Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik
8. April 2022
Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen zu überwachen, um neuronale oder Gliareaktionen basierend auf Kaliumchlorid oder ATP-Reizen zu differenzieren. Kalzium ist ein wichtiger zweiter Botenstoff, der an mehreren zellulären Prozessen beteiligt ist, einschließlich Neurotransmission, Plastizität und Apoptose. Das Aufkommen von hochselektiven fluoreszierenden Kalziumfarbstoffen wie Fura-2 AM, verbunden mit der Entwicklung besserer Fluoreszenzmikroskope und Berechnungsmethoden, lieferte hochauflösende optische Daten mit einem hohen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung, um Kalziumsignale auf lebenden Zellen und Organismen abzubilden.
Dieses Protokoll kann an angereicherte Neuronen, gereinigte Glia- oder Mischpopulationskulturen angepasst werden. Es verfolgt, welche Zelltypen auf bestimmte Reize reagierten, basierend auf der differentiellen Reaktion auf Kaliumchlorid und ATP. Kaliumchlorid verändert das Membranpotential der Zelle.
Und dies öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die im Wesentlichen von Neuronen ausgedrückt werden. Auf der anderen Seite aktiviert ATP den P2X7-Großteilkanal, der hauptsächlich in Gliazellen vorhanden ist. Durch die Kopplung von Kaliumchlorid und ATP-Stimuli mit anderen Medikamenten ist es möglich zu sehen, welches Kompartiment des Nervensystems auf sie reagiert, basierend auf der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration.
Für dieses Verfahren benötigen Sie einige chirurgische Instrumente oder eine Pinzette. Verwenden Sie eine Biosicherheitswerkbank und führen Sie Best Practices durch, um Kontaminationen zu vermeiden. Um die Hühnernetzhautkultur zu beginnen, öffnen Sie vorsichtig ein befruchtetes Ei am Boden, wo sich die Luftzelle befindet.
Entfernen Sie den Inhalt in eine Petrischale und fahren Sie mit der Embryonenabgabe durch Enthauptung mit einer Pinzette fort. Sobald der Kopf entfernt ist, bringen Sie ihn in eine saubere Petrischale und fügen Sie etwas kalzium- und magnesiumfreie Lösung hinzu. Als nächstes entfernen Sie die Augen und achten Sie darauf, sie dabei nicht zu beschädigen.
Bringen Sie das Auge zu einer anderen Petrischale mit CMF-Lösung. Beginnen Sie mit einer Pinzette, das Auge zu sezieren, indem Sie die Linse entfernen. Dann, beginnend mit dem Loch, das die Linse hinterlassen hat, machen Sie drei oder vier Längsschnitte im Auge.
Entfernen Sie den transparenten Glaskörper mit Vorsicht. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht daran gebunden ist. Als nächstes lösen Sie vorsichtig die Netzhaut vom pigmentierten Epithel.
Entfernen Sie das verbleibende Epithelgewebe. Wenn die Netzhaut völlig klar ist, schneiden Sie sie in kleine Stücke. Nehmen Sie das gesamte Netzhautgewebe mit Hilfe einer automatisierten Pipette ein.
Zentrifugieren Sie kurz die Netzhaut, um das gesamte CMF zu entfernen. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu. Und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C für 10 Minuten.
Stoppen Sie die Trypsinreaktion, indem Sie 1 ml Medium hinzufügen, das 10% fetales Kälberserum enthält. Zentrifugieren Sie die Netzhaut, um das gesamte Trypsin zu entfernen. Waschen Sie die Zellen zwei- oder dreimal mit einem Medium, das 10% FCS enthält.
Als nächstes fügen Sie 2 ml Medium pro Netzhaut hinzu und dissoziieren Sie es sanft mechanisch. Verdünnen Sie die Zellen, damit Sie sie mit einem Hämozytometer richtig zählen können. Verwenden Sie 15-mm-Deckgläser, die mit Poly-L-Lysin und Laminin geschützt sind, um die Zelladhäsion zu unterstützen.
