Name: Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung von intraventrikulären Blutungen durch Hämoglobin-Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Hydrozephalus und weißer Substanz-Schädigung für die Entwicklung neuer Therapien.

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JMS erhielt Mittel von NIH / NINDS R01 NS110793 und K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM erhielt Mittel von NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award und einen Hydrocephalus Association Innovator Award.

HINWEIS: Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Institutionen genehmigt. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Herstellung von Hämoglobin- und Liquorlösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine sterile künstliche Liquorlösung (aCSF) vor, indem Sie 500 μL der aCSF-Lösung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen geben und auf Eis lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine sterile 150 mg / ml Hämoglobinlösung vor, indem Sie 75 mg Hämoglobin zu 500 μL aCSF in einem 1,5 ml Mikroröhrchen hinzufügen und auf Eis lagern.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Tieres zur Injektion
<ol><li>Drehen Sie das Heizkissen auf die mittlere Einstellung, um die Körpertemperatur der Ratte aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Anästhesieren Sie postnatale Tag 4 (P4) Ratten in einer Induktionskammer, die mit 3% Isofluran gefüllt ist. HINWEIS: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit der Zehen- / Schwanzklemmreaktion alle 15 Minuten. Überwachen Sie die Anästhesie mit visueller Beobachtung von Gewebefarbe, Körpertemperatur und Atemfrequenz.</li>
	<li>Schmerzlinderung mit einer subkutanen Carprofen-Injektion von 5 mg/kg an die anästhesierte Ratte verabreichen.</li>
	<li>Legen Sie die anästhesierte Ratte anfällig in das stereotaktische Gerät mit der Nase im Anästhesieadapter mit einem konstanten Fluss von 1,5% Isofluran.</li>
	<li>Ziehen Sie die nicht reißenden Ohrstangen am äußeren Gehörgang fest, um den Kopf zu sichern. HINWEIS: Tragen Sie Tiersalbe auf, um die Augen mit Feuchtigkeit zu versorgen, wenn die Augen im Alter der Injektion geöffnet sind.</li>
	<li>Reinigen Sie den Kopf abwechselnd mit sterilen Applikatoren mit Baumwollbestückung, die mit Betadin und 70% Ethanol getränkt sind.<ol><li>Berühren Sie den Betadin-getränkten Applikator in der Mitte der Kopfhaut und verteilen Sie das Betadin in Kreisen, bewegen Sie sich nach außen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6.1.1 mit dem mit Ethanol getränkten Applikator.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6.1.1 und Schritt 2.6.1.2 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Tragen Sie einen sterilen chirurgischen Tuch auf, um das Operationsfeld zu schützen.</li>
	<li>Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 0,3 cm langen Schnitt senkrecht in der Mitte des Kopfes, um das Bregma des Schädels freizulegen. HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, legen Sie das Lambda des Schädels anstelle des Bregma frei.</li>
	<li>Verwenden Sie einen sterilen Baumwollapplikator, um den Bereich zu trocknen.</li>
</ol>3. Einrichten des stereotaktischen Injektors
<ol><li>Ziehen Sie die in Schritt 1.2 vorbereitete Hämoglobinlösung mit einer 30G-Nadel in eine sterile 0,3-ml-Spritze und legen Sie die Spritze in das stereotaktische Injektorsystem. HINWEIS: Wenn Sie Kontrollbedingungen erzeugen, ziehen Sie eine in Schritt 1.1 vorbereitete CSF-Lösung in eine 0,3-ml-sterile Spritze und fahren Sie mit dem Protokoll fort.</li>
