Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)
11. Februar 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).
Dieses Protokoll ermöglicht die Auflösung des periodischen Membranskeletts im Axon-Anfangssegment kultivierter Neuronen. Durch die Untersuchung der Lokalisation von Proteinen können Einblicke in die Funktion im periodischen Membranskelett gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Robustheit und Benutzerfreundlichkeit.
Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie ist in der Lage, das periodische Skelett der Membran aufzulösen, und die Probenvorbereitung ist einfach und unkompliziert. Jeder, der bereits Erfahrung in der Fluoreszenzmikroskopie hat, kann diese Technik problemlos anwenden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Probenvorbereitung und Bildgebung zu maximieren.
Um zu beginnen, fixieren Sie die Neuronen mit 4% Paraformaldehyd für 12 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckglas einmal in 0,2%BSA in Phosphatpufferlösung und inkubieren Sie für 10 Minuten in einer 1%igen Lösung von Triton X in PBS bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Deckslip mit BSA in Phosphatpufferlösung, verdünnen Sie die Anti-Ankyrin-G-Antikörper mit BSA in einer Phosphatpufferlösung im Verhältnis eins zu 200.
Antikörperlösung in den Deckslip geben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1%Triton X in Phosphatpufferlösung und einmal in Phosphatpufferlösung. Verdünnen Sie Fluoro 4 markiert, fügen Sie weitere sekundäre Antikörper in BSA-Phosphatpufferlösung hinzu und fügen Sie sie dem Deckglas hinzu.
Waschen Sie die Zellen einmal in BSA-Phosphatpufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung. Bereiten Sie eine mikromolare Lösung aus markiertem Ferodin in Phosphatpufferlösung vor und fügen Sie sie den Zellen hinzu. Waschen Sie die Zellen einmal in Rinderserumalbuminphosphat-Pufferlösung einmal in 0,1% Triton X in Phosphatpufferlösung, dann einmal in Phosphatpufferlösung.
Um den Deckzettel auf einem Glasobjektträger zu montieren, tragen Sie einen Tropfen Befestigungsmedium auf einen Objektträger auf, tauchen Sie den Deckglas in deionisiertes Wasser und klopfen Sie ihn mit einem weichen Papiertuch an, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Legen Sie den Deckbeleg auf den Glasträger und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Wenn möglich, konsultieren Sie vor der Bildgebung das Personal der Mikroskopieanlage und verwenden Sie einen Tauchölrechner, um das für die Probe geeignete Tauchöl auszuwählen.
Sobald die Proben fertig sind, stellen Sie sicher, dass die Deckzettel sauber und frei von Rückständen sind, indem Sie sie mit einer in Wasser oder Ethanol getauchten Baumwollspitze reinigen. Legen Sie die Probe in ein 3D-SIM-Mikroskop und suchen Sie die Zelle, um das Bild aufzunehmen. Stellen Sie die Leistung der relevanten Laserlinien ein.
Und die Belichtungszeiten, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, ohne die Probe signifikant zu bleichen. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen der Probe in der Z-Dimension fest und fahren Sie mit dem Abrufen eines Stapels fort. Führen Sie den Rekonstruktionsalgorithmus auf dem Stapel aus, um eine super aufgelöste Rekonstruktion zu erhalten.
Überprüfen Sie die Rekonstruktionen auf bekannte Artefakte und passen Sie gegebenenfalls die Parameter an, um sie zu korrigieren. Vergleichen Sie die SIM-Rekonstruktion mit einem Weitfeldbild, um Verbesserungen in der Auflösung zu beobachten. Verwenden Sie bei der Durchführung einer mehrfarbigen strukturierten Beleuchtungsmikroskopie den Ausrichtungsalgorithmus, um die verschiedenen Kanäle korrekt auszurichten, sobald eine zufriedenstellende Rekonstruktion abgeschlossen ist.
Aktinringe im periodischen Membranskelett haben ein charakteristisches periodisches Aussehen. Erstellen Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität in der Bildanalysesoftware unter Verwendung aller Fokusebenen, in denen die Aktinringe sichtbar sind. Zeichnen Sie auf dem Projektionsbild mit maximaler Intensität eine senkrechte Linie über sichtbare benachbarte Ringe und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität zusammen mit der Linienplotprofilfunktion der Software auf.
