Name: Computerrekonstruktion von Pankreasinseln als Werkzeug für die Struktur- und Funktionsanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie die computergestützte Rekonstruktion von Pankreasinseln zur Analyse morphologischer und konnektivitätsbezogener Eigenschaften. Diese Methode ermöglicht Simulationen zur Bewertung funktionaler Implikationen.

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G.J. Félix-Martínez dankt CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Mexiko) und der Abteilung für Elektrotechnik der Universidad Autónoma Metropolitana (Mexiko-Stadt) für die Unterstützung dieses Projekts. Wir danken Dr. Danh-Tai Hoang, Dr. Manami Hara und Dr. Junghyo Jo für ihre hervorragende Arbeit und Großzügigkeit beim Teilen der Inselarchitekturen, die diese Arbeit mit der Forschungsgemeinschaft ermöglicht haben.

HINWEIS: Ein schematisches Diagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung lautet wie folgt (siehe Zusatzdatei 1 für Details zu den Bedienfeldern, die bei jedem Schritt des Protokolls verwendet werden).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm Ein Flussdiagramm, das die sequenzielle Reihenfolge des Protokolls beschreibt, wie es in IsletLab implementiert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63351/63351fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
1. IsletLab unter Linux installieren
HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen in den Abschnitten 2 und 3 der Zusatzdatei 2, um IsletLab unter Windows oder macOS zu installieren.
<ol><li>Öffnen Sie einen Internetbrowser und gehen Sie zu https://github.com/gjfelix/IsletLab. Laden Sie die IsletLab-Repository-Dateien herunter und extrahieren Sie sie. HINWEIS: Die Zusatzdatei 3 enthält eine Kopie der Version von IsletLab, die in diesem Protokoll verwendet wird.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die gcc- und nvcc-Compiler installiert sind. Öffnen Sie ein Terminal und geben Sie die folgenden Befehle ein: GCC --Version nvcc --version Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 1 der Zusatzdatei 2, wenn einer dieser Befehle vom System nicht erkannt wird.</li>
	<li>Laden Sie die Data-Science-Plattform herunter und installieren Sie sie (siehe Materialverzeichnis). Öffnen Sie ein Terminal und gehen Sie zum Ordner IsletLab.</li>
	<li>Erstellen Sie eine neue Umgebung, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben: conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml
</li>
	<li>Aktivieren Sie die neue Umgebung, indem Sie Folgendes eingeben: conda aktivieren isletlab_v1.0
</li>
	<li>Starten Sie die IsletLab-Anwendung, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben (siehe Abbildung 2 für eine Beschreibung des Hauptfensters): Python isletlabgui_v1.0.py
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Benutzeroberfläche von IsletLab. Die Benutzeroberfläche besteht aus drei Hauptbereichen: Konfigurations- (1), Statistik- (2) und Grafikfelder (3). Die Grafiksymbolleiste (4) befindet sich am unteren Rand des Grafikbedienfelds. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63351/63351fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
2. Wiederaufbau der Insel
<ol><li>Bereiten Sie die Eingabedaten vor. Organisieren Sie die eingegebenen Inseldaten (d. h. Zelltypen und dreidimensionale (3D) Koordinaten) in einer vierspaltigen Datei, in der Spalte 1 den Zelltyp enthält (codiert als 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) und die Spalten 2 bis 4 die x-, y- bzw. z-Koordinaten enthalten (siehe einen Auszug aus einer Eingabedatei in Abschnitt 5 der Zusatzdatei 2 oder der Eingabetestdatei, die im IsletLab-Repository enthalten ist).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Eingabedatei keine Spaltenüberschriften enthält. Verwenden Sie die im IsletLab-Repository enthaltene Beispieleingabedatei, um bei Bedarf dem Protokoll zu folgen (Input_Islet_test.txt). HINWEIS: Eingabedaten, die zur Entwicklung der in IsletLab implementierten Algorithmen verwendet wurden, wurden experimentell erhalten, wie von Hoang et al.11,12 detailliert beschrieben, wobei die DAPI-Färbung zur Bestimmung der Kernpositionen und die Immunfluoreszenz zur Identifizierung der Zelltypen verwendet wurden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Erste Insel laden (Load Initial Islet ) und wählen Sie die Datei mit den Eingabedaten aus, um eine erste Insel, die 3D-Darstellung und die entsprechenden Statistiken zu generieren. Im Fehlerfall wird die folgende Meldung angezeigt: 'Fehler beim Laden der Inseldatei'. Um dies zu beheben, wiederholen Sie Schritt 2.1.</li>
	<li>Konfigurieren Sie den Rekonstruktionsprozess. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruktionseinstellungen und ändern Sie die Optimierungsparameter (siehe Abschnitte 4 und 5 der Zusatzdatei 2 für eine kurze Beschreibung des Algorithmus und der im Fenster Rekonstruktionseinstellungen angezeigten Parameter).</li>