	<li>Schalten Sie die stereotaktische Injektorschnittstelle ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Konfiguration , um die Einstellungen für die Einspritzlautstärke und -rate einzugeben.<ol><li>Klicken Sie auf Volume und stellen Sie die Lautstärke auf 20.000 nL (20 μL) ein.</li>
		<li>Klicken Sie auf Infusionsrate und stellen Sie die Rate auf 8.000 nL /min (8 μL/min) ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Beenden Sie die Konfiguration, indem Sie auf die Schaltfläche Reset Pos klicken.</li>
	<li>Spülen Sie die Nadelspitze, indem Sie auf die Schaltfläche Infuse klicken, bis eine kleine Perle Hämoglobinlösung an der Nadelspitze austritt.</li>
	<li>Leiten Sie die Hämoglobinlösung vorsichtig mit einem sterilen Baumwollapplikator von der Nadelspitze ab.</li>
</ol>4. Tierinjektion
<ol><li>Stellen Sie das Bregma auf dem stereotaktischen Injektorsystem auf Null ein, indem Sie die mediolateralen und anteroposterioren Positionen der Spritze anpassen, bevor Sie die Spitze der gespülten Spritzennadel absenken, um den Schädel am Bregma sanft zu berühren. HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, setzen Sie Lambda auf Null.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Koordinaten Ihrer Wahl.<ol><li>Wenn Sie aus dem Bregma injizieren, verwenden Sie bei P4-Ratten , wie hier beschrieben, 1,5 mm seitlich, 0,4 mm vorn und 2,0 mm tief von Bregma.</li>
		<li>Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, verwenden Sie die folgenden Koordinaten für P4-Ratten: 1,1 mm seitlich, 4,6 mm vorn und 3,3 mm tief von Lambda.</li>
	</ol></li>
	<li>Heben Sie die Spritzennadel 1 cm über den Schädel, um die Kopfhaut zu reinigen. Wenn die Spritze angehoben wird, stellen Sie die mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten ein.</li>
	<li>Senken Sie die Spritzennadel, um den Schädel vorsichtig zu berühren. Überprüfen Sie, ob die Nadel den Schädel berührt.</li>
	<li>Stellen Sie die dorsoventrale Koordinate über einen Zeitraum von 30 s ein. HINWEIS: Beim Einstellen der dorsoventralen Koordinate durchsticht die Nadel den Schädel. Es muss darauf geachtet werden, dass die Spritze den Schädel passiert, ohne den Schädel zu verformen. Eine Schädelverformung wird vermieden, indem die Nadel bei einer Verformung langsam entlang der dorsoventralen Koordinate zurückgezogen und die Nadel dann wieder entlang der gleichen Flugbahn platziert wird. Dadurch kann die Nadel das Loch im Schädel mit weniger Kraft und ohne Verformung passieren.</li>
	<li>Klicken Sie auf der stereotaktischen Injektorschnittstelle auf die Schaltfläche Ausführen , um die Injektion zu starten.</li>
	<li>Nachdem die Injektion beendet ist, lassen Sie die Spritzennadel 2 min an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung zu minimieren.</li>
	<li>Ziehen Sie die Spritze langsam entlang der dorsoventralen Koordinate über 2 min zurück, bis sich die Nadelspitze 2 cm über der Kopfhaut befindet.</li>
	<li>Drehen Sie den stereotaktischen Injektorarm vom Operationsfeld weg.</li>
</ol>5. Nachsorge
<ol><li>Verschließen Sie die Kopfhaut mit einer 6-0-Monofilament-Naht. Machen Sie eine einfache unterbrochene Naht in der Mitte des 0,3 cm langen Einschnitts.</li>
	<li>Entfernen Sie den Welpen aus der Narkose und legen Sie ihn auf eine sichere Stelle auf dem Heizkissen.</li>
