Name: Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Bildgebung und stereologische Analyse.

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Diese Arbeit wurde vom Schwedischen Olympischen Komitee unterstützt.

Das vorliegende Protokoll mit humanen biopsierten Skelettmuskelproben wurde von den Regionalkomitees für Gesundheitsforschungsethik für Süddänemark genehmigt (S-20170198). Muskelbiopsien wurden durch einen Schnitt in der Haut aus dem Musculus vastus lateralis unter Verwendung einer Bergström-Nadel mit Absaugung erhalten, nachdem die Lokalanästhesie subkutan verabreicht wurde (1-3 ml Lidocain 2% pro Einschnitt). Wenn isolierte ganze Rattenmuskeln verwendet wurden, wurden die Tiere durch Zervixdislokation geopfert, bevor die Muskelbiopsien gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission am Universitätskrankenhaus Odense, Dänemark, erhalten wurden.
1. Primäre Fixierung, Nachfixierung, Einbettung, Schnitt und Kontrastierung
<ol><li>1,6 ml primäre Fixierlösung (2,5% Glutaraldehyd in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3)) in einem 2 ml Mikrozentrifugationsröhrchen herstellen. Lagern Sie es bei 5 ° C für maximal 14 Tage.</li>
	<li>Von der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel isolieren Sie eine kleine Probe, die einen maximalen Durchmesser von 1 mm in jede Richtung hat und in Längsfaserrichtung etwas länger ist als Querschnitt (zur Orientierung).</li>
	<li>Legen Sie die Probe in das Röhrchen, das die kalte primäre Fixierlösung enthält. Lagern Sie es bei 5 °C für 24 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe viermal (15 Minuten zwischen jeder Wäsche) in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3). Entfernen Sie mit Transferpipetten den verwendeten Puffer aus dem Rohr, so dass die Probe unberührt bleibt, und fügen Sie anschließend den frischen Puffer hinzu. HINWEIS: Nach der Endwäsche kann die Probe mehrere Monate im 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei 5 °C gelagert werden11. Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Postfix mit 1% Osmiumtetroxid (OsO4) und 1,5% Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3) für 120 min bei 4 °C. HINWEIS: Die Verwendung von 1,5% Kaliumferrocyanid (K4Fe (CN) 6) ist für einen optimalen Kontrast von Glykogenpartikeln unerlässlich11,12,13.</li>
	<li>Zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur (RT) abspülen.</li>
	<li>Dehydrieren Sie durch Eintauchen in eine abgestufte Reihe von Alkohol (Ethanol) bei RT mit den folgenden Konzentrationen: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) und 100% (10 min). HINWEIS: In jedem Schritt wird die Probe in Ethanol getaucht, das anschließend nur teilweise entfernt wird, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Schließlich wird das übrig gebliebene Ethanol verworfen.</li>
	<li>Infiltrieren Sie mit abgestuften Gemischen aus Propylenoxid und Epossidic Harz bei RT unter Verwendung der folgenden Volumenverhältnisse (Propylenoxid/Epossidisches Harz): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (über Nacht). Am nächsten Tag betten Sie Proben in 100% frisches epossidisches Harz in Formen ein und polymerisieren bei 60 ° C für 48 h. HINWEIS: Diese abgestufte Methode entspricht den vorherigen Protokollen11,12. Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Schneiden Sie ultradünne (60-70 nm) Abschnitte von längsorientierten Fasern und sammeln Sie sie wie folgt auf Einloch-Kupfergittern.<ol>
<li>Montieren Sie den Block einer Probe auf dem Ultramikrotomhalter.</li>
		<li>Schneiden Sie den Block auf der Oberfläche mit einer Rasierklinge ab, um das Niveau des Gewebes zu erreichen.</li>
		<li>Montieren Sie ein Diamantmesser (Ultracut 45) vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus.</li>
		<li>Erzeugen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen (1 μm) Abschnitt, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen. Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau zur Beobachtung mit Lichtmikroskopie.</li>
		<li>Schneiden Sie den Block weiter zu, um den interessierenden Bereich zu reduzieren, um richtige ultradünne Abschnitte zu erhalten.</li>
		<li>Ultradünne (60-70 nm) Abschnitte mit einem zweiten Diamantmesser (Ultracut 45) schneiden.</li>
