Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie
7. Februar 2022
Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.
Die Messung des Glykogengehalts in einzelnen Zellen und subzellulären Organisationen ist wichtig, da sich einzelne Zellen in den meisten Zelltypen unterschiedlich an sich ändernde physiologische Bedingungen und Krankheiten anpassen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist also die sehr hohe Auflösung im Transmissionselektronenmikroskop. Dies verbessert die Möglichkeit, lokalisierte subzelluläre Strukturen zu haben, und auch in diesem Inhalt in dieser Technik hier ist es wichtig, dass die Glykogenfärbung antikörperfrei ist.
Wir haben also keine Spezifität, über die wir uns Sorgen machen müssen. Um einen besseren Kontrast auf Glykogen zu erhalten, verwenden Sie einfach Kaliumferrocyanid 1,5% anstelle von Kaliumferrocyanid. Bereiten Sie 1,6 Milliliter der primären fixativen Lösung vor, indem Sie 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer in einem Mikrozentrierungsröhrchen mit zwei Millilitern hinzufügen.
Lagern Sie es bei fünf Grad Celsius für maximal 14 Tage. Isolieren Sie eine kleine Probe von der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel, die einen maximalen Durchmesser von einem Millimeter in jede Richtung hat und längs länger ist als querschnittlich. Legen Sie die Probe in das Röhrchen, das die kalte primäre Fixierlösung enthält.
Lagern Sie es bei fünf Grad Celsius für 24 Stunden. Dann waschen Sie die Probe viermal in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie mit Transferpipetten den verwendeten Puffer aus dem Rohr, lassen Sie die Probe unberührt und fügen Sie den frischen Puffer hinzu.
Postfixieren Sie die Probe mit 1% Osmiumtetroxid und 1,5% Kaliumferrocyanid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für 120 Minuten bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Probe zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur ab. Dehydrieren Sie, indem Sie bei Raumtemperatur in eine abgestufte Reihe von Ethanol eintauchen.
Infiltrieren Sie die Probe mit Propylenoxid und epossidischen Harzmischungen bei Raumtemperatur unter Verwendung der genannten Volumenverhältnisse. Am nächsten Tag betten Sie Proben in 100% frisches epossidisches Harz in Formen ein und polymerisieren Sie bei 60 Grad Celsius für 48 Stunden. Montieren Sie den Block einer Probe auf dem Ultramikrotomhalter.
Schneiden Sie den Block auf der Oberfläche mit einer Rasierklinge ab, um die Gewebeebene zu erreichen. Montieren Sie ein Diamantmesser vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus. Erzeugen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen Schnitt von einem Mikrometer Dicke, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen.
Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau zur Beobachtung mit Lichtmikroskopie. Schneiden Sie dann den Block weiter ab, um die interessierende Fläche zu reduzieren, um die richtigen ultradünnen Abschnitte zu erhalten. Ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 60 bis 70 Nanometern mit einem zweiten Diamantmesser schneiden.
Sammeln Sie ein bis zwei Abschnitte auf einem ganzen Kupfergitter mit einer perfekten Schleife. Zum Kontrast der Abschnitte tauchen Sie die Gitter 20 Minuten lang in Uranylacetatlösung und waschen Sie die Gitter in doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Gitter dann 15 Minuten lang in Bleicitrat und waschen Sie die Gitter erneut in doppelt destilliertem Wasser. Schalten Sie den Transmissionselektronenmikroskop-Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein, zeichnen Sie digitale Bilder mit einer digitalen Slow Scan CCD-Kamera und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf.
Nachdem Sie das Gitter mit mehreren Abschnitten in die Mikroskopstufe eingefügt haben, screenen Sie das Gitter zunächst bei geringer Vergrößerung, um die Abschnitte mit der besten Qualität auszuwählen und die Richtung der Muskelfasern zu bestimmen. Nächster Fokus, das Bild bei Vergrößerung über 30.000 mit dem Strahl zentriert auf einer peripheren Faser im Schnitt und Aufnahmebilder mit einer Sekunde Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer randomisierten Bot-Systemreihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten, und wiederholen Sie die Bildgebung, bis sechs bis 10 Fasern abgebildet sind.
Importieren Sie Bilder in Bild J, indem Sie auf Datei klicken und anschließend öffnen. Stellen Sie die globale Skalierung so ein, dass sie der ursprünglichen Größe des Bildes entspricht, indem Sie auf Analysieren und dann auf Skalierung setzen. Um 100% zu vergrößern, klicken Sie auf das Bild, gehen Sie zu Zoom und klicken Sie auf in.
