Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe
17. November 2023
Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.
Unser neues Protokoll hilft bei der Unterscheidung und Quantifizierung von drei Status von Röhrenringen, wie z. B. stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freie Tubuli in tierischen Geweben. Diese Technik besteht aus einfachen Schritten und kann die strukturelle Stabilität von Schläuchen bewerten, die durch Quantifizierung von Schläuchen nach translationaler Modifikation nicht nachgewiesen werden kann. Diese Methode ist essentiell für die Erforschung und Entwicklung von therapeutischen Wegen für Krankheiten, bei denen die Stabilität der Mikrotubuli entscheidend ist, wie z. B. Alzheimer und Krebs.
Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie die Laborkleidung für die Gewebedissektion vorbereiten. Füllen Sie eine Schachtel mit Crushed Ice und stellen Sie zwei Petrischalen darauf. Füllen Sie eine Schale mit eiskalter Phosphatpufferlösung oder PBS für das vorübergehende Waschen und Aufbewahren von präpariertem Gewebe.
Mit PBS angefeuchtetes Filterpapier auf die zweite Schale legen. Als nächstes wiegen Sie die mit PBS gefüllten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für die Lagerung von präpariertem Gewebe. Nachdem Sie das Gewebe aus einer euthanasierten Maus entnommen haben, übertragen Sie es in die Röhrchen und wiegen Sie jedes Mikroröhrchen erneut.
Bringen Sie das Gewebe in einen Glashomogenisator mit eiskaltem Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer oder MSB+Medium und homogenisieren Sie das Gewebe sofort mit einem gekühlten Homogenisator. Nun wird das Gewebehomogenat mit einer Pasteurpipette in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen überführt und bei 2.400 g drei Minuten bei zwei Grad Celsius zentrifugiert. Füllen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, um die Ablagerungen zu entfernen.
Den Überstand oder die S1-Fraktion in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen vortexen. Sofort 200 Mikroliter der S1-Fraktion in ein Zentrifugationsmikroröhrchen pipettieren und bei 100.000 G mit einem TLA-55-Rotor 20 Minuten lang bei zwei Grad Celsius zentrifugieren. Nach der zweiten Zentrifugation wird der S2-Überstand vom P2-Niederschlag getrennt.
Die gesamte Menge der S2-Fraktion wird sofort in ein Zentrifugationsmikroröhrchen überführt und mit einem TLA-120.2-Rotor 60 Minuten lang bei zwei Grad Celsius bei 500.000 g geschleudert. Nach der dritten Zentrifugation wird der S3-Überstand vom P3-Niederschlag getrennt. Lösen Sie die gesamte S3-Fraktion in 200 Mikrolitern 2X-Natriumdodecylsulfat oder SDS-Probenpuffer auf.
Mischen Sie die verbleibenden S1-Fraktionen mit einem gleichen Volumen von 2X SDS-Probenpuffer, um sie als Standardkurve für das Western Blot zu verwenden. Als nächstes werden 400 Mikroliter SDS-Probenpuffer in die P2- und P3-Fraktionsröhrchen gegeben. Beschallen Sie dann die Lösung kurz, um den Niederschlag aufzulösen, bevor Sie die Proben in neue 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen umfüllen und in die Kühlbox legen.
Kochen Sie alle Proben drei Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Mikrotubuli in der P2-Fraktion machten 34,86 % des gesamten Alpha-Tubulins in einem Mäusegehirn aus, während die Mikrotubuli in der P3- und S3-Fraktion 56,13 % bzw. 9,01 % ausmachten. Der prozentuale Anteil von Beta-3-Tubulin in den Fraktionen P2, P3 und S3 unterschied sich nicht signifikant von dem von Alpha-Tubulin.
Die S2-Fraktion zeigte eine begrenzte Passage von Tubulin durch eine 300-Kilodalton-Ultrafiltrations-Spin-Säule, während die S3-Fraktion eine vollständige Passage von Tubulin-Komplexen ermöglichte. Die chromatographische Trennung führte zu einer 100-Kilodalton-Elution von S3-Tubulin. In jeder Fraktion wurden gleiche Anteile an Alpha- und Beta-Tubulin gewonnen.