	<li>Bringen Sie das Nagetier in den heimischen Käfig zurück, um sich von der Anästhesie unter der Obhut seines Muttertiers zu erholen. HINWEIS: Die rechtzeitige Rückkehr in die Pflege des Muttertiers reduziert die frühe postoperative Mortalität.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tiere auf Anästhesie durch Verlust des aufrichtenden Reflexes stündlich nach der Operation für 3 h.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tiere täglich für 7 Tage auf normale Aktivität, Nahrungsaufnahme und Gewichtszunahme. Überwachen Sie die Inzisionsstelle auf Wundheilung, Verschluss und Wiederauftreten von Fell an der Operationsstelle. HINWEIS: In dem seltenen Fall, dass neurologische Veränderungen wie Krampfanfälle, zentrale Depression oder verminderter Appetit während der Überwachung beobachtet werden, wird das Tier unter intravaskulärer Perfusion oder zervikaler Dislokation unter Narkose eingeschläfert.</li>
	<li>Um eine Infektion zu verhindern, sobald die Naht geschlossen ist und die Wunde heilt, wenden Sie ein topisches Dreifachantibiotikum an der Inzisionsstelle an.</li>
</ol>6. MRT-Erfassung und Quantifizierung
<ol><li>Führen Sie eine MRT auf einem 4,7T- oder 9,4T-Kleintierscanner durch.</li>
	<li>Drehen Sie das Heizkissen auf die mittlere Einstellung, um die Körpertemperatur der Ratte aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Induktion der Anästhesie in einer Kammer mit 3% Isofluran. HINWEIS: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit der Zehen- / Schwanzklemmreaktion alle 15 Minuten. Überwachen Sie die Anästhesie mit visueller Beobachtung von Gewebefarbe, Körpertemperatur und Atemfrequenz.</li>
	<li>Legen Sie die anästhesierte Ratte anfällig in das MRT, wobei die Nase im Anästhesieadapter mit einem konstanten Fluss von 1,5% Isofluran positioniert ist.</li>
	<li>Führen Sie eine T2-gewichtete Bildgebung durch, indem Sie eine T2-gewichtete schnelle Spin-Echosequenz auswählen.<ol><li>Wenn Sie einen 4,7T-MRT-Scanner verwenden, geben Sie die folgenden Parameter in die MRT-Software ein: Wiederholzeit = 3.000 ms, Echozeit = 27,50 ms, Anzahl der Mittelwerte = 3, Sichtfeld = 18,0 mm x 18,0 mm, Matrix = 128 x 128, Anzahl axialer Scheiben = 24, Dicke = 0,50 mm.</li>
		<li>Wenn Sie einen 9,4T-MRT-Scanner verwenden, geben Sie die folgenden Parameter in die MRT-Software ein: Wiederholzeit = 5.000 ms, Echozeit = 66,00 ms, Echoabstand = 16,50 ms, Anzahl der Mittelwerte = 2, Wiederholungen = 1, seltener Faktor = 8, Sichtfeld = 16,0 mm x 16,0 mm, Matrix = 256 x 256, Anzahl axialer Scheiben = 32, Dicke = 0,50 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die Sequenz zu starten.</li>
</ol>7. Bildverarbeitung und Analyse
<ol><li>Verwenden Sie native T2-gewichtete Daten, um das Gehirnvolumen zu analysieren. Verwenden Sie eine Segmentierungssoftware, um die lateralen Ventrikel manuell abzugrenzen6. Klicken Sie auf Pinselmodus und wählen Sie den quadratischen Pinselstil. Stellen Sie die Pinselgröße auf 1 ein. Klicken Sie auf das Informationsfenster "Layout" und wählen Sie die axiale Ansicht. Klicken Sie auf Zoom, um ihn anzupassen. Platzieren Sie den Cursor auf dem Bild; Verfolgen und füllen Sie den lateralen Ventrikelraum.</li>
	<li>Klicken Sie in der Symbolleiste auf Segmentierung | Volumen und Statistiken, um die segmentierten Volumes anzuzeigen.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity%3A+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Dieses IVH-Modell, das Hämoglobininjektion verwendet, ermöglicht die Untersuchung der Pathologie von IVH, die spezifisch durch Hämoglobin vermittelt wird. Für ergänzende Studien kann Hämoglobin auch leicht in vitro verabreicht werden und verwirrt nicht biochemische Assays für Proteine, die von Mikroglia / Makrophagen hergestellt werden, die im Vollblut vorhanden sind.
Die führenden Theorien der IVH-PHH umfassen die mechanische Obstruktion der Liquorzirkulation, die Störung von Zilien,...