Messen Sie die Dicke einer Z-Scheibe pro Bild des myofibrillären Raums mit dem geraden Linienwerkzeug aus dem Menü "Werkzeuge" und berechnen Sie die durchschnittliche Z-Scheibendicke jeder der sechs bis 10 Fasern. Verwenden Sie das segmentierte Linienwerkzeug, um die Länge des äußersten Myofibrils zu messen, das direkt unter der subsarkolemmalen Region sichtbar ist. Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Werkzeuge und dann Raster aus.
Stellen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadrat-Nanometer ein. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolämischen Bildern, in denen ein Kreuz auf das subsarkolämale Glykogen trifft. Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge aus, gefolgt von einem Raster und legen Sie die Fläche pro Punkt auf 160.000 Quadrat-Nanometer fest.
Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft. Um ein Raster einzufügen, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Werkzeuge und dann Raster aus. Stellen Sie nun die Fläche pro Punkt auf 3.600 Quadrat-Nanometer ein.
Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft. Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren klicken, wählen Sie dann Werkzeuge aus, gefolgt von Raster und legen Sie die Fläche pro Punkt auf 32.400 Quadrat-Nanometer fest. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12. myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft.
Verwenden Sie das 32, 400 Quadrat-Nanometer-Gitter, um die Glykogenpartikel zufällig auszuwählen, beginnen Sie mit dem oberen linken Quadrat und bewegen Sie sich bei Bedarf nach links. Messen Sie mit dem Straight-Line-Tool den Durchmesser von fünf zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um durchschnittlich 60 Partikel pro Pool und Faser zu erhalten. Diese Abbildung zeigt die Normalwerte der drei Glykogenpools.
Es kann beobachtet werden, dass intermyofibrilläre Glykogenwerte nahezu normal verteilt sind, während sowohl intramyofibrilläres als auch subsarkolämales Glykogen eine verzerrte Verteilung aufweisen, wobei Fasern manchmal eine übermäßige Menge an Glykogen aufweisen. Unter all den Schritten ist es sehr wichtig, Kaliumferrocyanid zu verwenden. Die Analyse von Glykogen kann mit der Analyse von Mitochondrien- und Lipidtröpfchen kombiniert werden, was unser Verständnis verbessern kann, wie andere wichtige Stoffwechselkomponenten mit Glykogen und Muskelgesundheit korrelieren.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein modifiziertes Post-Fixierungs-Verfahren, das den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe verbessert. Das Protokoll beschreibt die Handhabung von Gewebe, Bildgebungstechniken und stereologische Methoden zur Quantifizierung der Glykogenverteilung in Skelettmuskeln.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Histologie
Hintergrund
- Die Messung des Glykogengehalts ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Reaktionen auf physiologische Veränderungen.
- Einzelzellen zeigen unterschiedliche Anpassungen an Bedingungen und Krankheiten.
- Hochauflösende Bildgebung ist wesentlich für die Beobachtung subzellulärer Strukturen.
- Die Technik vermeidet Spezifitätsprobleme durch die Verwendung von antikörperfreier Glykogenfärbung.
Zweck der Studie
- Verbesserung des Glykogenpartikelkontrasts in Gewebeproben.
- Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für Bildgebung und Analyse.
- Erhalt unvoreingenommener Daten zur Glykogenverteilung im Skelettmuskel.
Verwendete Methoden
- Modifiziertes Post-Fixierungs-Verfahren mit Kaliumferrocyanid.
- Herstellung der Fixierlösung unter Verwendung von Glutaraldehyd und Natriumcacodylatpuffer.
- Transmissionselektronenmikroskopie für hochauflösende Bildgebung.
- Stereologische Methoden für quantitative Analyse.
Hauptergebnisse
- Verbesserter Kontrast von Glykogenpartikeln wurde erreicht.
- Protokoll ermöglicht präzise Bildgebung subzellulärer Strukturen.
- Unvoreingenommene Quantifizierung der Glykogenverteilung wurde demonstriert.
- Technik ist auf verschiedene Gewebetypen anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Das modifizierte Verfahren verbessert die Glykogenvisualisierung erheblich.
- Bietet eine zuverlässige Methode zum Studium von Glykogen im Skelettmuskel.
- Erleichtert ein besseres Verständnis zellulärer Anpassungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