		<li>Sammeln Sie 1-2 Abschnitte auf Einloch-Kupfergittern mit einem Perfect Loop. HINWEIS: Ein Einloch-Kupfergitter hat ein einzelnes Loch in der Mitte mit Formvar-Stützmembran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrastieren Sie Abschnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat, indem Sie die obigen Gitter 20 min in Uranylacetatlösung (0,5% in doppelt destilliertem Wasser) und dann 15 min in Bleicitratlösung (1% in doppelt destilliertem Wasser) tauchen. Waschen Sie die Gitter in doppelt destilliertem Wasser zwischen und nach den beiden Flecken. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>2. Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie das Transmissionselektronenmikroskop (betrieben mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV), den Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein. Nehmen Sie digitale Bilder mit einer digitalen Slow-Scan 2 k x 2 k CCD-Kamera und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf.</li>
	<li>Fügen Sie das Raster mit mehreren Abschnitten in die Mikroskopstufe ein.</li>
	<li>Sieb das Gitter zunächst bei geringer Vergrößerung (z. B. x100), um die Qualität der Abschnitte (d. h. Löcher in der Stützmembran, Ablagerungen usw.) zu bestimmen und die Abschnitte mit der besten Qualität auszuwählen. Bestimmen Sie bei geringer Vergrößerung die Richtung der Muskelfasern.</li>
	<li>Als nächstes erhöhen Sie die Vergrößerung mit dem Balken, der auf einer peripheren Faser im Abschnitt zentriert ist. Fokussieren Sie das Bild bei einer Vergrößerung über 30 k, um genügend feine Details im Bild zu gewährleisten, die von einer schnellen Echtzeit-Fourier-Transformation geleitet werden, falls verfügbar. Nehmen Sie schließlich Bilder mit 1 s Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung auf.</li>
	<li>Erfassen Sie insgesamt 24 Bilder einer zufällig ausgewählten Faser, d. h. 12 Bilder des myofibrillären Raums und 12 Bilder des subsarkolämischen Raums, bei einer Vergrößerung zwischen 10 k und 40 k. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer randomisierten, aber systematischen Reihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten (Abbildung 1A). HINWEIS: Die optimale Vergrößerung hängt von der verfügbaren Kameraauflösung und der Größe der Mikroaufnahmen ab. Ziel ist es, eine endgültige Auflösung zu erreichen, bei der Glykogenpartikeldurchmesser innerhalb von 1 nm-Schritten gemessen werden können, und eine Gesamtfläche der myofibrillären Region von mindestens 70 μm2 und eine Gesamtlänge der Faser von mindestens 25 μm, verteilt auf 12 Bilder des myofibrillären Raumes und 12 Bilder des subsarkolämischen Raums pro Faser, beziehungsweise. Die 24 Bilder pro Faser ergeben höchstwahrscheinlich eine Genauigkeit (Fehlerkoeffizient) des volumetrischen Gehalts der verschiedenen Glykogenpools zwischen 0,1 und 0,2 in einzelnen Fasern aus der Skelettmuskulatur von Menschen, Ratten und Mäusen20,21,24 (Abbildung 2E).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5, bis insgesamt 6-10 Fasern abgebildet sind. Schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Abschnitte (mindestens 150 μm voneinander entfernt, um eine Überlappung bereits abgebildeter Fasern zu vermeiden) und wiederholen Sie die Schritte 1.9-2.5.</li>
</ol>3. Bildanalysen
<ol><li>Importieren Sie Bilder in ImageJ, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken.</li>
	<li>Stellen Sie die globale Skalierung so ein, dass sie der ursprünglichen Größe des Bildes entspricht, indem Sie auf Analyze > Set Scale klicken.</li>
	<li>Vergrößern Sie 100%, indem Sie auf Bild > Zoom > In klicken.</li>
	<li>Messen Sie die Dicke einer Z-Disc pro Bild des myofibrillären Raums (12 pro Faser) mit dem Werkzeug "Gerade Linie " im Menü "Werkzeuge" (Abbildung 1D). Berechnen Sie die durchschnittliche Z-Disc-Dicke jeder der 6-10 Fasern.</li>
	<li>Definieren Sie 2-3 Fasern mit der dicksten durchschnittlichen Z-Disc als Typ-1-Fasern und 2-3 Fasern mit der dünnsten durchschnittlichen Z-Disc als Typ-2-Fasern. Lassen Sie die Zwischenfasern 2-4 für weitere Analysen außer Acht (Abbildung 1E). HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für jede der 4-6 Fasern aus der Probe wiederholt. Die Glykogenvolumenanteile werden durch Punktzählung geschätzt, wie an anderer Stelle beschrieben25,26. Die Größe der Gitter wird gewählt, um eine zufriedenstellend hohe Genauigkeit der Schätzungen zu erhalten. Dies wird oft durch das Erreichen von 250 Treffern erreicht, was dann die Gesamtzahl der benötigten Punkte und damit die Fläche pro Punkt bestimmt.</li>
	<li>Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie , um die Länge des äußersten Myofibrils zu messen, das direkt unter der subsarkolämischen Region sichtbar ist (Abbildung 2A). HINWEIS: Diese Länge wird verwendet, um subsarkolemmales Glykogen pro Oberfläche zu exprimieren (d. h. Länge des äußersten Myofigrils multipliziert mit der Dicke des Abschnitts (60 nm); siehe Schritt 4.5). Daher wird nur die subsarkolemmale Region, die durch diese Länge dargestellt wird, in die Analyse einbezogen.</li>