	<li>Legen Sie die Anfangstemperatur = 1, den Iterationsfaktor = 1 und den Akzeptanzfaktor = 1 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Parameterwerte zu speichern. HINWEIS: Als Faustregel gilt, dass eine Erhöhung des Temperaturparameters sowie der Iterationen und Akzeptanzfaktoren zu besseren Rekonstruktionsergebnissen in Bezug auf die experimentellen Zellen führt, die in der rekonstruierten Insel enthalten sind, auf Kosten einer Erhöhung der Rechenzeit.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Insel rekonstruieren, um das Fenster des Rekonstruktionsprotokolls zu öffnen (eine Beschreibung der im Rekonstruktionsprotokoll enthaltenen Informationen finden Sie in Abschnitt 6 der Zusatzdatei 2).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Rekonstruktionsprozess zu starten. Überwachen Sie den Optimierungsprozess, bis die Meldung "Bitte schließen Sie dieses Fenster, um fortzufahren" angezeigt wird. Schließen Sie das Fenster des Rekonstruktionsprotokolls, um die visuelle Darstellung der rekonstruierten Insel zu generieren und die zugehörigen Statistiken zu berechnen (siehe linke Spalte in Abbildung 3A-C).</li>
	<li>Bewerten Sie die Ergebnisse des Rekonstruktionsprozesses, indem Sie die Optimierungsstatistiken analysieren, die auf der letzten Registerkarte "Insel" des Statistikbereichs angezeigt werden. Konzentrieren Sie sich insbesondere auf die Maximierung des Prozentsatzes der experimentellen Zellen, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind (% der experimentellen) oder gleichwertig, auf die Minimierung der Anzahl der Überlappungen (auch grafisch im Konvergenzdiagramm dargestellt, rechte Spalte in Abbildung 3A-C).</li>
	<li>Wenn der Prozentsatz der experimentellen Statistik gemäß den Benutzerzielen als niedrig angesehen wird, starten Sie IsletLab wie in Schritt 9.1 beschrieben neu und erhöhen Sie die Anfangstemperatur, den Iterationsfaktor und den Akzeptanzfaktor in den Rekonstruktionseinstellungen und wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden (&gt; 95% der Versuchszellen). Siehe Abschnitte 5-7 der Zusatzakte 2 für eine weitere Beschreibung des Wiederaufbauprozesses und der damit verbundenen Ergebnisse.</li>
</ol>3. Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten
<ol><li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruktionseinstellungen , und legen Sie den Parameter Kontakttoleranz fest, um die Kontakttoleranz von Zelle zu Zelle zu definieren, und klicken Sie auf OK, um die Parameterwerte zu speichern. HINWEIS: Der Kontakttoleranzparameter stellt den maximalen Abstand zwischen den Zellen dar, um als in Kontakt betrachtet zu werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Zell-zu-Zell-Kontakte, um die Zellen in engem Kontakt zu identifizieren. Suchen Sie auf der Registerkarte Kontakte nach Zellen im Kontakt, die grafisch (schwarze Linien) im Grafikfeld angezeigt werden, und nach den entsprechenden Statistiken (d. h. gesamte, homotypische und heterotypische Kontakte und ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ Kontakte), die im Statistikbereich angezeigt werden (siehe linke Spalte von Abbildung 4A-C).</li>
	<li>Erhöhen (verringern) Sie den Kontakttoleranzparameter, um die Anzahl der Kontakte von Zelle zu Zelle zu erhöhen (zu verringern). Einzelheiten zur Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten und den damit verbundenen Ergebnissen finden Sie in Abschnitt 8 der Zusatzakte 2.</li>
</ol>4. Aufbau des Inselnetzes
<ol><li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Netzwerk erstellen, um das Inselnetzwerk zu generieren und die zugehörigen Netzwerkmetriken zu berechnen (siehe rechte Spalte in Abbildung 4A-C). HINWEIS: Eine weitere Beschreibung der Ergebnisse im Zusammenhang mit dem generierten Inselnetz finden Sie in Abschnitt 9 der Zusatzdatei 2.</li>
</ol>5. Funktionale Simulation der rekonstruierten Insel
<ol><li>Wechseln Sie zur Registerkarte Simulation des Konfigurationsfensters der Schnittstelle (Abbildung 5).</li>
	<li>Wählen Sie den gewünschten Modus der Eigenfrequenz - Konstant oder Zufall - und klicken Sie auf die Schaltfläche Intrinsische Frequenz konfigurieren , um die Oszillatorfrequenz (in Hz) zu definieren. Wenn eine zufällige Eigenfrequenz ausgewählt wird, definieren Sie den Mittelwert und die Abweichung (in Hz), um normalverteilte Zufallsfrequenzen zu erzeugen (siehe Abschnitt 11 der Ergänzungsdatei 2 für eine Beschreibung der Simulationsparameter).</li>
	<li>Wählen Sie den gewünschten Modus der Anfangsphase - Konstant oder Zufällig. Wenn eine konstante Anfangsphase ausgewählt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Anfangsphase konfigurieren , um die Phase der Oszillatoren (im Bogenmaß) zu definieren. Wenn die zufällige Anfangsphase ausgewählt ist, weist das System allen Oszillatoren zufällige Phasen zwischen 0 und 2π zu. HINWEIS: Wenn eine konstante Anfangsphase ausgewählt ist, werden alle Oszillatoren in Phase initialisiert.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Interaktionen konfigurieren , um die Interaktionsparameter von Zelle zu Zelle im Fenster Interaktionsstärke zu definieren. Eine Beschreibung der Interaktionsparameter finden Sie in Abschnitt 11 der Zusatzdatei 2.</li>
	<li>Konfigurieren Sie die Simulation, indem Sie die Gesamtsimulationszeit (in s), den Zeitschritt (in s) und den Sparfaktor (Anzahl der Schritte zwischen gespeicherten Datenpunkten) definieren. In der in Abbildung 5 gezeigten Simulation betrug die Gesamtzeit 20000 s, mit einem Zeitschritt von 0,1 s und einem Einsparfaktor von 500.</li>
