, während Sie die folgenden Schritte durchführen, um die Gefäße für die Zellkultur vorzubereiten. Entnehmen Sie die mediengrundierten Gefäße aus dem Inkubator. Für eine Kolbenkontrolle wird ein T25-Suspensionskulturkolben mit 10 ml Zellkultur aus dem oben vorbereiteten Bestand geladen.

Geben Sie 10 ml der Stammzellkultur in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen, das zum Laden der Spritzen verwendet wird. Schrauben Sie die Spritzenanschlusskappen ab, um sie aus dem Gefäß zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sich die serienmäßigen Absperrhähne in der geöffneten Position befinden. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Stift der Einfüllöffnungskappe oder den O-Ring zu berühren.

Setzen Sie die Kappe mit dem Stift oder O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden. Das Gefäß kann entleert werden, indem das Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Gefäß in einen Abfallbehälter gegossen wird.

Alternativ können Sie das Medium mit einem sterilen Glas an Ihrer Pipette vorbeisaugen, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist. Achten Sie bei der Verwendung einer Pipette oder des Vakuumsystems darauf, die Sauerstoffmembran nicht zu berühren, da dies diese beschädigen und das Gefäß unbrauchbar machen könnte. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen mit der vorbereiteten Stammzellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.

Ziehen Sie 10 ml Zellkulturvorrat aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer frischen, sterilen serologischen Pipette auf. Nehmen Sie das Gefäß auf und kippen Sie es so, dass die Einfüllöffnung nach oben zeigt. Anschließend die Zellkulturbrühe vorsichtig durch die Einfüllöffnung in das Gefäß dosieren.

Füllen Sie das Gefäß bis zur Spitze der Einfüllöffnung und kippen Sie das Gefäß wieder nach unten, um ein Verschütten zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Sauerstoffmembran nicht mit der Pipette zu berühren, da diese sehr zerbrechlich ist. Sobald das Gefäß beladen ist, setzen Sie die Kappe der Einfüllöffnung vorsichtig wieder auf, ohne den O-Ring zu berühren.

Nehmen Sie die erste 3-ml-Spritze aus der Verpackung und pumpen Sie sie einige Male, um sie zu lösen. Befestigen Sie dann die Spritze an einem der Spritzenanschlüsse und achten Sie darauf, dass die Spritze vollständig niedergedrückt ist. Verschließen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml aliquoter Zellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.

Nehmen Sie die zweite 3-ml-Spritze ebenfalls aus der Verpackung und pumpen Sie sie einige Male ab. Tauchen Sie diese Spritze dann vorsichtig halb in die Zellkultur aus dem konischen 15-ml-Röhrchen ein und ziehen Sie etwas Kultur auf. Minimieren Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vollständig zurück in das Röhrchen geben und 3 ml Kultur aufziehen.

Befestigen Sie die gefüllte Spritze an der verbleibenden Spritzenöffnung und desinfizieren Sie die Spritzen vorsichtig und um die Füllöffnung herum mit einem Ethanolpad. Bringen Sie kein Ethanol auf die Sauerstoffversorgungsmembran. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Gefäße.

Wenn im konischen 50-ml-Röhrchen für das letzte Gefäß noch eine etwas unzureichende Zellkultur vorhanden ist, gewinnen Sie die verbleibende Menge aus dem konischen 15-ml-Röhrchen zurück, das zum Laden der Spritzen verwendet wurde. Stellen Sie sicher, dass die Absperrhähne der Spritzenöffnungen geschlossen sind, um die Migration von Zellen und Blasen aus den Spritzen in die Gefäße zu begrenzen. Drehen Sie das Gefäß auf den Kopf und schlagen Sie ein paar Mal auf die Seite, um die ersten Blasen einzusammeln.

Drehen Sie das Gefäß schnell wieder nach oben und dann in einem leichten Winkel nach weg, so dass die Blasen alle nach oben schwimmen. Manövrieren Sie die Blasen mit der leeren Spritze unter den Anschluss und beobachten Sie, wie sie beginnen, in den Anschluss einzudringen. Öffnen Sie beide Absperrhähne der Spritzenöffnungen.

Schlagen Sie vorsichtig auf das Gefäß, damit die Blasen in die leere Spritze aufsteigen können. Saugen Sie die größeren Blasen langsam mit der leeren Spritze auf, während Sie die volle Spritze vorsichtig nach unten drücken, um den Druck im Gefäß aufrechtzuerhalten, damit die Sauerstoffmembran nicht platzt. Wiederholen Sie diesen Vorgang einige Male, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt sind.