	<li>Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 32.400 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolämischen Bildern, wobei ein Kreuz auf das subsarkolämale Glykogen trifft (Abbildung 2A). Ein Treffer ist definiert als ein Glykogenteilchen, das in der oberen rechten Ecke eines Kreuzes vorhanden ist.</li>
	<li>Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 160.000 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft (Abbildung 2B).</li>
	<li>Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 3.600 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2C).</li>
	<li>Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 32.400 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2D).</li>
	<li>Messen Sie mit dem Werkzeug "Gerade Linie " den Durchmesser von fünf zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um durchschnittlich 60 Partikel pro Pool und Faser zu erhalten. HINWEIS: Der Durchschnitt von 60 Partikeln deckt weitgehend die Variation innerhalb der Faser ab (Abbildung 2F).</li>
</ol>4. Berechnungen
<ol><li>Berechnen Sie den scheinbaren Flächenanteil (AA) des intramyofibrillären Raums pro myofibrillärem Raum als Summe aller Treffer dividiert durch die Summe aller Punkte aus den 12 Bildern (aus Schritt 3.8).</li>
	<li>Berechnen Sie den scheinbaren Flächenanteil von intramyofibrillärem Glykogen pro myofibrillärer Fläche, intermyofibrillärem Glykogen pro myofibrillärem Bereich und subsarkolemmalem Glykogen pro Bildfläche als Summe aller Treffer dividiert durch die Summe aller Punkte aus den 12 Bildern (aus den Schritten 3.7, 3.9 und 3.10).</li>
	<li>Berechnen Sie den Volumenanteil (VV) von intramyofibrillärem, intermyofibrillärem und subsarkolemmalem Glykogen als scheinbare Flächenfraktion (AA) abzüglich des Produkts der Oberflächendichte (SV) mit Schnittdicke (t), wobei die Oberflächendichte die numerische Dichte der Partikel multipliziert mit der mittleren Partikeloberfläche ist: Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t wo Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H)) t = 0,06 μm H = mittlerer Durchmesser der Partikel (μm) HINWEIS: Der Volumenanteil ist kleiner als der scheinbare Flächenanteil aufgrund des Beitrags von Kappen aus Partikeln mit ihrer Mitte außerhalb der Scheibe25.</li>
	<li>Um intramyofibrilläres Glykogen pro intramyofibrillärem Raum zu exprimieren, dividieren Sie die Flächenfraktion des intramyofibrillären Glykogens (Schritt 4.2) durch die Flächenfraktion des intramyofibrillären Raums (Schritt 4.1). Das intermyofibrilläre Glykogen wird pro myofibrillärem Raum exprimiert, wie im vorherigen Schritt (Schritt 4.3) berechnet.</li>
	<li>Um subsarkolämisches Glykogen pro Oberfläche der Faser (VS) (äußeres Myofibrill) zu exprimieren, wandeln Sie den Volumenanteil des Glykogens in eine absolute Menge um, indem Sie mit dem Volumen des Bildes (Produkt aus Flächen- und Schnittdicke) multiplizieren und durch das Produkt der mittleren verfügbaren Länge (aus Schritt 3.6) mit der Abschnittsdicke (t) dividieren.</li>
	<li>Schätzen Sie den gesamten volumetrischen Glykogengehalt anhand der Werte aus den Schritten 4.1, 4.4 und 4.5 wie folgt: Myofibrilläres Glykogen = Intermyofibrilläres Glykogen + (intramyofibrilläres Glykogen · Flächenanteil des intramyofibrillären Raums) Unter der Annahme eines durchschnittlichen Faserradius von 40 μm27 beträgt das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche 20:1, so dass das Gesamtglykogen wie folgt lautet: Gesamtglykogen (VV) = Myofibrilläres Glykogen + (subsarkolemmales Glykogen (VS) / 20) HINWEIS: Das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche von 20: 1 kann von Faser zu Faser variieren, abhängig von der tatsächlichen Fasergröße und der Größe der subsarkolemmalen Region. Dies wird mit dem vorliegenden Protokoll nicht berücksichtigt.</li>
	<li>Daraus ergibt sich der relative Beitrag jedes Pools als Bruchteile des Gesamtglykogens: Intermyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen = Intermyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen Intramyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen = (Intramyofibrilläres Glykogen · Flächenanteil des intramyofibrillären Raumes) / Gesamtglykogen Subsarkolämisches Glykogen / Gesamtglykogen = Subsarkolämmales Glykogen / 20 / Gesamtglykogen</li>
	<li>Berechnen Sie für jeden Glykogenpool den Fehlerkoeffizienten (CE), der die Unsicherheit der Glykogenschätzung auf Faserebene ausdrückt, basierend auf der Anzahl der Bilder (n), der Gesamtzahl der Kreuze in jedem Bild (x) und der Anzahl der Kreuze, die in dem entsprechenden Pool in jedem Bild (y) auf Glykogen treffen, wie folgt28: CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑j-1
</li>
</ol>

