Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)
February 11th, 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).
Dieses Protokoll ermöglicht die Auflösung des periodischen Membranskeletts im Axon-Anfangssegment kultivierter Neuronen. Durch die Untersuchung der Lokalisation von Proteinen können Einblicke in die Funktion im periodischen Membranskelett gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Robustheit und Benutzerfreundlichkeit.
Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie ist in der Lage, das periodische Skelett der Membran aufzulösen, und die Probenvorbereitung ist einfach und unkompliziert. Jeder, der bereits Erfahrung in der Fluoreszenzmikroskopie hat, kann diese Technik problemlos anwenden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Probenvorbereitung und Bildgebung zu maximieren.
Um zu beginnen, fixieren Sie die Neuronen mit 4% Paraformaldehyd für 12 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckglas einmal in 0,2%BSA in Phosphatpufferlösung und inkubieren Sie für 10 Minuten in einer 1%igen Lösung von Triton X in PBS bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckslip mit BSA in Phosphatpufferlösung, verdünnen Sie die Anti-Ankyrin-G-Antikörper mit BSA in einer Phosphatpufferlösung im Verhältnis eins zu 200.
Antikörperlösung in den Deckslip geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1%Triton X in Phosphatpufferlösung und einmal in Phosphatpufferlösung. Verdünnen Sie Fluoro 4 markiert, fügen Sie weitere sekundäre Antikörper in BSA-Phosphatpufferlösung hinzu und fügen Sie sie dem Deckglas hinzu.
Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung. Bereiten Sie eine mikromolare Lösung aus markiertem Ferodin in Phosphatpufferlösung vor und fügen Sie sie den Zellen hinzu. Waschen Sie die Zellen einmal in Rinderserumalbuminphosphat-Pufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung.
Um den Deckzettel auf einem Glasobjektträger zu montieren, tragen Sie einen Tropfen Befestigungsmedium auf einen Objektträger auf, tauchen Sie den Deckglas in deionisiertes Wasser und klopfen Sie ihn mit einem weichen Papiertuch an, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Legen Sie den Deckbeleg auf den Glasträger und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Wenn möglich, konsultieren Sie vor der Bildgebung das Personal der Mikroskopieanlage und verwenden Sie einen Tauchölrechner, um das für die Probe geeignete Tauchöl auszuwählen.
Sobald die Proben fertig sind, stellen Sie sicher, dass die Deckzettel sauber und frei von Rückständen sind, indem Sie sie mit einer in Wasser oder Ethanol getauchten Baumwollspitze reinigen. Legen Sie die Probe in ein 3D-SIM-Mikroskop und suchen Sie die Zelle, um das Bild aufzunehmen. Stellen Sie die Leistung der relevanten Laserlinien ein.
Und die Belichtungszeiten, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, ohne die Probe signifikant zu bleichen. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen der Probe in der Z-Dimension fest und fahren Sie mit dem Abrufen eines Stapels fort. Führen Sie den Rekonstruktionsalgorithmus auf dem Stapel aus, um eine super aufgelöste Rekonstruktion zu erhalten.
Überprüfen Sie die Rekonstruktionen auf bekannte Artefakte und passen Sie gegebenenfalls die Parameter an, um sie zu korrigieren. Vergleichen Sie die SIM-Rekonstruktion mit einem Weitfeldbild, um Verbesserungen in der Auflösung zu beobachten. Verwenden Sie bei der Durchführung einer mehrfarbigen strukturierten Beleuchtungsmikroskopie den Ausrichtungsalgorithmus, um die verschiedenen Kanäle korrekt auszurichten, sobald eine zufriedenstellende Rekonstruktion abgeschlossen ist.
Aktinringe im periodischen Membranskelett haben ein charakteristisches periodisches Aussehen. Erstellen Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität in der Bildanalysesoftware unter Verwendung aller Fokusebenen, in denen die Aktinringe sichtbar sind. Zeichnen Sie auf dem Projektionsbild mit maximaler Intensität eine senkrechte Linie über sichtbare benachbarte Ringe und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität zusammen mit der Linienplotprofilfunktion der Software auf.