P2-Fraktionen waren signifikant mit acetyliertem Alpha-Tubulin angereichert, während tyrosiniertes Alpha-Tubulin in der P3-Fraktion dominierte. Das Einfrieren des Gehirns vor der Homogenisierung führte zu einer verminderten Alpha-Tubulin-Konzentration in den P2-Fraktionen. Alpha-Tubulin stieg jedoch in der P3-Fraktion an.
Das Einfrieren verringerte auch die Acetylierungswerte und erhöhte die Tyrosinierungswerte von Alpha-Tubulin in der P2-Fraktion. Die Behandlung mit Nocodazol verringerte das Alpha-Tubulin in der P2-Fraktion. Im Gegensatz zum Einfrieren hatte Nocodazol keinen Einfluss auf die posttranslationalen P2-Tubulin-Modifikationen.
Das Hirngewebe wies eine signifikant höhere Konzentration von P2-Tubulinen auf, während P3-Tubuline in proliferativem Gewebe konzentriert waren. Western Blotting zeigte, dass das speziell im Nervensystem vorkommende P2-Tubulin aus stabilen Mikrotubuli und P3-Tubulin aus labilen Mikrotubuli stammt. Die Stabilität der Mikrotubuli ist hochdynamisch.
Es ist wichtig, dieses Protokoll schnell und ohne Unterbrechungen in der Umgebung mit kalten Temperaturen abzuschließen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Gewebe und Fraktionen nicht eingefroren wurden, bis sie im SDS-Probenpuffer aufgelöst wurden. Es wird erwartet, dass die Kombination der Immunpräsentation mit jeder Fraktion mit der Proteomik Faktoren identifiziert, die an der Dynamik der Mikrotubuli beteiligt sind.
Mit dieser Methode konnten wir zeigen, wie normales Tau auf Mikrotubuli existiert. Es kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie es in gealterten Gehirnen abnormal wird, um neue medikamentöse Ziele für Demenz zu identifizieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein neues Protokoll zur Unterscheidung und Quantifizierung stabiler Mikrotubuli, labiler Mikrotubuli und freien Tubulins in tierischen Geweben vor. Die Methode bewertet die strukturelle Stabilität von Mikrotubuli, die entscheidend für das Verständnis von Krankheiten wie Alzheimer und Krebserkrankungen ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Dynamik der Mikrotubuli
Hintergrund
- Mikrotubuli sind essentielle Bestandteile des Cytoskeletts eukaryotischer Zellen.
- Sie weisen dynamische Instabilität auf, die zelluläre Funktionen beeinflusst.
- Das Verständnis der Mikrotubuli-Stabilität ist entscheidend für therapeutische Entwicklungen.
- Erkrankungen wie Alzheimer und bestimmte Krebsarten stehen in Verbindung mit einer Dysfunktion der Mikrotubuli.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli in Mausgeweben.
- Beurteilung der Stabilität verschiedener Mikrotubulus-Zustände.
- Verbesserung des Verständnisses von mikrotubulusassoziierten Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung der Laborkleidung für die Gewebedissektion.
- Verwendung einer eiskalten Phosphatpufferlösung für die Handhabung von Gewebe.
- Fractionierung von Mikrotubuli in stabile, labile und freie Tubuline.
- Quantifizierung der Mikrotubulus-Stabilität mittels des neuen Protokolls.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll unterscheidet effektiv zwischen stabilen und labilen Mikrotubuli.
- Die Quantifizierung liefert Erkenntnisse zur Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Geweben.
- Die Methode ist einfach und für den Laborgebrauch reproduzierbar.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Dynamik von Mikrotubuli in Krankheitszusammenhängen bei.
Schlussfolgerungen
- Dieses neue Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die die Stabilität von Mikrotubuli untersuchen.