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Der kritische Schritt der Methode ist die Verwendung von reduziertem Osmium durch Kaliumferrocyanid während der Postfixation. Die Selektivität dieses modifizierten Fixiermittels für den Glykogennachweis kann nicht vollständig durch die Chemie erklärt werden, sondern umfasst auch experimentelle Ergebnisse, die zeigen, dass solche Partikel in Geweben, von denen bekannt ist, dass sie frei von Glykogen sind, oder im extrazellulären Raum nicht nachgewiesen wurden11.
Kritisch...

Glykogenpartikel bestehen aus verzweigten Polymeren der Glukose und verschiedenen assoziierten Proteinen1 und stellen einen wichtigen Brennstoff bei hohen Stoffwechselanforderungen dar2. Obwohl nicht allgemein anerkannt, stellen Glykogenpartikel auch einen lokalen Brennstoff dar, bei dem einige subzelluläre Prozesse trotz der Verfügbarkeit anderer und langlebigerer Brennstoffe wie Plasmaglukose und Fettsäuren bevorzugt Glykogen verwenden3,4.
Die Bedeutung der Speicherung von Glykogen als subzellulärer spezifischer lokalisierter Brennstoff wurde in mehreren Übersichtsarbeiten5,6 diskutiert, die hauptsächlich auf einigen der frühesten Dokumentationen der subzellulären Verteilung von Glykogen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)7,8 basieren. Die ersten Studien verwendeten verschiedene Protokolle, um den Kontrast von Glykogen von histochemischen Färbetechniken zu negativen und positiven Färbungen zu erhöhen9,10. Eine wichtige methodische Weiterentwicklung war das verfeinerte Nachfixationsprotokoll mit dem kaliumferrocyanidreduzierten Osmium11,12,13,14, das den Kontrast von Glykogenpartikeln signifikant verbesserte. Dieses verfeinerte Protokoll wurde bei einigen der Pionierarbeiten zur belastungsinduzierten Glykogenabbau15 nicht verwendet, sondern von Graham und Kollegen wieder eingeführt16,17.
Basierend auf den 2-dimensionalen Bildern wird die subzelluläre Verteilung von Glykogen am häufigsten als Glykogenpartikel beschrieben, die sich in drei Pools befinden: subsarkolemmal (direkt unter der Oberflächenmembran), intermyofibrillar (zwischen den Myofibrillen) oder intramyofibrillar (innerhalb der Myofibrillen). Glykogenpartikel könnten jedoch auch als assoziiert mit beispielsweise sarkoplasmatischem Retikulum7 oder Kernen18 beschrieben werden. Neben der subzellulären Verteilung besteht der Vorteil des TEM-geschätzten Glykogengehalts auch darin, dass die Quantifizierung auf Einzelfaserebene durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht die Untersuchung der Faser-zu-Faser-Variabilität und korrelative Analysen mit Fasertypen und zellulären Komponenten wie Mitochondrien und Lipidtröpfchen.
Hier wird das Protokoll für den TEM-geschätzten fasertypspezifischen volumetrischen Gehalt der drei gemeinsamen subzellulären Glykogenpools (subsarkolemmal, intermyofibrillär und intramyofibrillär) in Skelettmuskelfasern beschrieben. Die Methode wurde auf die Skelettmuskulatur von Menschen19, Ratten20 und Mäusen21 angewendet; sowie Vögel und Fische22; und Kardiomyozyten von Ratten23.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propylenoxid</td><td>Merck</td><td>75-56-9</td><td></td></tr><tr><td>Embedding 812 Harz Medium Kit</td><td>Taab</td><td>T031</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung 25%</td><td>Merck</td><td>1.04239.0250</td><td></td></tr><tr><td>ARTIKEL</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging Software</td></tr><tr><td>Leica EM AC20</td><td>Leica</td><td></td><td>Automatisches Kontrastsystem</td></tr><tr><td>OSIS Veleta Digitalkamera</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 4%ige Lösung</td><td>Polysciences</td><td>0972A</td><td></td></tr><tr><td>Philips CM 100 Transmission EM</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989-245G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylatpuffer 0,2 M ph 7,4</td><td>Ampliqon.com</td><td>AMPQ40989.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom Leica UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrostain Bleicitrat 3%, stabilisierte Lösung</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat-Dihydrat</td><td>Polysciences</td><td>6159-44-0</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der subzellulären glykogenverteilung in skelettmuskelfasern mittels transmissionselektronenmikroskopie

