Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da wir ein klinisch relevantes Modell für IVH-induzierte Hirnverletzungen und Hydrozephalus entwickeln, wobei Hämoglobininjektion in die Ventrikel verwendet wird, was eine nachfolgende Quantifizierung des Ventrikelvolumens in der Anwendung ermöglicht, um neue therapeutische Strategien zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Pathologie von IVH ermöglicht, die spezifisch durch Hämoglobin- und Eisenweg-Blutabbauprodukte vermittelt wird. Diese Technik ist auch einfach zu bedienen und vielseitig.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Therapien für den posthämorrhagischen Hydrozephalus, da sie ein weiteres Verständnis der IVH-Pathophysiologie und die Bewertung klinisch relevanter Behandlungsstrategien zur Prävention neurologischer Folgeerkrankungen nach IVH ermöglicht. Demonstration des Verfahrens wird Sruthi Ramagiri, ein Associate Post-Doc vom Australia Laboratory, sein. Um zu beginnen, legen Sie die anästhesierte Ratte in den stereotaktischen Apparat mit der Nase im Anästhesieadapter.

Sichern Sie dann den Kopf, indem Sie die nicht reißenden Ohrstäbe am äußeren Gehörgang anziehen. Um den Kopf zu reinigen, berühren Sie zuerst einen sterilen Baumwollapplikator, der in der Mitte des Kopfes mit Betadine getränkt ist, und bewegen Sie sich nach außen, um das Betadine im Kreis zu verteilen. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit einem Applikator, der mit 70% Ethanol getränkt ist.

Als nächstes machen Sie mit einem Skalpell einen 0,3 Zentimeter großen Einschnitt senkrecht in der Mitte des Kopfes, um das Bregma des Schädels freizulegen. Trocknen Sie dann den Bereich mit einem Baumwollapplikator ab. Um den stereotaktischen Injektor einzurichten, ziehen Sie die zuvor vorbereitete Hämoglobinlösung in eine 0,3- oder 0,5-Milliliter-Spritze und legen Sie die Spritze in das stereotaktische Injektorsystem.

Schalten Sie anschließend die stereotaktische Injektorschnittstelle ein und klicken Sie auf die Konfigurationsschaltfläche, um die Injektionslautstärke und die Rateneinstellungen einzugeben. Klicken Sie auf Volumen und stellen Sie das Volumen auf 20.000 Nanoliter ein. Klicken Sie dann auf Infusionsrate und stellen Sie die Rate auf 8.000 Nanoliter pro Minute ein.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Position zurücksetzen, um die Konfiguration zu beenden. Spülen Sie die Nadelspitze, indem Sie auf den Infusionsknopf klicken, bis eine kleine Hämoglobinperle an der Nadelspitze erscheint, und verwenden Sie dann einen Baumwollapplikator, um die Perle vorsichtig zu entfernen. Um die Tierinjektion zu beginnen, setzen Sie das Bregma auf dem stereotaktischen Injektionssystem auf Null, indem Sie die mediolateralen und anteroposterioren Positionen der Spritze anpassen.

Senken Sie dann die Spritzennadel, um den Schädel an der Bregma sanft zu berühren. Nachdem Sie die Koordinaten der Wahl identifiziert haben, heben Sie die Spritzennadel einen Zentimeter über den Schädel, um die Kopfhaut zu reinigen. Stellen Sie die mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten ein.

Senken Sie dann die Spritze, damit die Nadel den Schädel vorsichtig berührt, und stellen Sie die dorsoventrale Koordinate über 30 Sekunden ein. Sobald die Koordinaten eingestellt wurden, beginnen Sie mit der Einschleusung, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen auf der stereotaktischen Injektorschnittstelle klicken. Nachdem die Injektion beendet ist, lassen Sie die Nadel zwei Minuten an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung zu minimieren.

Als nächstes ziehen Sie die Spritze langsam entlang der dorsoventralen Koordinate über zwei Minuten zurück, bis sich die Nadelspitze zwei Zentimeter über der Kopfhaut befindet. Drehen Sie dann den stereotaktischen Injektorarm vom Operationsfeld weg und verschließen Sie die Kopfhaut mit einer 6-O-Monofilamentnaht. Führen Sie für die MRT eine T2-gewichtete Bildgebung durch, indem Sie eine T2-gewichtete schnelle Spin-Echosequenz auswählen.

Nachdem Sie die MRT-Parameter wie im Text beschrieben eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter, um die Sequenz zu starten. Für die Bildverarbeitung und die Analyse des Gehirnvolumens öffnen Sie die nativen T2-gewichteten Daten in der Segmentierungssoftware. Um die seitlichen Ventrikel manuell abzugrenzen, klicken Sie auf den Pinselmodus und wählen Sie den quadratischen Pinselstil, dann passen Sie die Pinselgröße auf eins an.

Klicken Sie anschließend auf den Layoutinspektor, wählen Sie die axiale Ansicht und klicken Sie auf "Zoom". Platzieren Sie dann den Cursor auf dem Bild und zeichnen und füllen Sie den lateralen Ventrikelraum. Klicken Sie abschließend in der Symbolleiste auf Segmentierung, gefolgt von Volumen und Statistiken, um die segmentierten Volumes anzuzeigen.

Tiere, die einer Hämoglobininjektion unterzogen wurden, entwickelten eine moderate Ventrikulomegalie, wenn sie mittels MRT beurteilt wurden. Mit signifikant größeren Seitenventrikeln nach 24 Stunden und 72 Stunden nach Hämoglobininjektion im Vergleich zu ACSF-injizierten Tieren. Obwohl der Unterschied im lateralen ventrikulären Volumen zwischen den beiden Rattengruppen nach 38 Tagen nicht signifikant war, zeigten MRT-Scans, dass 44% der Ratten, die Hämoglobin erhielten, immer noch eine ungelöste Ventrikulomegalie aufwiesen.

Darüber hinaus führte die Injektion von Hämoglobin im Vergleich zu ACSF nach 38 Tagen zu einer signifikanten Abnahme des Volumens der weißen Substanz. Hämoglobin förderte auch eine Entzündungsreaktion in vivo, wie das signifikant höhere Niveau des entzündungsfördernden Zytokins Tumornekrosefaktors alpha nach Injektion von Hämoglobin, aber nicht Kochsalzlösung oder Vollblut zeigt. Darüber hinaus zeigte die immunhistochemische Färbung des sauren Gliafibrillenproteins eine signifikant höhere Aktivierung von Astrozyten nach Hämoglobininjektion als nach ACSF-Injektion.

Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die richtigen Injektionskoordinaten einzustellen, um die Hämoglobinabgabe in die lateralen Ventrikel sicherzustellen. Nach diesem Verfahren können CSF-Tracer in den Liquorraum abgegeben werden, um Veränderungen der Liquorzirkulation und Effluxmuster nach IVH zu bewerten. Diese zusätzliche Methode befasst sich damit, wie der Liquorfluss in IVH PHH verändert wird.