	<li>Definieren Sie die Anzahl der Blöcke, Threads und Rechenplattformfunktionen, die für die Durchführung der Simulation verfügbar sind. Definieren Sie diese Parameter in Übereinstimmung mit den spezifischen Eigenschaften der verfügbaren Grafikprozessoreinheit (GPU). HINWEIS: Im Beispiel in Abbildung 5 wurden 36 Blöcke und 64 Threads pro Block (2304 Computing-Plattform-Kerne) verwendet, da eine GPU mit 36 Multiprozessoren und 64 Computing-Plattform-Kernen pro Multiprozessor verwendet wurde. Der Wert des verwendeten Parameters für die Rechenplattform betrug 75, da die Hardware-Computing-Plattform-Fähigkeit 7,5 betrug (Einzelheiten zu diesen Parametern finden Sie in Abschnitt 10 der Zusatzdatei 2).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Simulation ausführen, um das Fenster Simulationsprotokoll zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Simulation zu starten und den Prozess zu überwachen, bis die Legende "Bitte schließen Sie das Fenster, um fortzufahren" angezeigt wird. Einzelheiten zum Simulationsprotokoll finden Sie in Abschnitt 12 der Zusatzdatei 2.</li>
	<li>Schließen Sie das Fenster Simulationsprotokoll, um die Simulationsergebnisse zu beobachten (siehe Abbildung 5). Einzelheiten zu den Simulationsergebnissen sind in Abschnitt 13 der Ergänzungsdatei 2 enthalten.</li>
</ol>6. Speichern Sie das Projekt (optional)
<ol><li>Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei &gt; Projekt exportieren. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Projektdatei gespeichert werden soll, und klicken Sie auf die Schaltfläche OK. HINWEIS: Der Name der Projektdatei wird automatisch anhand des Namens der ursprünglichen Datendatei ermittelt. Wenn das Projekt nicht gespeichert wird, werden alle Ergebnisse und zugehörigen Dateien automatisch gelöscht.</li>
	<li>Laden Sie ein exportiertes Projekt, indem Sie auf Datei &gt; Projekt laden klicken.</li>
</ol>7. Zahlen speichern (optional)
<ol><li>Klicken Sie in der Plotsymbolleiste auf das Symbol "Handlung speichern", um die aktuelle Visualisierung in einer Bilddatei zu speichern. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Zahlen, die im Protokoll erstellt werden. HINWEIS: Plots und Inselvisualisierungen können mit den Symbolen geändert werden, die in der Plotsymbolleiste des Grafikbedienfelds verfügbar sind.</li>
</ol>8. Projekt laden (optional)
<ol><li>Klicken Sie im Hauptmenü auf Datei &gt; Projekt laden , und wählen Sie eine zuvor gespeicherte Projektdatei aus, wie in den Schritten 6.1-6.2 beschrieben. HINWEIS: Ein Projekt wird nicht korrekt geladen, wenn die Projektdatei extern geändert wurde. Wenn ein Projekt erfolgreich geladen wurde, stehen nur die Simulationsfunktionen zur Verfügung.</li>
</ol>9. Starten Sie den Rekonstruktionsprozess und die Analyse neu (optional)
<ol><li>Der Benutzer kann jederzeit Datei &gt; Neustart auswählen, um alle Ergebnisse zu verwerfen und eine neue Rekonstruktion und Analyse zu starten.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Gene+Expression+Differences+between+Different+Pancreatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells.</a> ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).</li>
<li>Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongnecker%2C+DS+%22The+Pancreas%22">The Pancreas</a>. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).</li>
<li>Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiao%2C+EP+%22Principles+of+Diabetes+Mellitus%22">Principles of Diabetes Mellitus</a>. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).</li>
<li>Noguchi, G. M., Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+inputs+that+shape+pancreatic+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release.</a> Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).</li>
<li>Pérez-Armendariz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36%2C+a+key+element+in+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function.</a> Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).</li>
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<li>Arrojoe Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans%3A+a+focused+cross-species+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li>
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<li>Hoang, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Rule+for+Pancreatic+Islet+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization.</a> PloS One. 9 (10), 110384(2014).</li>
<li>Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Pancreatic+Islets%3A+Glucose-Dependent+Coordination+of+Hormone+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses.</a> PloS One. 11 (4), 0152446(2016).</li>
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<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).</li>
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<li>Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+reconstructed+architectures+from+mice+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets.</a> Islets. 14 (1), 23-35 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das obige Protokoll skizziert einen praktischen Ansatz zur Rekonstruktion und Analyse von Pankreasinselarchitekturen unter Verwendung neuartiger Berechnungsalgorithmen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die Inselforschungsgemeinschaft in die Lage zu versetzen, quantitative Metriken abzuleiten, um die morphologischen und Konnektivitätseigenschaften von Pankreasinselarchitekturen zu charakterisieren und die möglichen funktionalen Implikationen solcher Eigenschaften durch computergestützte Simulationen zu bewerte...