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können hochauflösende Bilder von fixierten Proben mit einzelnen Muskelfasern gewonnen werden. Dies ermöglicht die Quantifizierung ultrastruktureller Aspekte wie Volumenanteile, Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse, Morphometrie und physikalische Kontaktstellen verschiedener subzellulärer Strukturen. In den 1970er Jahren wurde ein Protokoll zur verstärkten Färbung von Glykogen in Zellen entwickelt, das den Weg für eine Reihe von Studien zur subzellulären Lokalisation von Glykogen und Glykogenpartikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskopie ebnete. Während die meisten Analysen Glykogen so interpretieren, als ob es homogen in den Muskelfasern verteilt wäre und nur einen einzigen Wert (z. B. eine durchschnittliche Konzentration) liefert, hat die Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt, dass Glykogen als diskrete Glykogenpartikel gespeichert ist, die sich in verschiedenen subzellulären Kompartimenten befinden. Hier wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur quantitativen Bestimmung des Volumenanteils und des Partikeldurchmessers von Glykogen in den verschiedenen subzellulären Kompartimenten einzelner Skelettmuskelfasern beschrieben. Überlegungen zum 1) Sammeln und Färben von Gewebeproben, 2) Durchführen von Bildanalysen und Datenverarbeitung, 3) Bewerten der Genauigkeit von Schätzungen, 4) Unterscheiden zwischen Muskelfasertypen und 5) methodische Fallstricke und Einschränkungen sind enthalten.

Unter Verwendung dieses Protokolls erscheinen Glykogenpartikel schwarz und deutlich (Abbildungen 1 und Abbildung 2). Die Normalwerte von Glykogen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Daten basieren auf insgesamt 362 Ballaststoffen von 41 gesunden jungen Männern, die in verschiedenen früheren Studien gesammelt wurden19,24,29,30,31.</s...

Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Die Messung des Glykogengehalts in einzelnen Zellen und subzellulären Organisationen ist wichtig, da sich einzelne Zellen in den meisten Zelltypen unterschiedlich an sich ändernde physiologische Bedingungen und Krankheiten anpassen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist also die sehr hohe Auflösung im Transmissionselektronenmikroskop. Dies verbessert die Möglichkeit, lokalisierte subzelluläre Strukturen zu haben, und auch in diesem Inhalt in dieser Technik hier ist es wichtig, dass die Glykogenfärbung antikörperfrei ist.Wir haben also keine Spezifität, über die wir uns Sorgen machen müssen. Um einen besseren Kontrast auf Glykogen zu erhalten, verwenden Sie einfach Kaliumferrocyanid 1,5% anstelle von Kaliumferrocyanid. Bereiten Sie 1,6 Milliliter der primären fixativen Lösung vor, indem Sie 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer in einem Mikrozentrierungsröhrchen mit zwei Millilitern hinzufügen.Lagern Sie es bei fünf Grad Celsius für maximal 14 Tage. Isolieren Sie eine kleine Probe von der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel, die einen maximalen Durchmesser von einem Millimeter in jede Richtung hat und längs länger ist als querschnittlich. Legen Sie die Probe in das Röhrchen, das die kalte primäre Fixierlösung enthält.Lagern Sie es bei fünf Grad Celsius für 24 Stunden. Dann waschen Sie die Probe viermal in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie mit Transferpipetten den verwendeten Puffer aus dem Rohr, lassen Sie die Probe unberührt und fügen Sie den frischen Puffer hinzu.Postfixieren Sie die Probe mit 1% Osmiumtetroxid und 1,5% Kaliumferrocyanid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für 120 Minuten bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Probe zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur ab. Dehydrieren Sie, indem Sie bei Raumtemperatur in eine abgestufte Reihe von Ethanol eintauchen.Infiltrieren Sie die Probe mit Propylenoxid und epossidischen Harzmischungen bei Raumtemperatur unter Verwendung der genannten Volumenverhältnisse. Am nächsten Tag betten Sie Proben in 100% frisches epossidisches Harz in Formen ein und polymerisieren Sie bei 60 Grad Celsius für 48 Stunden. Montieren Sie den Block einer Probe auf dem Ultramikrotomhalter.Schneiden Sie den Block auf der Oberfläche mit einer Rasierklinge ab, um die Gewebeebene zu erreichen. Montieren Sie ein Diamantmesser vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus. Erzeugen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen Schnitt von einem Mikrometer Dicke, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen.Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau zur Beobachtung mit Lichtmikroskopie. Schneiden Sie dann den Block weiter ab, um die interessierende Fläche zu reduzieren, um die richtigen ultradünnen Abschnitte zu erhalten. Ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 60 bis 70 Nanometern mit einem zweiten Diamantmesser schneiden.Sammeln Sie ein bis zwei Abschnitte auf einem ganzen Kupfergitter mit einer perfekten Schleife. Zum Kontrast der Abschnitte tauchen Sie die Gitter 20 Minuten lang in Uranylacetatlösung und waschen Sie die Gitter in doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Gitter dann 15 Minuten lang in Bleicitrat und waschen Sie die Gitter erneut in doppelt destilliertem Wasser. Schalten Sie den Transmissionselektronenmikroskop-Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein, zeichnen Sie digitale Bilder mit einer digitalen Slow Scan CCD-Kamera und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf.Nachdem Sie das Gitter mit mehreren Abschnitten in die Mikroskopstufe eingefügt haben, screenen Sie das Gitter zunächst bei geringer Vergrößerung, um die Abschnitte mit der besten Qualität auszuwählen und die Richtung der Muskelfasern zu bestimmen. Nächster Fokus, das Bild bei Vergrößerung über 30.000 mit dem Strahl zentriert auf einer peripheren Faser im Schnitt und Aufnahmebilder mit einer Sekunde Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer randomisierten Bot-Systemreihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten, und wiederholen Sie die Bildgebung, bis sechs bis 10 Fasern abgebildet sind.Importieren Sie Bilder in Bild J, indem Sie auf Datei klicken und anschließend öffnen. Stellen Sie die globale Skalierung so ein, dass sie der ursprünglichen Größe des Bildes entspricht, indem Sie auf Analysieren und dann auf Skalierung setzen. Um 100% zu vergrößern, klicken Sie auf das Bild, gehen Sie zu Zoom und klicken Sie auf in.Messen Sie die Dicke einer Z-Scheibe pro Bild des myofibrillären Raums mit dem geraden Linienwerkzeug aus dem Menü "Werkzeuge" und berechnen Sie die durchschnittliche Z-Scheibendicke jeder der sechs bis 10 Fasern. Verwenden Sie das segmentierte Linienwerkzeug, um die Länge des äußersten Myofibrils zu messen, das direkt unter der subsarkolemmalen Region sichtbar ist. Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Werkzeuge und dann Raster aus.Stellen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadrat-Nanometer ein. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolämischen Bildern, in denen ein Kreuz auf das subsarkolämale Glykogen trifft. Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge aus, gefolgt von einem Raster und legen Sie die Fläche pro Punkt auf 160.000 Quadrat-Nanometer fest.Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft. Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Werkzeuge und dann Raster aus. Stellen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 3.600 Quadrat-Nanometer ein.Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft. Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge aus, gefolgt von Raster und legen Sie die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadrat-Nanometer fest. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft.Verwenden Sie das 32, 400 Quadrat-Nanometer-Gitter, um die Glykogenpartikel zufällig auszuwählen, beginnen Sie mit dem oberen linken Quadrat und bewegen Sie sich bei Bedarf nach links. Messen Sie mit dem Straight-Line-Tool den Durchmesser von fünf zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um durchschnittlich 60 Partikel pro Pool und Faser zu erhalten. Diese Abbildung zeigt die Normalwerte der drei Glykogenpools.Es kann beobachtet werden, dass intermyofibrilläre Glykogenwerte nahezu normal verteilt sind, während sowohl intramyofibrilläres als auch subsarkolämales Glykogen eine verzerrte Verteilung aufweisen, wobei Fasern manchmal eine übermäßige Menge an Glykogen aufweisen. Unter all den Schritten ist es sehr wichtig, Kaliumferrocyanid zu verwenden. Die Analyse von Glykogen kann mit der Analyse von Mitochondrien- und Lipidtröpfchen kombiniert werden, was unser Verständnis verbessern kann, wie andere wichtige Stoffwechselkomponenten mit Glykogen und Muskelgesundheit korrelieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video demonstrieren wir die Probenvorbereitung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und dessen Färbung für die Transmissionselektronenmikroskopie, um die subzelluläre Glykogenverteilung zu visualisieren und zu quantifizieren.