Um die mittlere Zwischenspitzenentfernung zu berechnen, notieren Sie sich die lokalen Maxima im Linienprofil und messen Sie den Abstand zwischen einzelnen benachbarten fluoreszierenden Intensitätsspitzen. Um die Kolokalisation verschiedener Proteine mit Aktinringen im periodischen Membranskelett zu bewerten, führen Sie ein Kolokalisierungsanalyseverfahren für SIM-Rekonstruktionen von Aktin und dem Kandidatenprotein durch. Ziehen Sie manuell eine Auswahl, um das Axon-Anfangssegment als Region von Interesse zu definieren, für das einfache Kolokalisierungs-Plugin in der Softwareplattform, und führen Sie die Analyse aus, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten für die Kolokalisierung zu berechnen.
Während der SIM-Bildanalyse zeigten die Rekonstruktionen von Bildstapeln eine deutliche Periodizität von Aktinringen. Ein Anti-Ankyrin-G-Antikörper wurde verwendet, um Ankyrin G sichtbar zu machen.Die Kolokalisation von Ankyrin-G- und Actin-Ringen wurde im Axon-Anfangssegment unter Verwendung eines Kolokalisierungsanalyseverfahrens getestet, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten zu berechnen. Der Pearson-Korrelationskoeffizient für die Kolokalisation der Fluoreszenz von Ankyrin G und Aktinringen betrug 0,36 plus oder minus 0,03.
Es ist wichtig, das richtige Tauchöl zu verwenden und die Laserleistung und Belichtungszeit so einzustellen, dass die Gitterlinien sichtbar sind. Sobald festgestellt wurde, dass Protein Teil des periodischen Membranskeletts ist, kann seine Funktion bei der Aufrechterhaltung des periodischen Membranskeletts untersucht und festgestellt werden. Zum Beispiel können die Auswirkungen des Abschlagens des Proteins auf Aktinringe analysiert werden.
Die Entwicklung von hochauflösenden Mikroskopietechniken ist der Grund, warum wir wissen, dass das Axon-Anfangssegment ein periodisches Membranskelett enthält, das aus Aktinringen, Spektrum und Ankyrin besteht. SIM hat es Forschern ermöglicht, periodische Skelettkomponenten der Membran einfach zu visualisieren und Aktinringe in lebenden Zellen zu betrachten.
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Überblick
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung und Messung von Aktinringen innerhalb des membranperiodischen Skeletts des axonalen Anfangssegments unter Verwendung kultivierter Rattenhippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM). Die Technik ermöglicht es Forschern, die Proteinlokalisation zu untersuchen und verbessert das Verständnis der Funktion des membranperiodischen Skeletts.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikroskopietechnik
Hintergrund
- Das axonale Anfangssegment ist entscheidend für die neuronale Signalübertragung.
- Aktinringe spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des membranperiodischen Skeletts.
- Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie verbessert die Auflösung bei der Bildgebung biologischer Proben.
- Das Verständnis der Lokalisation von Proteinen bietet Einblicke in ihre funktionellen Rollen.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll für die Bildgebung der Aktinringe in kultivierten Neuronen zu etablieren.
- Die Komponenten des membranperiodischen Skeletts zu klären.
- Die Kolokalisationsanalyse verschiedener Proteine im axonalen Anfangssegment zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Verwendung von 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie für die Bildgebung.
- Das wichtigste biologische Modell umfasste kultivierte Rattenhippocampus-Neuronen.
- Keine Erwähnung von Multiomik-Workflows wurde im Text gefunden.
- Kritische Schritte umfassten Fixierung, Antikörperinkubation und Bildgebungsvorbereitung.
- Die Bildanalyse wurde durchgeführt, um die Aktinringperiodizität und Protein-Kolokalisation zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglichte die Visualisierung von Aktinringen mit ausgeprägter Periodizität.
- Die Lokalisation von Ankyrin G und Aktinringen wurde quantifiziert und ergab einen Pearson-Koeffizienten von 0,36 ± 0,03.
- Die Identifizierung der Aktinringe unterstützt ihre Rolle im membranperiodischen Skelett.
- SIM ermöglichte deutliche Auflösungsverbesserungen im Vergleich zu traditionellen Wide-Field-Bildgebungsverfahren.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine robuste Methode zur Analyse des membranperiodischen Skeletts in Neuronen.
- Verbesserte Bildgebungstechniken tragen zum Verständnis der zellulären Architektur in neuronalen Zellen bei.
- Erkenntnisse aus dieser Forschung legen den Grundstein für zukünftige Erforschung neuronaler Proteinfunktionen und deren Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