Neugeborene IVH stammt aus der Keimmatrix, einem Ort der schnellen Zellteilung, der an die lateralen Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns angrenzt. Diese stark vaskuläre Struktur ist anfällig für hämodynamische Instabilität im Zusammenhang mit Frühgeburten. Blut wird bei der Keimmatrixblutung (GMH)-IVH in die lateralen Ventrikel freigesetzt, wenn zerbrechliche Blutgefäße innerhalb der Keimmatrix reißen. Bei IVH Grad IV kann auch ein periventrikulärer hämorrhagischer Infarkt zur Freisetzung von Blutprodukten im Gehirn beitragen. 1 Die Kombination von GMH-IVH kann PHH verursachen, insbesondere nach hochgradigen Blutungen (Grad III und IV)1. PHH kann mit der Platzierung eines ventrikuloperitonealen Shunts behandelt werden, aber die Shunt-Platzierung macht die Hirnverletzung, die durch IVH auftreten kann, nicht rückgängig. Obwohl die moderne neonatale Intensivmedizin die IVH-Raten gesenkt hat2, 3, gibt es keine spezifischen Behandlungen für die Hirnverletzung oder den Hydrozephalus, die durch IVH verursacht werden, sobald sie aufgetreten ist. Eine signifikante Einschränkung bei der Entwicklung präventiver Behandlungen für IVH-induzierte Hirnverletzungen und PHH ist das unvollständige Verständnis der IVH-Pathophysiologie.
Kürzlich wurde gezeigt, dass frühe Liquorspiegel des wichtigsten Blutabbauprodukts Hämoglobin mit der späteren Entwicklung von PHH bei Neugeborenen mit hochgradigem IVH4 assoziiert sind. Darüber hinaus sind die Liquorspiegel von Eisen-Handling-Signalweg-Proteinen - Hämoglobin, Ferritin und Bilirubin - mit der Ventrikelgröße bei neonataler IVH assoziiert. Dies zeigte sich auch in einer multizentrischen Kohorte von Säuglingen mit vorzeitiger PHH, bei der höhere ventrikuläre Liquorspiegel von Ferritin mit einer größeren Ventrikelgröße5 assoziiert waren.
In dieser Studie entwickelten wir ein klinisch relevantes Modell für IVH-induzierte Hirnverletzungen und Hydrozephalus unter Verwendung von Hämoglobininjektion in die Hirnventrikel, was die Quantifizierung von Hirnverletzungen und PHH und das Testen neuer therapeutischer Strategien ermöglicht (Abbildung 1)6, 7. Dieses IVH-Modell verwendet neonatale Rattenwelpen, die für die Dauer des Eingriffs unter Vollnarkose gestellt werden. Ein Mittellinienschnitt wird auf der Kopfhaut gemacht, und Koordinaten, die von Schädellandmarken - dem Bregma oder Lambda - abgeleitet werden, werden verwendet, um die lateralen Ventrikel für die Injektion zu erreichen. Eine langsame Injektion mit einer Infusionspumpe liefert Hämoglobin in den Ventrikel. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen, vielseitig und kann verschiedene Komponenten von IVH modellieren, die zu PHH führen.