Die Bauchspeicheldrüse ist in Regionen unterteilt, die als Kopf, Hals, Körper und Schwanz bezeichnet werden und jeweils unterschiedliche Strukturen, Funktionen und anatomische Positionenaufweisen 1,2. Aus funktioneller Sicht kann die Bauchspeicheldrüse in endokrine und exokrine Systeme unterteilt werden, wobei erstere für die Sekretion von Hormonen verantwortlich sind, die entscheidend an der Regulation der Glukosehomöostase beteiligt sind, während letzteres über die Sekretion von Enzymen in den Zwölffingerdarm1 zur Nahrungsverdauung beiträgt. Pankreasinseln bilden das endokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse und sind verantwortlich für die Sekretion von Glucagon, Insulin und Somatostatin, die aus ɑ-, β- bzw. δ-Zellen ausgeschiedenwerden 3. Zusätzlich zu ihren intrinsischen Regulationsmechanismen werden diese Zellen über direkte elektrische Kommunikation (zwischen β-Zellen und wahrscheinlichen β- und δ-Zellen) sowie durch parakrine und autokrine Signalgebung 4,5,6 reguliert. Beide Mechanismen hängen stark von der Inselarchitektur ab (d.h. von der Zusammensetzung und Organisation der verschiedenen Zelltypen innerhalb der Insel)7,8. Wichtig ist, dass die Inselarchitektur in Gegenwart von Diabetes verändert wird, was höchstwahrscheinlich die intrainselförmige Kommunikation als Folge von 9,10 stört.
Die Untersuchung von Pankreasinseln umfasst eine breite Palette von experimentellen Methoden. Unter diesen hat die Verwendung von Fluoreszenztechniken zur Bestimmung der Anzahl, Lage und Art der verschiedenen Zellen auf der Insel es ermöglicht, die strukturellen und morphologischen Eigenschaften der Pankreasinseln11,12,13 zu untersuchen und ein besseres Verständnis der funktionellen Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit zu erlangen. Als Ergänzung wurden in den letzten Jahrzehnten Computermodelle der Pankreaszellen 14,15,16 und in jüngerer Zeit der Pankreasinseln12,17,18,19 verwendet, um Aspekte zu bewerten, die experimentell schwer oder gar unmöglich zu behandeln sind.
In diesem Protokoll wollen wir die Lücke zwischen experimenteller und computergestützter Arbeit schließen, indem wir eine Methodik zur Rekonstruktion von Inselarchitekturen, zur Analyse ihrer morphologischen und Konnektivitätseigenschaften durch quantitative Metriken und zur Durchführung grundlegender Simulationen zur Bewertung der funktionalen Auswirkungen der Inseleigenschaften skizzieren.
Das unten beschriebene Protokoll basiert auf Berechnungsalgorithmen, die speziell für die Untersuchung von Pankreasinseln entwickelt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im ersten Schritt des Protokolls die Inselarchitektur aus experimentellen Daten unter Verwendung des kürzlich von Félix-Martínez et al.19 vorgeschlagenen Algorithmus rekonstruiert wird, in dem Kernpositionen durch 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung und Zelltypen durch Immunfluoreszenz identifiziert werden (wie ausführlich beschrieben von Hoang et al.11,12 ) werden in einem iterativen Optimierungsverfahren verarbeitet. Dies führt dazu, die optimale Größe und Position jeder Zelle zu bestimmen und eine Insel zu erhalten, die aus nicht überlappenden Zellen besteht. Zweitens werden auf der Grundlage der rekonstruierten Architektur Zell-zu-Zell-Kontakte identifiziert, um die Konnektivitätseigenschaften zu bestimmen und das entsprechende Inselnetzwerk zu generieren, das es dem Benutzer ermöglicht, quantitative Metriken zu erhalten, um die Inselarchitektur weiter zu beschreiben (Details über den Rekonstruktionsalgorithmus können in der Originalarbeit zum Thema19 konsultiert werden). Schließlich werden grundlegende funktionelle Simulationen mit dem von Hoang et al.12 vorgeschlagenen Modellierungsansatz durchgeführt, bei dem basierend auf der pulsierenden Natur der experimentell beobachteten Hormonsekretion20,21 jede Zelle als Oszillator behandelt wird und daher die Insel als ein Netzwerk gekoppelter Oszillatoren dargestellt wird, die den Konnektivitätseigenschaften der rekonstruierten Insel folgen.
Angesichts der rechnerischen Komplexität der in diesem Protokoll verwendeten Algorithmen wurden alle beteiligten Schritte in einer eigenständigen Anwendung22 implementiert, mit dem Hauptziel, diese Rechenwerkzeuge allen interessierten Lesern unabhängig von ihrer Erfahrung in der Verwendung von spezialisierter Software oder Programmiersprachen zu nähern.