Transmissionselektronenmikroskopie zur Quantifizierung der Glykogenverteilung in der menschlichen Skelettmuskulatur

Wir beschreiben hier eine genaue, reproduzierbare und bequem biochemische Methode zur Titration von Glykogen in vitro. Diese Technik nutzt die Abcam Glykogen-Assay-Kit und ist auf aufeinander folgende Hydrolyse von Glykogen durch Fluoreszenz Glukose und Glukose-Titration.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Die periodische Säure-Schiff-Färbung ist eine Technik, die den Polysaccharidgehalt von Geweben sichtbar macht. Dieser Artikel zeigt das periodische Säure-Schiff-Färbeprotokoll, das für die Anwendung auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes angepasst ist, die aus menschlichem venösem Blut gereinigt wurden. Solche Proben werden für Lymphozyten und andere weiße Blutkörperchen des Immunsystems angereichert.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

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Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.

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Im vorliegenden Protokoll wird die Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) -Technik verwendet, um die Kettenlängenverteilung (CLD) und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen zu bestimmen.

Bestimmung der Glucankettenlängenverteilung von Glykogen mit der Fluorophor-gestützten Kohlenhydratelektrophorese-Methode (FACE)

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Der tierische Gewebeassay nutzt die Detektion von Kernszintillation, um die enzymatische Aktivität der Glykogensynthase zu bestimmen, indem der Einbau von radioaktiv markierter Glukose in Glykogen gemessen wird.

Radiochemische Bewertung der Aktivität von Glykogensynthase-Enzymen in tierischem Gewebe

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Lernen Sie die Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Bildgebung und stereologische Analyse.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

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