Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung gramnegativer Bakterien mittels Aptamer Affinity Beads
17. Oktober 2022
Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung der mikrofluidischen Akustophorese-Technik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die zur schnellen und effizienten Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können.
Dieses Protokoll beschreibt unsere mikrofluidische Akustophorese-Technologie, die für die schnelle und effiziente Trennung gramnegativer Bakterien aus einem Medium mit Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen verwendet werden kann. Mikrofluidische Akustophorese-Systeme ermöglichen die gramnegative Bakterientrennung mit angemessenem Durchsatz und berührungsloser Zellisolierung. Die mikrofluidische Akustophorese kann optimiert werden, um Bakterien aus medizinischen und Umweltproben zu isolieren.
Entwerfen Sie zunächst einen mikrofluidischen Akustophorese-Chip, der PS-Kügelchen am Zielausgang sammelt und den Rest verwirft, nachdem eine PS-Probenmischung in den Probeneingang injiziert wurde. Bereiten Sie einen Chip vor, bei dem die Schichten über und unter der Siliziumschicht mit dem Borosilikatglas verbunden sind. Und eine dritte Borosilikatglasschicht mit Eloxierung fügt 1000 Volt und 400 Grad Celsius hinzu.
Befestigen Sie eine PZT auf der Borosilikatglasschicht entlang des mikrofluidischen Kanals mit weniger als 10 Mikrolitern Cyanacrylatkleber. Impfen Sie die GN- und GP-Bakterien in Luria-Bertani-Medium und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute für 16 Stunden. Zentrifugieren Sie die kultivierten Bakterien bei 9, 056 RCF für eine Minute bei Raumtemperatur.
Anschließend zweimal mit 1X PBS Puffer waschen. Bereiten Sie die ausgewählten GN- und GP-Bakterien für die Analyse vor, indem Sie sie im Bindungspuffer resuspendieren. Resuspendieren Sie die 10 Mikrometer Streptavidin-beschichtete Mikroperlenmischung vor Gebrauch.
Wirbeln Sie die Mischung für 20 Sekunden. Bereiten Sie das Aptamer vor, indem Sie es drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius denaturieren und dann bei null Grad Celsius für zwei Minuten wieder falten. 250 Mikroliter der resuspendierten Streptavidin-beschichteten Mikroperlenmischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und 100 Mikroliter biotinyliertes DNA-Aptamer in die Röhre geben.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten, während Sie mit 25 Umdrehungen pro Minute drehen. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgemisch bei 9, 056 RCF für 40 Sekunden bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie das Röhrchen zweimal mit 200 Mikrolitern Tris-HCl-Puffer.
10 Mikroliter 100 Milligramm BSA pro Milliliter in das gewaschene Probenröhrchen geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während sie mit 25 Umdrehungen pro Minute rotieren. Schließlich waschen Sie die Aptamer-modifizierten Mikroperlen zweimal in Tris-HCl-Puffer durch Zentrifugation bei 9.056 RCF für 40 Sekunden bei Raumtemperatur. Verbinden Sie PEEK-Röhrchen mit den beiden Einlässen für die Injektion von zwei Proben und Puffer sowie den beiden Auslässen zum Sammeln und Entladen von Abfällen.
Füllen Sie den mikrofluidischen Akustophoresekanal mit blasenfreiem demineralisiertem Wasser mit einer 10-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie einen Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen vor, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Nach der Vorbereitung des Geräts injizieren Sie die Probe und den Puffer, indem Sie mit dem Präzisionsdruckkontrollgerät einen Druck von zwei Kilopascal auf den Probeneingang und vier Kilopascal auf den Puffereinlass ausüben.
Fokussieren Sie mit einem Mikroskop auf eine Perle und bewegen Sie sie mit dem PZT in die Mitte des mikrofluidischen Kanals. Erzeugen Sie eine Resonanzfrequenz von 3,66 Megahertz mit einem einkanaligen Funktionsgenerator und verstärken Sie ein typisches Signal mit einem Leistungsverstärker um 16 Dezibel. Beobachten Sie die Trenn- und Anreicherungsprozesse auf dem akustofluidischen Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit 1.200 Bildern pro Sekunde arbeitet.
Der in dieser Studie vorgestellte akustophoretische Chip bestätigte, dass mit zunehmender Spannung des PZT die zentrale Konzentration der 10 Mikrometer großen Perlen zunahm. Bei fünf Volt der PZT-Spannung konzentrierten sich die meisten der 10 Mikrometer großen Perlen in der Mitte. Das Verhältnis der Anzahl der am Auslass gesammelten Perlen zur Gesamtzahl der injizierten 10 Mikrometer großen Perlen wurde als Wiederfindungsrate bezeichnet.
Das Verhältnis der Anzahl der 10 Mikrometer großen Perlen zur Gesamtzahl der gesammelten Perlen wurde als Reinheit bezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Gerät eine hohe Trennleistung für Perlen mit einer Größe von 10 Mikrometern hatte. Die Anzahl der GN- und GP-Bakterien, die an jede Aptamer-modifizierte Mikroperle gebunden sind, wurde mit einem Mikroskop mit einer Hochgeschwindigkeitskamera gemessen.