Pipette 50 L Ihrer verdünnten Zellen auf jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in 5%CO2-Atmosphäre. Und kühlen Sie sie, um das Glas zu befestigen.
Dies sollte etwa ein bis zwei Stunden dauern. Fügen Sie 1 ml Medium hinzu und bringen Sie es bis zum Tag des Experiments in den Inkubator zurück. Bei Bedarf wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des Mediums.
Rekonstituieren Sie eine 50 g Fläschchen Fura-2 AM mit 50 L DMSO. Krebslösung ist eine gute Option, um Zellen während des Experiments zu übertragen, da sie die Fluoreszenzmessung nicht stört. Die Lösung vor Beginn auf 37 vorheizen.
Poloxamer 407 hinzufügen. Fügen Sie Fura-2 AM und DMSO hinzu. Beschallen Sie es sieben Minuten lang in einem Wasserbad.
Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie Krebs-Lösung zu drei Vertiefungen und die funktionierende Fura-2-Lösung zu einer anderen hinzufügen. Waschen Sie das Deckglas, das Ihre Zellen enthält, dreimal, bevor Sie es zum Fura-2-Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre für 30 Minuten in einem dunklen Inkubator.
Nach der Inkubation dreimal waschen. Übertragen Sie es auf einen anderen Empfänger, der Krebs enthält, und schützen Sie es vor dem Licht. Es ist möglich, den vorbereiteten Fura-2 wiederzuverwenden, um mehr Deckgläser mit Zellen zu inkubieren.
Fügen Sie vor jedem Durchlauf Silizium zur Deckglashalterung und -kammer hinzu, um ein Auslaufen der Lösung zu vermeiden. Nehmen Sie das Deckglas aus Krebs-Lösung heraus und waschen Sie den Boden vorsichtig mit destilliertem Wasser, um eine Salzkristallisation auf der Mikroskoplinse zu vermeiden. Setzen Sie den Decklack auf die Stütze und drücken Sie vorsichtig auf die Ränder.
Befestigen Sie die Deckglasstütze und die Kammer am Mikroskop und beginnen Sie, die Zellen mit Krebslösung zu durchbluten. Markieren Sie die entsprechenden Zellen und wählen Sie ein gutes Feld aus. Bestimmen Sie manuell die Regionen von Interesse, indem Sie Zellkörper basierend auf ihrer unterschiedlichen Morphologie auswählen.
Die Variationen der Calciumkonzentration wurden durch Quantifizierung des Verhältnisses der Fluoreszenz, die bei 510 nm nach abwechselnder Anregung bei 340 und 380 nm emittiert wurde, bewertet. Nach der Zugabe von Kaliumchlorid ist es möglich, viele Zellen leuchten zu sehen und die Fluoreszenzreaktion in der Grafik zu erhöhen. Kaliumchlorid öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die hauptsächlich in Neuronen vorhanden sind.
Jede einzelne Linie im Diagramm stellt die einzigartige Region von Interesse dar. Daher ist es möglich, einzelne Zellreaktionen während des Experiments zu verfolgen. ATP-Stimuli öffnen den P2X7-Rezeptor, der im Wesentlichen von Gliazellen exprimiert wird.
Dies ist eine angereicherte Neuronenkultur. Daher gibt es hier nur wenige Gliazellen. Dies ist der Grund, warum so wenige Zellen auf die ATP-Reize reagieren.
Die erfassten Werte wurden mit der Metafluor-Software verarbeitet. Experimentelle Ergebnisse werden in einer Excel-Tabelle ausgedrückt, in der jede Zeile eine einzelne Zelle und jede Zeile einen Zeitpunkt darstellt. Mit Excel-Software ist es möglich, Kalziumvariationen einzelner Zellen separat oder von allen im selben Diagramm darzustellen.
Um die Menge an reaktiven Zellen für einen Stimulus zu quantifizieren, legen Sie einen Grenzwert von 30% fest, der den Kalzium-Ausgangswert erhöht. Hier verwenden wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken des 8. Tages, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren, nachdem sie 50 mm Kaliumchlorid und 1 mm ATP-Reize erhalten haben. In jedem Experiment wurden etwa 100 Zellen leicht analysiert.