<table><tbody><tr><td>0,3 mL Insulinspritze</td><td>BD Microfine + Insulinspritze</td><td>230-4533</td><td>0,3-0,5 mL Synthen funktionieren</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Lot Nr. K194642H -3 511</td></tr><tr><td>4,7T MRT</td><td>Agilent/Varian</td><td>4,7T/33 cm</td><td>Agilent/Varian DirectDrive 4,7-T (200 MHz) MRT-System</td></tr><tr><td>6-0 monofiles Nahtmaterial</td><td>ETHICON</td><td>667G</td><td></td></tr><tr><td>9,4T MRT</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 94/20</td><td>Wird in diesem Protokoll ohne Kryosonde verwendet</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>CCURIS Instruments</td><td>W3200-320</td><td></td></tr><tr><td>Künstlicher Liquor (aCSF)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3525</td><td>Chargen-Nr.: 72A</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>301005-00</td><td>NDC 67618-150-09</td></tr><tr><td>Carprofen (injizierbar)</td><td>Zoetis Inc.&nbsp;</td><td>PI 4019448</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>UL 612A, Z-1228-001</td></tr><tr><td>Hämoglobin</td><td>MP Biomedicals</td><td>100714</td><td>LOT NR. SR02321</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Licht für stereotaktische Insturment</td><td>Dolan-Jenner Industrien</td><td>Fiber-Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsspritzenpumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>MICRO21</td><td>Serial 184034 T08K</td></tr><tr><td>MRT-Software</td><td>Bruker BioSpin</td><td>Paravision 360 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>Airgas Gesundheitswesen</td><td>UN1072</td><td>LOT NUMMER S1432080XA02</td></tr><tr><td>Sprague Dawley Ratten</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Stammcode: 001</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument</td><td>KOPF Instruments</td><td>Modell 900LS Lazy Susan</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Applikator mit Wattespitze</td><td>Fischerbrand</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge</td><td>Covetrus</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Topisches Dreifach-Antibiotikum</td><td>Dreifach-Antibiotikum-Salbe</td><td>NDC 51672-2120-1</td><td></td></tr><tr><td>Software zur Quantifizierung des Ventrikelvolumens</td><td>ITK-SNAP</td><td>ITK-SNAP 4.0.0 beta</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung neonataler intraventrikulärer blutungen durch intraventrikuläre injektion von hämoglobin