Alle fünf GN-Bakterien waren an die Perlen gebunden, während deutlich weniger GP-Bakterien an die getesteten Substanzen gebunden waren. Die Signalstärke unterschied sich signifikant zwischen den GN- und GP-Bakterien. Der Klebstoff, der zur Befestigung des PZT verwendet wird, sollte so wenig wie möglich für die Genauigkeit der Riffelung verwendet werden und PZT und Mikrokanal sollten parallel sein.
Dieses Gerät kann verwendet werden, um lebende Bakterien oder von Bakterien abgeleitete Biomarker in der Zeit der Früherkennung von bakteriellen Infektionskrankheiten nachzuweisen.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine mikrofluidische Akostofforetechnologie für die schnelle und effiziente Trennung von Gram-negativen Bakterien aus verschiedenen Medien. Die Methode verwendet aptamer-modifizierte Mikroperlen, um den Isolationsprozess zu verbessern und ermöglicht eine berührungslose Zelltrennung mit angemessenem Durchsatz.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrofluidik
- Akostofforese
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Mikrofluidische Systeme ermöglichen die präzise Manipulation von Flüssigkeiten auf Mikroskala.
- Akostofforese ist eine Technik, die akustische Wellen zur Partikelmanipulation nutzt.
- Gram-negative Bakterien stellen aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften erhebliche Herausforderungen bei der Isolierung dar.
- Aptamere sind kurze, einzelsträngige Oligonukleotide, die sich selektiv an spezifische Ziele binden können.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines mikrofluidischen Akostofforese-Chips für effiziente bakterielle Trennung.
- Optimierung des Isolationsprozesses für medizinische und Umweltproben.
- Nachweis der Effektivität von aptamer-modifizierten Mikroperlen zur Verbesserung der Trennleistung.
Verwendete Methoden
- Entwerfen eines mikrofluidischen Akostofforese-Chips.
- Verbindung von Schichten aus Silizium und Borosilikatglas für die Chipherstellung.
- Injektion einer PS-Stichprobenmischung in den Chip zur Trennung.
- Anwenden von Anodisierung unter spezifischen Spannungs- und Temperaturbedingungen.
Hauptergebnisse
- Das mikrofluidische Akostofforese-System isolierte erfolgreich Gram-negative Bakterien.
- Hoher Durchsatz und berührungslose Trennung wurden erreicht.
- Aptamer-modifizierte Mikroperlen verbesserten die Isolationseffizienz erheblich.
- Die Methode ist sowohl für medizinische als auch für Umweltproben anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Mikrofluidische Akostofforese ist eine vielversprechende Technik für die bakterielle Isolierung.
- Aptamer-Modifikationen verbessern die Selektivität und Effizienz des Prozesses.
- Diese Technologie könnte für verschiedene Anwendungen in der Mikrobiologie von Vorteil sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic acoustophoresis method enables rapid, high-purity isolation of Gram-negative bacteria from complex matrices, addressing a critical bottleneck in early-stage infectious disease diagnostics and environmental monitoring. By combining label-free acoustic separation with aptamer-based specificity, the technology supports target de-risking in antimicrobial discovery and biomarker validation workflows. The demonstrated >98% recovery and 97.8% purity at 10x concentration provides a scalable, non-contact alternative to centrifugation or filtration for preclinical sample preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of Gram-negative bacterial targets by isolating live pathogens from heterogeneous biological or environmental samples.
- Operational Value: Reduces sample processing time and minimizes biomolecular damage compared to traditional separation techniques.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing purified bacterial fractions for target engagement and mechanism-of-action studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified bacterial inputs for phenotypic screening assays, reducing false positives from contaminating Gram-positive species.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible acoustophoretic focusing and aptamer-mediated capture.
- Scalability: Bifurcated channel design allows simultaneous processing, purification, and concentration for higher throughput in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of Gram-negative bacteria from clinical-like matrices such as blood or urine.
- Biomarker Alignment: Facilitates detection of live bacteria or derived biomarkers in early diagnosis applications, supporting translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Advancement: High recovery and purity metrics improve confidence in downstream assays used for lead compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery to preclinical continuum, specifically supporting sample preparation for target validation, assay readiness, and mechanistic studies where Gram-negative bacterial purity is critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating specific Gram-negative strains from mixed cultures or environmental samples for target de-risking.
- Screening: Enables assay-ready bacterial populations with minimal carryover of interfering components, improving screening fidelity.
- Analytics: Provides quantitative outputs via fluorescence microscopy and high-speed imaging, allowing bead-bacteria binding ratios and signal strength comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows by enabling isolation from medically relevant samples, supporting continuity in infectious disease model development.
- Enterprise Reuse: Chip-based design and pressure-controlled fluidics allow standardization across labs and adaptation to various sample types without redesign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity from sample impurities.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise acoustic force control and standardized aptamer-bead preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in antimicrobial programs by delivering high-fidelity biological inputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on cleaner mechanistic data from purified bacterial fractions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, acoustophoretic parameter optimization, and aptamer-bead conjugation protocols.
- Depends on piezoelectric transducers, function generators, power amplifiers, and fluorescence microscopy with high-speed imaging capability.
- Necessitates standardization of buffer conditions, flow rates (2 kPa sample, 4 kPa buffer), and PZT voltage calibration across users.
- Adaptation to different bacterial species or sample matrices may require re-optimization of aptamer selection and acoustic resonance frequency.
- Practical limitations include adhesive-induced channel corrugation if excess cyanoacrylate is used, affecting acoustic field uniformity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