Abbildung A stellt eine Mischkultur dar, die sowohl Neuronen als auch Glia enthält und eine Woche lang aufrechterhalten wurde. Wenn wir die Antworten quantifizieren, ist es möglich zu sehen, dass etwa die Hälfte der analysierten Zellen Kaliumchlorid antwortet und die andere Hälfte auf ATP reagiert. Abbildung B bezieht sich auf eine mit Neuronen angereicherte Kultur.
Es wurde nur drei Tage lang inkubiert, daher haben sich die meisten Gliazellen noch nicht differenziert. In diesem Fall antworten 89% der Zellen auf Kaliumchlorid und verstärken die Prävalenz von Neuronen. Abbildung C zeigt eine gereinigte Gliakultur.
Diese Zellen wurden 10 Tage lang mit mittleren Änderungen alle drei Tage aufrechterhalten. Nach dieser Zeit sterben die meisten Neuronen und hinterlassen nur noch Glia. Tatsächlich wurde diese Kultur ausschließlich von ATP aktiviert.
Diese Methodik wurde aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als Second Messenger breit angewendet. Die phänotypische Analyse kann verbessert werden, indem diese Methodik mit der Immunchemie fester Zellen nach der Kalziumbildgebung ergänzt wird. Dieses Protokoll könnte auch an andere Mischzellsysteme angepasst werden, die andere Kalziumkanäle exprimieren.
Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Kalzium-Bildgebung von Zellen als Methode zur Überwachung von Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration in lebenden Zellen. Unter Verwendung einer Hühnerretina-Kultur unterscheidet die Arbeit die Reaktionen von Neuronen und Gliazellen auf Reize durch Kaliumchlorid und ATP und verdeutlicht dabei die Beteiligung von Kalziumdynamik an Signalisierungsvorgängen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- Calcium ist ein entscheidender sekundärer Botenstoff in verschiedenen zellulären Prozessen.
- Hochselektive fluoreszierende Kalziumfarbstoffe ermöglichen fortschrittliche Abbildungstechniken.
- Die Reaktion verschiedener Zelltypen auf spezifische Reize kann Aufschluss über ihre funktionellen Rollen geben.
- Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung neuronaler und glialer Signalübertragung in kultivierten Zellen.
Zweck der Studie
- Um Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen zu überwachen.
- Um die Kalziumantworten von Neuronen und Gliazellen basierend auf spezifischen Reizen zu unterscheiden.
- Um die funktionellen Rollen dieser Zelltypen in der Kalziumsignalisierung aufzuklären.
Verwendete Methoden
- Die verwendete Plattform ist eine Zellkultur aus Hühnerretinazellen.
- Diese Studie konzentriert sich hauptsächlich auf angereicherte Neuronenkulturen und Gliazellen.
- Die Methode beinhaltet die Verwendung von Fura-2 AM für die Kalzium-Bildgebung.
- Die Zellen werden mit Kaliumchlorid und ATP behandelt, um intrazelluläre Kalziumverschiebungen zu messen.
- Die Daten werden mit Metafluor-Software analysiert und in Excel-Tabellen dargestellt.
Hauptergebnisse
- Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Kalziumantworten in Neuronen, wenn diese mit Kaliumchlorid stimuliert werden.
- Gliazellen reagieren hauptsächlich auf ATP-Reize, was ihre Rolle in der Kalziumsignalübertragung unterstreicht.
- Die Studie liefert Einblicke in die räumlichen und zeitlichen Dynamiken der Kalziumsignalübertragung in gemischten Kulturen.
- Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methode zelluläre Reaktionen basierend auf der Behandlung effektiv differenziert.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt die Wirksamkeit der Kalzium-Bildgebung für das Verständnis zelltypspezifischer Antworten.
- Die Methodik ermöglicht eine detaillierte Verfolgung der Kalziumdynamik und verbessert dadurch das Verständnis neuronaler Mechanismen.