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Die intraventrikuläre Tumorblutung (IVH) ist eine häufige Folge einer Frühgeburt und führt zu Hirnverletzungen, poshämorrhagischem Hydrozephalus (PHH) und lebenslangen neurologischen Ausfällen. Während PHH durch temporäre und permanente Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor) Diversionsverfahren (ventrikuläres Reservoir bzw. ventrikuloperitonealer Shunt) behandelt werden kann, gibt es keine pharmakologischen Strategien zur Vorbeugung oder Behandlung von IVH-induzierten Hirnverletzungen und Hydrocephalus. Tiermodelle werden benötigt, um die Pathophysiologie der IVH besser zu verstehen und pharmakologische Behandlungen zu testen. Während es existierende Modelle der neonatalen IVH gibt, sind diejenigen, die zuverlässig zu Hydrocephalus führen, oft durch die Notwendigkeit großvolumiger Injektionen eingeschränkt, was die Modellierung der Pathologie erschweren oder Variabilität im beobachteten klinischen Phänotyp einführen kann.
Neuere klinische Studien haben Hämoglobin und Ferritin mit der Verursachung einer ventrikulären Vergrößerung nach IVH in Verbindung gebracht. Hier entwickeln wir ein einfaches Tiermodell, das den klinischen Phänotyp von PHH nachahmt, indem wir kleinvolumige intraventrikuläre Injektionen des Blutabbauprodukts Hämoglobin verwenden. Neben der zuverlässigen Induktion von ventrikulärer Vergrößerung und Hydrozephalus führt dieses Modell zu Verletzungen der weißen Substanz, Entzündungen und Immunzellinfiltrationen in periventrikulären und weißen Substanzregionen. Dieser Artikel beschreibt diese klinisch relevante, einfache Methode zur Modellierung von IVH-PHH bei neonatalen Ratten mittels intraventrikulärer Injektion und stellt Methoden zur Quantifizierung der Ventrikelgröße nach der Injektion vor.

Der Erfolg der Injektion wurde radiologisch und immunhistochemisch bestätigt. Tiere, die einer Hämoglobininjektion unterzogen wurden, entwickelten eine moderate akute Ventrikulomegalie bei MRT-Beurteilung (Abbildung 2A), mit signifikant größeren lateralen Ventrikeln nach 24 h und 72 h nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu aCSF-injizierten Tieren (Abbildung 2B,C). Obwohl es 38 Tage nach der Injektion keinen signifikanten Unterschied im lateral...

Wir präsentieren ein Modell der neonatalen intraventrikulären Blutung mit Rattenwelpen, das die Pathologie beim Menschen nachahmt.

Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da wir ein klinisch relevantes Modell für IVH-induzierte Hirnverletzungen und Hydrozephalus entwickeln, wobei Hämoglobininjektion in die Ventrikel verwendet wird, was eine nachfolgende Quantifizierung des Ventrikelvolumens in der Anwendung ermöglicht, um neue therapeutische Strategien zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Pathologie von IVH ermöglicht, die spezifisch durch Hämoglobin- und Eisenweg-Blutabbauprodukte vermittelt wird. Diese Technik ist auch einfach zu bedienen und vielseitig.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Therapien für den posthämorrhagischen Hydrozephalus, da sie ein weiteres Verständnis der IVH-Pathophysiologie und die Bewertung klinisch relevanter Behandlungsstrategien zur Prävention neurologischer Folgeerkrankungen nach IVH ermöglicht. Demonstration des Verfahrens wird Sruthi Ramagiri, ein Associate Post-Doc vom Australia Laboratory, sein. Um zu beginnen, legen Sie die anästhesierte Ratte in den stereotaktischen Apparat mit der Nase im Anästhesieadapter.Sichern Sie dann den Kopf, indem Sie die nicht reißenden Ohrstäbe am äußeren Gehörgang anziehen. Um den Kopf zu reinigen, berühren Sie zuerst einen sterilen Baumwollapplikator, der in der Mitte des Kopfes mit Betadine getränkt ist, und bewegen Sie sich nach außen, um das Betadine im Kreis zu verteilen. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit einem Applikator, der mit 70% Ethanol getränkt ist.Als nächstes machen Sie mit einem Skalpell einen 0,3 Zentimeter großen Einschnitt senkrecht in der Mitte des Kopfes, um das Bregma des Schädels freizulegen. Trocknen Sie dann den Bereich mit einem Baumwollapplikator ab. Um den stereotaktischen Injektor einzurichten, ziehen Sie die zuvor vorbereitete Hämoglobinlösung in eine 0,3- oder 0,5-Milliliter-Spritze und legen Sie die Spritze in das stereotaktische Injektorsystem.Schalten Sie anschließend die stereotaktische Injektorschnittstelle ein und klicken Sie auf die Konfigurationsschaltfläche, um die Injektionslautstärke und die Rateneinstellungen einzugeben. Klicken Sie auf Volumen und stellen Sie das Volumen auf 20.000 Nanoliter ein. Klicken Sie dann auf Infusionsrate und stellen Sie die Rate auf 8.000 Nanoliter pro Minute ein.Klicken Sie auf die Schaltfläche Position zurücksetzen, um die Konfiguration zu beenden. Spülen Sie die Nadelspitze, indem Sie auf den Infusionsknopf klicken, bis eine kleine Hämoglobinperle an der Nadelspitze erscheint, und verwenden Sie dann einen Baumwollapplikator, um die Perle vorsichtig zu entfernen. Um die Tierinjektion zu beginnen, setzen Sie das Bregma auf dem stereotaktischen Injektionssystem auf Null, indem Sie die mediolateralen und anteroposterioren Positionen der Spritze anpassen.Senken Sie dann die Spritzennadel, um den Schädel an der Bregma sanft zu berühren. Nachdem Sie die Koordinaten der Wahl identifiziert haben, heben Sie die Spritzennadel einen Zentimeter über den Schädel, um die Kopfhaut zu reinigen. Stellen Sie die mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten ein.Senken Sie dann die Spritze, damit die Nadel den Schädel vorsichtig berührt, und stellen Sie die dorsoventrale Koordinate über 30 Sekunden ein. Sobald die Koordinaten eingestellt wurden, beginnen Sie mit der Einschleusung, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen auf der stereotaktischen Injektorschnittstelle klicken. Nachdem die Injektion beendet ist, lassen Sie die Nadel zwei Minuten an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung zu minimieren.Als nächstes ziehen Sie die Spritze langsam entlang der dorsoventralen Koordinate über zwei Minuten zurück, bis sich die Nadelspitze zwei Zentimeter über der Kopfhaut befindet. Drehen Sie dann den stereotaktischen Injektorarm vom Operationsfeld weg und verschließen Sie die Kopfhaut mit einer 6-O-Monofilamentnaht. Führen Sie für die MRT eine T2-gewichtete Bildgebung durch, indem Sie eine T2-gewichtete schnelle Spin-Echosequenz auswählen.Nachdem Sie die MRT-Parameter wie im Text beschrieben eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter, um die Sequenz zu starten. Für die Bildverarbeitung und die Analyse des Gehirnvolumens öffnen Sie die nativen T2-gewichteten Daten in der Segmentierungssoftware. Um die seitlichen Ventrikel manuell abzugrenzen, klicken Sie auf den Pinselmodus und wählen Sie den quadratischen Pinselstil, dann passen Sie die Pinselgröße auf eins an.Klicken Sie anschließend auf den Layoutinspektor, wählen Sie die axiale Ansicht und klicken Sie auf "Zoom". Platzieren Sie dann den Cursor auf dem Bild und zeichnen und füllen Sie den lateralen Ventrikelraum. Klicken Sie abschließend in der Symbolleiste auf Segmentierung, gefolgt von Volumen und Statistiken, um die segmentierten Volumes anzuzeigen.Tiere, die einer Hämoglobininjektion unterzogen wurden, entwickelten eine moderate Ventrikulomegalie, wenn sie mittels MRT beurteilt wurden. Mit signifikant größeren Seitenventrikeln nach 24 Stunden und 72 Stunden nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu ACSF-injizierten Tieren. Obwohl der Unterschied im lateralen ventrikulären Volumen zwischen den beiden Rattengruppen nach 38 Tagen nicht signifikant war, zeigten MRT-Scans, dass 44% der Ratten, die Hämoglobin erhielten, immer noch eine ungelöste Ventrikulomegalie aufwiesen.Darüber hinaus führte die Injektion von Hämoglobin im Vergleich zu ACSF nach 38 Tagen zu einer signifikanten Abnahme des Volumens der weißen Substanz. Hämoglobin förderte auch eine Entzündungsreaktion in vivo, wie das signifikant höhere Niveau des entzündungsfördernden Zytokins Tumornekrosefaktors alpha nach Injektion von Hämoglobin, aber nicht Kochsalzlösung oder Vollblut zeigt. Darüber hinaus zeigte die immunhistochemische Färbung des sauren Gliafibrillenproteins eine signifikant höhere Aktivierung von Astrozyten nach Hämoglobininjektion als nach ACSF-Injektion.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die richtigen Injektionskoordinaten einzustellen, um die Hämoglobinabgabe in die lateralen Ventrikel sicherzustellen. Nach diesem Verfahren können CSF-Tracer in den Liquorraum abgegeben werden, um Veränderungen der Liquorzirkulation und Effluxmuster nach IVH zu bewerten. Diese zusätzliche Methode befasst sich damit, wie der Liquorfluss in IVH PHH verändert wird.