<table><tbody><tr><td>CUDA-fähige NVIDIA-Grafikkarte</td><td></td><td></td><td>Erforderlich für die Funktionssimulationen</td></tr><tr><td>IsletLab</td><td></td><td></td><td>https://github.com/gjfelix/IsletLab (Folgen Sie den Anweisungen zum Herunterladen und Installieren der Anwendung.)</td></tr></tbody></table>

computerrekonstruktion von pankreasinseln als werkzeug für die struktur- und funktionsanalyse

Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis

Strukturelle Eigenschaften von Pankreasinseln sind aufgrund ihrer Auswirkungen auf die intraisletale Kommunikation über elektrische, parakrine und autokrine Signalgebung der Schlüssel für die funktionelle Reaktion von Insulin-, Glucagon und Somatostatin-sezernierenden Zellen. In diesem Protokoll wird die dreidimensionale Architektur einer Pankreasinsel zunächst aus experimentellen Daten mit einem neuartigen Rechenalgorithmus rekonstruiert. Als nächstes werden die morphologischen und Konnektivitätseigenschaften der rekonstruierten Insel, wie die Anzahl und die Prozentsätze der verschiedenen Arten von Zellen, des Zellvolumens und der Zell-zu-Zell-Kontakte, erhalten. Dann wird die Netzwerktheorie verwendet, um die Konnektivitätseigenschaften der Insel durch vom Netzwerk abgeleitete Metriken wie Durchschnittsgrad, Clustering-Koeffizient, Dichte, Durchmesser und Effizienz zu beschreiben. Schließlich werden alle diese Eigenschaften funktional durch Computersimulationen unter Verwendung eines Modells gekoppelter Oszillatoren bewertet. Insgesamt beschreiben wir hier einen Schritt-für-Schritt-Workflow, der in IsletLab, einer Multiplattform-Anwendung, die speziell für die Untersuchung und Simulation von Pankreasinseln entwickelt wurde, implementiert wurde, um eine neuartige Berechnungsmethodik zur Charakterisierung und Analyse von Pankreasinseln als Ergänzung zur experimentellen Arbeit anzuwenden.

Die Rekonstruktion von Pankreasinseln mit der von Félix-Martínez et al.19 vorgeschlagenen Methodik hängt stark von den Parametern ab, die dem Optimierungsalgorithmus (definiert in den Rekonstruktionseinstellungen) gegeben werden. Ein Beispiel dafür ist visuell in Abbildung 3 dargestellt, wo rekonstruierte Inselchen, die mit verschiedenen Parametersätzen erhalten wurden, gezeigt werden. Erstens wird in Abbildung 3A eine Rekonstruktion geze...

In diesem Protokoll werden die Pankreasinseln rekonstruiert und analysiert, indem Berechnungsalgorithmen verwendet werden, die in einer dedizierten Multiplattform-Anwendung implementiert sind.

Computerrekonstruktion von Pankreasinseln als Werkzeug für die Struktur- und Funktionsanalyse