- Diese Erkenntnisse können zukünftige Forschungsarbeiten zur Plastizität und zellulären Kommunikation im Nervensystem leiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Ansatz der Kalzium-Bildgebung ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, die Zielvalidierung hinsichtlich Risiken zu bewerten, indem funktionell zwischen neuronalen und glialen Beiträgen zu Signalwegen unterschieden wird. Durch die Quantifizierung stimuliusspezifischer Kalzium-Veränderungen liefert die Methode Einblicke in die Wirkmechanismen zelltypspezifischer Arzneimittelantworten und verbessert so die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckung. Sie stellt eine skalierbare und reproduzierbare Plattform für die Assay-Entwicklung in der Neuropharmakologie und bei Studien zur glialen Modulation bereit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem neuronale von glialen Kalziumantworten auf KCl- und ATP-Stimuli isoliert werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch differenzielle Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle und P2X7-Rezeptoren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem zelltypspezifische Signalmechanismen identifiziert werden, die Aufschluss über die Selektivität und Sicherheitsbewertung von Wirkstoffen geben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte neuronale und gliale Kultursysteme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening mit definierten Stimulus-Antwort-Profilen vor.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, quantitative Calcium-Fluss-Messwerte mittels ratiometrischer Fura-2-Bildgebung zur Reproduzierbarkeit des Assays.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über gemischte oder gereinigte Zellsysteme hinweg, die selektiv für Calcium permeable Kanäle exprimieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Daten zur Kalziumsignalgebung aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung durch phänotypisch ausgerichtete neuronale und gliale Kokultivierungsmodelle.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Korrelation funktioneller Kalziumverschiebungen mit downstream liegenden translationalen Biomarkern für Erregbarkeit oder Neuroinflammation.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie frühzeitige Hinweise auf off-target-Gliaktivierung oder neuronale Toxizitätsprofile im Entwicklungsprozess liefert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung und liefert funktionelle Daten zur Kalziumsignalisierung, die eine mechanistische Ent-Risikobewertung vor der präklinischen Investition unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem Kaliumchlorid-induzierte Kalziumflüsse mit der neuronalen Erregbarkeit und ATP-vermittelte Verschiebungen mit Aktivierungszuständen von Gliazellen verknüpft werden.
- Screening: Bietet gebrauchsfertige, reproduzierbare Systeme mit quantifizierbaren Ausgangsgrößen zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Kalziumverarbeitung in Neuronen im Vergleich zu Gliazellen.
- Analytik: Ermöglicht die Analyse von Kalziumdynamiken auf Einzelzell- und Populationsebene mithilfe von Metafluor und Excel und erleichtert so den Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Kalziumsignalmuster mit präklinischen Modellen über konservierte Signalmechanismen zwischen Neuronen und Gliazellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die auf verschiedene neuronale und gliale Kultursysteme in unterschiedlichen therapeutischen Bereichen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten in neuron-glialem Signalwegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Stimulationsprotokolle und verhältnisbasierte Kalziumquantifizierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Erkennung zelltypspezifischer Risiken ermöglicht wird und das Risiko von Ausfällen in späteren Entwicklungsstadien reduziert wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen mit selektiven Modulationsprofilen für Neuronen oder Gliazellen identifiziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Primärzellkultur, der Kalzium-Bildgebung und der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu fluoreszierenden Mikroskopen mit Doppelwellenlängen-Anregung und Perfusionsystemen zur Stimulationserfassung voraus.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Stimuluskonzentrationen, Inkubationszeiten und Protokollen zur Bildanalyse.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Validierung der selektiven Expression kalziumpermeabler Rezeptoren (z. B. VGCCs, P2X7) in den verwendeten Modellsystemen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Variabilität des Ertrags primärer Kulturen sowie in der Notwendigkeit einer Optimierung, wenn die Methode auf aus humanen iPSCs abgeleitete neuronale und gliale Kokulturen ausgeweitet wird.