Wenn die Blasen effektiv entfernt wurden, schließen Sie die Absperrhähne der Spritzenöffnungen. Lassen Sie die Spritzen während der Behandlung an, um eine spätere Blasenentfernung zu ermöglichen, und stellen Sie sicher, dass das Volumen in beiden Spritzen ungefähr gleich ist. Wischen Sie die Oberfläche des rotierenden Sockels und des Flachbandkabels vorsichtig mit 70%igem Ethanol ab.

Stellen Sie sicher, dass das Flachbandkabel an das Netzteil angeschlossen ist. Legen Sie den drehbaren Sockel in den Inkubator und befestigen Sie das Flachbandkabel am Sockel. Platzieren Sie das Netzteil in der Nähe, aber außerhalb des Inkubators.

Befestigen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie die Gefäßgewinde am rotierenden Stift ausrichten und den rotierenden Stift vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn auf dem Sockel drehen. Stellen Sie sicher, dass das Gefäß sicher befestigt ist. Halten Sie den Inkubator bei ca. 100 % Luftfeuchtigkeit, indem Sie die Wasserschale mit autoklaviertem RO-Wasser füllen.

Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Inkubators an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen an, damit die Zellen nicht durch das Medium fallen. Kontrollieren Sie am ersten Tag der Behandlung alle paar Stunden die Blasenbildung, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die Blasen mindestens einmal täglich bis zum Ende der gewünschten Behandlungsdauer.

Sobald die geplante Behandlungslänge abgelaufen ist, stoppen Sie die Rotation und zerlegen Sie das Gerät. Entfernen Sie das Behandlungsgefäß, indem Sie das Gefäß vorsichtig stationär halten, während Sie den Drehzapfen des Geräts im Uhrzeigersinn drehen. Bringen Sie den Kontrollkolben, das Kontrollgefäß und das behandelte Gefäß in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank.

Nehmen Sie jedes Gefäß mit Ausnahme des Kontrollkolbens und drehen Sie es so, dass es nach unten zeigt. Schlagen Sie dann vorsichtig darauf, um alle Zellen in Suspension zu bringen. Drehen Sie dann das Gefäß mit der Einfüllöffnung nach unten auf die Seite und schlagen Sie erneut darauf, um die Zellen zur Einfüllöffnung zu führen, um eine effiziente Aspiration zu gewährleisten.

Behandeln Sie jedes Gefäß einzeln. Schrauben Sie die Spritzen von den beiden Anschlüssen ab und geben Sie sie in den biologisch gefährlichen Abfall. Öffnen Sie die Absperrhähne an den Spritzenöffnungen.

Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Einfüllöffnung und ziehen Sie den Inhalt mit einer sterilen serologischen 10-ml-Pipette auf, wobei Sie das Gefäß beim Entleeren kippen. Dosieren Sie den Inhalt aller Kontroll- und Behandlungsgruppen in einzeln beschriftete konische 15-ml-Röhrchen. Schließen Sie jedes Röhrchen und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie richtig gemischt sind.

Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration und Lebensfähigkeit der resultierenden Zellkultur, um sich auf nachfolgende experimentelle Assays vorzubereiten. Die Startviabilität und die Sitzdichten der NK-92-Zelllinie wurden mit der resultierenden Endviabilität und den Endkonzentrationen verglichen. Nach einer 72-stündigen SMG-Behandlung wurden zwei Fälle von negativen und positiven Ergebnissen verglichen.

Zum Vergleich: Der optimale Konzentrationsbereich der verwendeten Zelllinie NK-92 lag zwischen 0,3 und 1,2 Millionen Zellen pro Milliliter mit einer Verdopplungszeit von etwa zwei bis drei Tagen. Die Proliferation in der SMG-Behandlungsgruppe war in der Kontroll- und der Behandlungsgruppe ungefähr gleich. Diese Parameter waren essentiell für den Erfolg der nachgeschalteten Experimente, und die resultierenden Zellen aus den beiden Kontrollgruppen schnitten in den nachgelagerten experimentellen Assays ähnlich ab.

Es ist von entscheidender Bedeutung, die Blasenbildung während des gesamten Behandlungsverlaufs zu überwachen und zu berücksichtigen, insbesondere in der Zellkultur, die simulierter Schwerelosigkeit ausgesetzt ist. Die Bildung großer Blasen kann zu einer Störung der Fluiddynamik im Inneren des Behälters führen, wodurch die simulierte Schwerelosigkeit im Wesentlichen aufgehoben wird.