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Die Eigenblut Injektion Modell der intrazerebralen Blutung bei Mäusen in diesem Protokoll beschriebenen Verwendungen der doppelten Einspritzung Technik, um das Risiko von Blut Reflux bis die Nadel Spur, keine Antikoagulanzien in das Pumpsystem zu minimieren, und eliminiert alle Totraum und erweiterbar Schlauch in das System.

Eigenblut Injection zu Spontane intrazerebrale Blutungen in Mäuse-Modell

Klinisch relevante Tiermodelle Hirnblutung (ICH) sind notwendig, um unser Wissen über hämorrhagischen Schlaganfall zu erweitern und neue therapeutische Strategien zu untersuchen. In dieser Studie beschreiben wir und auswerten beiden ICH Modelle einseitige Injektionen von entweder autologe Vollblut oder bakteriellen Collagenase in den Basalganglien (Corpus striatum) von Mäusen implementieren.

Modeling Hirnblutung in Mice: Injektion von Eigenblut oder bakterielle Collagenase

Dieses Video zeigt eine Methode zur Erstellung eines Rattenmodells für intraventrikuläre Blutungen bei Neugeborenen. Bei diesem Verfahren wird einem anästhesierten Rattenwelpen Hämoglobin in die Seitenkammer des Gehirns injiziert. Das Hämoglobin verursacht oxidativen Stress und setzt Häm frei, wodurch eine intraventrikuläre Blutung simuliert wird. Die daraus resultierende Schädigung des Hirngewebes, die durch reaktive Sauerstoffspezies und entzündliche Zytokine verursacht wird, führt zu einer...

Modellierung der intraventrikulären Blutung von Neugeborenen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin

Präklinische Modelle von intrazerebralen Blutungen werden verwendet, um bestimmte Aspekte der klinischen Erkrankung nachzuahmen. Auf diese Weise können Mechanismen der Verletzung und mögliche therapeutische Strategien erforscht werden. In diesem Protokoll werden zwei Modelle der intrazerebralen Blutung beschrieben, intrastriatale (Basalganglien) Injektionen von autologem Blut oder Kollagenase.

Intrastriataler Injektion von Eigenblut oder Clostridien-Kollagenase als Murine Modelle der Hirnblutung

Tiermodelle der pädiatrischen Erkrankung früh einsetzende und aggressiven Krankheitsprogression zu erleben. Klinisch relevante Therapieabgabe, junge Maus-Modellen kann technisch schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur intravenösen Injektion neugeborene Mäuse innerhalb der ersten zwei Tage nach der Geburt des Lebens.

Intravenöse Injektionen in neugeborenen Mäusen

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur intrazerebroventrikulären und intravaskulären Injektion von Viruspartikeln oder fluoreszierenden Mikrokügelchen in das Gehirn von Neugeborenen. Das Lokalisationsmuster des Virus und der Nanopartikel konnte durch mikroskopische Auswertung oder durch in situ Hybridisierung nachgewiesen werden.

Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

Wir präsentieren ein Protokoll zur Etablierung eines massiven pontinen Blutungsmodells bei einer Ratte durch doppelte Injektion von Eigenblut.

Massive Pontinenblutung durch Doppelinjektion von Eigenblut

Die Überwachung des intrakraniellen Drucks in Nagetiermodellen nichttraumatischer intraventrikulärer Blutungen ist in der aktuellen Literatur nicht üblich. Hier demonstrieren wir eine Technik zur Messung des intrakraniellen Drucks, des mittleren arteriellen Drucks und des zerebralen Perfusionsdrucks während intraventrikulärer Blutungen in einem Rattentiermodell.

Intrakranielle Drucküberwachung im nichttraumatischen intraventrikulären Blutungsmodell

Dieser Artikel zielt darauf ab, Forschern einen detaillierten und zugänglichen Leitfaden an die Hand zu geben, um ein Modell des hämorrhagischen Schocks für Säuglinge zu erstellen.

Beschreibung eines Schweine-Säuglingsmodells des volumenkontrollierten hämorrhagischen Schocks

Dieses Protokoll zielt darauf ab, einen reproduzierbaren venösen Verabreichungsweg zu demonstrieren, der bei Ratten und Mäusen während der gesamten Neugeborenenperiode angewendet werden kann. Dieses Verfahren ist wichtig für präklinische Studien an Nagetieren, die die Verabreichung von Medikamenten auf Neugeborenenstationen in erster Linie durch intravenöse Verabreichung widerspiegeln möchten.

Ein neonatales Nagetiermodell der retroorbitalen Veneninjektion

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) kann bei neugeborenen Ratten durch Kombination von Chorioamnionitis und intraventrikulärer Blutung modelliert werden. Die Kombination dieser pränatalen und postnatalen Ereignisse rekapituliert genau die klinischen Merkmale von PHHP, einschließlich Makrozephalie, Ventrikulomegalie und erhöhtem Hirndruck, über die gesamte Lebensspanne.

Modellierung des posthämorrhagischen Hydrozephalus der Frühgeburt bei Ratten

Erfahren Sie die Modellierung von intraventrikulären Blutungen durch Hämoglobin-Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Hydrozephalus und weißer Substanz-Schädigung für die Entwicklung neuer Therapien.

Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin

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