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine rechnerische Arbeitslast beschreibt, um Inselarchitekturen zu rekonstruieren, ihre morphologischen und Konnektivitätseigenschaften zu analysieren und ihre funktionalen Implikationen durch Computersimulationen zu bewerten. Der Hauptvorteil besteht darin, dass es eine Möglichkeit bietet, Hochleistungsrechenalgorithmen zu implementieren, um die theoretischen und experimentellen Arbeiten auf dem Gebiet der Inselforschung zu ergänzen. Diese Methodik kann besonders nützlich sein, um die morphologischen und Konnektivitätseigenschaften gesunder und veränderter Inseln zu vergleichen oder Inselarchitekturen verschiedener Tierarten zu vergleichen.Stellen Sie zunächst sicher, dass die GCC- und NVCC-Compiler installiert sind. Öffnen Sie ein Terminal, indem Sie die Befehle ausführen, und befolgen Sie die Anweisungen im Text, wenn einer dieser Befehle vom System nicht erkannt wird. Öffnen Sie ein Terminal und gehen Sie zum Ordner IsletLab.Erstellen Sie eine neue Umgebung, indem Sie den Befehl im Terminal ausführen. Aktivieren Sie die neue Umgebung, indem Sie den Befehl ausführen. Starten Sie die IsletLab-Anwendung, indem Sie den Befehl im Terminal ausführen.Um die Eingabedaten vorzubereiten, organisieren Sie die Eingabeinseldaten in einer vierspaltigen Datei, in der die erste Spalte der Zellentyp und die zweite, dritte und vierte Spalte die X-, Y- bzw. Z-Koordinaten der Eingabezellen sind, um sicherzustellen, dass die Eingabedatei keine Spaltenüberschriften enthält. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erste Insel laden und wählen Sie die Datei mit den Eingabedaten aus, um eine anfängliche Insel, die dreidimensionale Darstellung und die entsprechenden Statistiken zu generieren. Um den Rekonstruktionsprozess zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruktionseinstellungen und ändern Sie die Optimierungsparameter.Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Parameterwerte zu speichern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Insel rekonstruieren, um das Fenster Rekonstruktionsprotokoll zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Rekonstruktionsprozess zu starten.Bewerten Sie die Ergebnisse des Rekonstruktionsprozesses, indem Sie die Optimierungsstatistiken analysieren, die auf der Registerkarte Final Islet des Statistikfelds angezeigt werden, indem Sie sich auf die Maximierung des Prozentsatzes der experimentellen Zellen konzentrieren, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind, oder entsprechend auf die Minimierung der Anzahl der Überlappungen. Wenn der Prozentsatz der experimentellen Statistiken entsprechend den Benutzerzielen als niedrig angesehen wird, klicken Sie auf das Menü Datei und wählen Sie Neu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erste Insel laden und wählen Sie die Datei aus, die Eingabedaten enthält, um eine erste Insel zu generieren.Erhöhen Sie dann die Anfangstemperatur, den Iterationsfaktor und den Akzeptanzfaktor in den Rekonstruktionseinstellungen, und wiederholen Sie den zuvor beschriebenen Rekonstruktionsprozess der Insel, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden. Klicken Sie auf die Rekonstruktionseinstellungen und wählen Sie Kontakttoleranz, um die Kontakttoleranz von Zelle zu Zelle zu definieren. Klicken Sie auf OK, um die Parameterwerte zu speichern.Klicken Sie auf die Schaltfläche Zell-zu-Zell-Kontakte, um die Zellen in engem Kontakt zu identifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Netzwerk erstellen, um das Inselnetzwerk zu generieren und die zugehörige Netzwerkmatrix zu berechnen. Wechseln Sie zur Registerkarte Simulation