Um die mittlere Zwischenspitzenentfernung zu berechnen, notieren Sie sich die lokalen Maxima im Linienprofil und messen Sie den Abstand zwischen einzelnen benachbarten fluoreszierenden Intensitätsspitzen. Um die Kolokalisation verschiedener Proteine mit Aktinringen im periodischen Membranskelett zu bewerten, führen Sie ein Kolokalisierungsanalyseverfahren für SIM-Rekonstruktionen von Aktin und dem Kandidatenprotein durch. Ziehen Sie manuell eine Auswahl, um das Axon-Anfangssegment als Region von Interesse zu definieren, für das einfache Kolokalisierungs-Plugin in der Softwareplattform, und führen Sie die Analyse aus, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten für die Kolokalisierung zu berechnen.
Während der SIM-Bildanalyse zeigten die Rekonstruktionen von Bildstapeln eine deutliche Periodizität von Aktinringen. Ein Anti-Ankyrin-G-Antikörper wurde verwendet, um Ankyrin G sichtbar zu machen.Die Kolokalisation von Ankyrin-G- und Actin-Ringen wurde im Axon-Anfangssegment unter Verwendung eines Kolokalisierungsanalyseverfahrens getestet, um den Pearson-Korrelationskoeffizienten zu berechnen. Der Pearson-Korrelationskoeffizient für die Kolokalisation der Fluoreszenz von Ankyrin G und Aktinringen betrug 0,36 plus oder minus 0,03.
Es ist wichtig, das richtige Tauchöl zu verwenden und die Laserleistung und Belichtungszeit so einzustellen, dass die Gitterlinien sichtbar sind. Sobald festgestellt wurde, dass Protein Teil des periodischen Membranskeletts ist, kann seine Funktion bei der Aufrechterhaltung des periodischen Membranskeletts untersucht und festgestellt werden. Zum Beispiel können die Auswirkungen des Abschlagens des Proteins auf Aktinringe analysiert werden.
Die Entwicklung von hochauflösenden Mikroskopietechniken ist der Grund, warum wir wissen, dass das Axon-Anfangssegment ein periodisches Membranskelett enthält, das aus Aktinringen, Spektrum und Ankyrin besteht. SIM hat es Forschern ermöglicht, periodische Skelettkomponenten der Membran einfach zu visualisieren und Aktinringe in lebenden Zellen zu betrachten.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung und Messung von Aktinringen im membranperiodischen Zellskelett des Axonanfangssegments unter Verwendung kultivierter hippokampaler Neuronen von Ratten und der 3D-strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM). Die Methode ermöglicht es Forschenden, die Proteinlokalisation zu untersuchen und somit das Verständnis der Funktion des membranperiodischen Zellskeletts zu vertiefen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikroskopietechnik
Hintergrund
- Das Axoninitialsegment ist entscheidend für die neuronale Signalübertragung.
- Actinringe spielen eine bedeutende Rolle bei der Aufrechterhaltung des membranassoziierten periodischen Zytoskeletts.
- Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie verbessert die Auflösung bei der Abbildung biologischer Proben.
- Das Verständnis der Lokalisation von Proteinen liefert Erkenntnisse über ihre funktionellen Aufgaben.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls zur Abbildung der Aktinringe in kultivierten Neuronen.
- Aufklärung der Bestandteile des membranperiodischen Zytoskeletts.
- Erleichterung der Kolokalisierungsanalyse verschiedener Proteine im axonalen Anfangssegment.
Verwendete Methoden
- Verwendung der 3D-strukturierten Beleuchtungsmikroskopie zur Abbildung.
- Das zentrale biologische Modell umfasste kultivierte hippocampale Neuronen der Ratte.
- Im Text wurde kein Hinweis auf Multiomik-Workflows gefunden.
- Zu den kritischen Schritten gehörten Fixierung, Antikörperinkubation und Vorbereitung der Bildaufnahme.
- Die Bildanalyse diente zur Bewertung der periodischen Anordnung von Aktinringen und der Proteinkokokalisation.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglichte die Visualisierung von Aktinringen mit charakteristischer Periodizität.
- Die Kolokalisation von Ankyrin G und Aktinringen wurde quantifiziert und ergab einen Pearsonschen Korrelationskoeffizienten von 0,36 ± 0,03.
- Die Identifizierung der Aktinringe untermauert deren Rolle im periodischen Membranskelett.
- SIM ermöglichte eine deutliche Verbesserung der Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeld-Aufnahmeverfahren.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine robuste Methode zur Analyse des membranperiodischen Zellskeletts in Neuronen.
- Verbesserte Abbildungstechniken tragen zum Verständnis der zellulären Architektur in neuronalen Zellen bei.