des Konfigurationsfelds der Schnittstelle.Wählen Sie den gewünschten Modus der intrinsischen Frequenz, konstant oder zufällig. Klicken Sie auf die Schaltfläche Eigenfrequenz konfigurieren, um die Frequenz des Oszillators in Hertz zu definieren. Wählen Sie den gewünschten Modus der Anfangsphase, Konstant oder Zufällig.Klicken Sie auf die Schaltfläche Interaktionen konfigurieren, um die Interaktionsparameter von Zelle zu Zelle im Fenster Interaktionsstärke zu definieren. Konfigurieren Sie die Simulation, indem Sie die Gesamtsimulationszeit, den Zeitschritt und den Sparfaktor definieren. Definieren Sie die Anzahl der Blöcke, Threads und Rechenplattformfunktionen, die für die Durchführung der Simulation verfügbar sind.Klicken Sie auf die Schaltfläche Simulation ausführen, um das Fenster Simulationsprotokoll zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Simulation zu starten und den Prozess zu überwachen, bis die Legende Bitte schließen Sie das Fenster, um fortzufahren, angezeigt wird. Schließen Sie dann das Fenster Simulationsprotokoll, um die Simulationsergebnisse zu beobachten.Klicken Sie auf Datei und wählen Sie in der Menüleiste das Exportprojekt aus. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Projektdatei gespeichert werden soll, und klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Es wurde eine Inselrekonstruktion unter Verwendung suboptimaler Parametersätze in den Rekonstruktionseinstellungen erhalten, einschließlich 86,6% der Anfangszellen.Die Erhöhung der Anfangstemperatur, der Iteration und der Akzeptanzfaktoren führte zu einem höheren Prozentsatz der Anfangszellen als 93,37 und 99,15% in den rekonstruierten Inseln. Es wurden die Konvergenzdiagramme des Rekonstruktionsprozesses erhalten, die die Entwicklung überlappender Zellen als Funktion der Temperatur demonstrieren. Die Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten aus den rekonstruierten Inselarchitekturen hängt vom Wert des Kontakttoleranzparameters ab.Für den Wert von einem Mikrometer wurden nur 290 Zell-zu-Zell-Kontakte identifiziert, während für zwei Mikrometer der Gesamtkontext auf 636 bzw. 731 anstieg. Es wurde das Netzwerkdiagramm erhalten, das eine visuelle Darstellung der miteinander verbundenen Zell-zu-Zell-Kontakte bietet. Simulationsergebnisse zeigten, dass Alpha- und Betazellen vollständig phasenverschoben oszillieren, während Deltazellen mit Alpha- und Betazellen in der Phase oszillieren.Das oszillierende Verhalten der Insel wurde von den Schwingungen der Alphazellen mit einem geringen Beitrag der anderen Zellpopulation dominiert. Es wurde das Inselsynchronisationsindexdiagramm erhalten, das das Maß für die Phasenkohärenz der Schwingungen zwischen den Inselzellen und die Variation der Synchronizität zwischen Inselzellen im Laufe der Zeit liefert. Alle abgeleiteten Metriken und die funktionalen Simulationen hängen vom Rekonstruktionsprozess ab, daher ist es wichtig, den höchsten Prozentsatz an Anfangszellen in den rekonstruierten Inseln zu erreichen.Rekonstruierte Inseln, die aus diesem Verfahren gewonnen wurden, können weiter verwendet werden, um realistischere Berechnungsmodelle von Pankreasinseln zu entwickeln, indem eine detaillierte biophysikalische Beschreibung von Inselzellen einbezogen wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Neuartige computergestützte Methoden der großflächigen Beschaffung und Analyse der immunhistochemisch gefärbten Pankreas Proben werden beschrieben: (1) Virtuelle Scheiben Erfassung der gesamten Abschnitt, (2) Messe Analyse der umfangreichen Daten, (3) Rekonstruktion von 2D-Virtuelle Schnitte , (4) 3D-Mapping-Insel, und (5) Mathematische Analyse.

Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H &amp; E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H &amp; E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische...

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Hier präsentieren wir Ihnen einen Protokoll zum menschlichen Bauchspeicheldrüse Bildausschnitte in drei Dimensionen (3D) mit optimierten passiven clearing-Methoden. Diese Handschrift zeigt diese Verfahren für passive optische Clearing folgten mehrere Immunfluoreszenz Färbung um Schlüsselelemente der autonomen und sensorische neuronale Netze innervieren menschlichen Inselchen zu identifizieren.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Wir präsentieren die Herstellung von akuten Pankreasgewebeschnitten und deren Verwendung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, um die Calciumdynamik gleichzeitig in einer großen Anzahl lebender Zellen, über lange Zeiträume und mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Calciumdynamik in akuten Pankreasgewebeschnitten der Maus

Dieses Protokoll beschreibt, wie menschliche Bauchspeicheldrüsenschnitte von verstorbenen Organspendern erzeugt werden, um die Zellfunktion unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieser innovative Ansatz ermöglicht die Untersuchung normaler und strukturell geschädigter Inselzellen und des komplexen Zusammenspiels zwischen endokrinen und exokrinen Kompartimenten.

Generierung von menschlichen Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der endokrinen und exokrinen Pankreasphysiologie

In diesem Artikel präsentieren wir einen mikrofluidischen-basiertes Verfahren zur Teilcheneinschluss auf hydrodynamische Strömung. Wir zeigen, stabile Partikel Trapping auf die Flüssigkeit Staupunkt mit einem Feedback-Kontrollmechanismus, wodurch der Entbindung und Mikromanipulation von beliebigen Teilchen in einem integrierten Kleinstgerätes.

Einem mikrofluidischen-basierte Hydrodynamische Trap für einzelne Teilchen

Ein Verfahren zur Zellfusion in lebenden Organismen im Laufe der Zeit verfolgen wird beschrieben. Der Ansatz nutzt...

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

Erfahren Sie die computergestützte Rekonstruktion von Pankreasinseln zur Analyse morphologischer und konnektivitätsbezogener Eigenschaften. Diese Methode ermöglicht Simulationen zur Bewertung funktionaler Implikationen.

Computerrekonstruktion von Pankreasinseln als Werkzeug für die Struktur- und Funktionsanalyse

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