- Erkenntnisse aus dieser Forschung legen den Grundstein für zukünftige Untersuchungen neuronaler Proteinfunktionen und deren Bedeutung für Gesundheit und Krankheit.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der strukturellen Organisation des membranperiodischen Zellskeletts am Axon-Anfangssegment unterstützt die Zielvalidierung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung, indem es den räumlichen Kontext von Ionenkanälen und Gerüstproteinen klärt. Diese mechanistische Erkenntnis ermöglicht eine vorhersagende Absicherung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit Erkrankungen der neuronalen Erregbarkeit. Die Methode erhöht das Vertrauen in Target-Engagement-Studien, indem sie quantitative räumliche Daten zur Proteinlokalisation in einem krankheitsrelevanten subzellulären Kompartiment bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Aufklärung der nanoskaligen Architektur des membranperiodischen Zellskeletts am Axoninitialsegment.
- Operativer Wert: Bietet ein robustes und zugängliches Verfahren der Super-Auflösungsmikroskopie zur Validierung der Lokalisation von Zielstrukturen in neuronalen Modellen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch quantitative Beurteilung der Proteineperiodizität und deren Kolokalisation mit Aktinringen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzintensitätsprofile und Pearsons Korrelationskoeffizienten zur Beurteilung räumlicher Beziehungen zwischen Proteinen und Aktinringen.
- Operativer Wert: Bietet reproduzierbare, standardisierte Bildgebungsabläufe, die mit Mehrloch-Neuronenkulturformaten kompatibel sind.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt superauflösende Rekonstruktionen, die eine zuverlässige Detektion subzellulärer Proteinlokalisationsmuster ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Lokalisation molekularer Zielstrukturen mit der funktionellen Erhaltung des membranperiodischen Gerüsts in einem krankheitsrelevanten neuronalen System.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob Kandidatenproteine strukturelle Bestandteile des axonalen Initialgerüsts sind, und liefert damit Hinweise für die Zielstruktauswahl bei neuropsychiatrischen Indikationen.
- Predictive Confidence: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem geklärt wird, ob ein Protein Bestandteil des periodischen Gerüsts ist, bevor eine funktionelle Validierung erfolgt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt die Target-Validierung durch subzelluläre Auflösung und ermöglicht den Übergang zu mechanistischen Studien in neuronalen Modellen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung, indem untersucht wird, ob eine Proteinkomponente eine periodische Lokalisation aufweist, die mit einer Integration in das membranständige periodische Zytoskelett vereinbar ist.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays zur hochinformativen Analyse von Proteinlokalisierungsmustern in fixierten neuronalen Kulturen.
- Analytik: Liefert quantitative Messgrößen, einschließlich Abstandsmessungen zwischen benachbarten Signalmaxima und Koeffizienten zur Kolokalisation, für einen objektiven Vergleich über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Befunde mit der strukturellen Integrität des axonalen Anfangssegments, einem entscheidenden Faktor für neuronale Polarität und Signalübertragung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Bildgebungsplattform, die auf mehrere Zielstrukturen in verschiedenen neurowissenschaftlichen Entdeckungsprogrammen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die nanoskalige räumliche Organisation von Proteinen im Axon-Anfangssegment definiert wird.
- Operativer Wert: Zeichnet sich durch einfache Handhabung und Robustheit aus und setzt lediglich Erfahrung in der Standard-Fluoreszenzmikroskopie sowie Zugang zu gängiger Super-Auflösungs-Mikroskopie voraus.
- Strategischer Wert: Steigert die Zuversicht bei der Zielstruktur-Auswahl, indem die subzelluläre Lokalisation validiert wird, bevor in funktionelle Assays investiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf deren Integration in das Gerüst des Axon-Anfangssegments.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Vertrautheit mit den Prinzipien der Fluoreszenzmikroskopie und der Super-Auflösungs-Bildgebung.
- Hängt von dem Zugang zu 3D-SIM-Geräten und einer geeigneten Optimierung des Immersionsöls ab.
- Erfordert standardisierte Antikörper-Validierung und Blockierungsbedingungen, um unspezifische Signale zu minimieren.
- Beinhaltet eine sorgfältige Kalibrierung von Laserleistung und Belichtungszeit, um das Verhältnis von Signal zu Rauschen mit der Photobleiche auszugleichen.
- Ist vorwiegend auf fixierte neuronale Kulturen anwendbar; Anwendungen an lebenden Zellen erfordern zusätzliche Validierung.