- Es bietet potenzielle Anwendungen beim Verständnis und der Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion der Mikrotubuli in Verbindung stehen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um therapeutische Ansätze zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Beurteilung der Mikrotubuli-Stabilität ist entscheidend für die Bewertung therapeutischer Wirkmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen und Krebserkrankungen, bei denen die Dynamik des Zytoskeletts die Arzneimittelwirkung beeinflusst. Diese Fraktionierungstechnik ermöglicht die direkte Quantifizierung stabiler, labiler und freier Tubulin-Pools in nativen Geweben und liefert einen biochemischen Endpunkt, der bildgebende Verfahren und modifications-spezifische Assays ergänzt. Durch die Auflösung funktioneller Mikrotubuli-Zustände unterstützt die Methode die Zielstrukturvalidierung und die mechanistische Risikominderung in frühen Entdeckungsprogrammen, die auf Mikrotubuli-modulierende Wirkstoffe abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem Veränderungen in stabilen versus labilen Mikrotubuli-Populationen als Reaktion auf eine Behandlung mit einer Substanz quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Bietet einen gewebebasierten biochemischen Test zur Validierung der Zielstrukturenbindung von Mikrotubuli-stabilisierenden oder -destabilisierenden Wirkstoffen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem die biochemische Mikrotubuli-Stabilisierung mit funktionellen Ergebnissen in krankheitsrelevanten Systemen korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative Tubulin-Fraktionierungsdaten, die für Screenings mit hohem Inhaltsumfang von Substanzbibliotheken geeignet sind, die auf die Mikrotubulusdynamik abzielen.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet standardisierte Ultrazentrifugationsschritte, um eine konsistente Trennung von Mikrotubulus-Fraktionen über verschiedene Experimente hinweg zu erzielen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Western Blotting und proteomischen Nachuntersuchungen, um Regulatoren der Mikrotubulus-Stabilität aus fraktionierten Tubulin-Pools zu identifizieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Erkennt gewebespezifische Unterschiede in der Mikrotubulus-Stabilität, die mit der proliferativen Kapazität korrelieren, und ermöglicht dadurch die Stratifikation präklinischer Modelle.
- Translationale Kontinuität: Verbindet biochemische Mikrotubulus-Zustände mit Mustern posttranslationaler Modifikationen (z. B. Acetylierung in stabilen, Tyrosinierung in labilen Poolbereichen) zur Abstimmung von Biomarkern.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch quantitative Stabilitätskennzahlen, die den therapeutischen Index in Programmen zur Mikrotubuluszielgerichtetheit vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, wobei die Mikrotubulus-Stabilität als pharmakodynamischer Biomarker zur Bestätigung des Wirkmechanismus dient.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Messung von durch Verbindungen hervorgerufenen Verschiebungen in den Polymerisationszuständen von Mikrotubuli in lysierten nativen Geweben.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch definierte Sedimentationsschwellen (100.000 × g für stabile, 500.000 × g für labile Mikrotubuli), um reproduzierbare Fraktionierung sicherzustellen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Tubulin-Auswertungen mittels Western Blot der Fraktionen P2 (stabil), P3 (labil) und S3 (freies Tubulin), um die Wirkung von Verbindungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verknüpft Daten zur Mikrotubuli-Fraktionierung mit gewebespezifischen Expressionsmustern und Modifikationsprofilen zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare biochemische Plattform zur Bewertung von Mikrotubuli-zielgerichteten Verbindungen über mehrere Krankheitsbereiche und Gewebetypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem direkte Messungen des Mikrotubuli-Polymerisationszustands vorgenommen werden, anstatt ausschließlich auf posttranslationale Modifikationen angewiesen zu sein.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Zentrifugationsparameter und temperaturkontrollierte Prozessierung zur Erhaltung der Integrität der Mikrotubuli.
- Strategischer Wert: Verbessert die Zuversicht bei Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine orthogonale Validierung des mikrotubuli-targetierenden Wirkmechanismus über zelluläre Assays hinaus bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf quantitativer Stabilisierungswirksamkeit in krankheitsrelevanten Geweben.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebehomogenisierung und Ultrazentrifugationstechniken, um die Stabilität der Mikrotubuli während der Verarbeitung aufrechtzuerhalten.
- Setzt den Zugang zu Hochgeschwindigkeitsrotoren (TLA-55 und TLA-120.2) voraus, die 100.000 × g und 500.000 × g für die Fraktionstrennung erreichen können.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen Teams hinsichtlich der Fraktionierungszeitpunkte und -temperaturen, um konsistente Ergebnisse über verschiedene Labore hinweg sicherzustellen.
- Erfordert eine Anpassung der Pufferzusammensetzung und der Zentrifugationsparameter, wenn die Methode auf nicht-neuronale Gewebe mit unterschiedlichen Mikrotubulidichten angewendet wird.
- Ist durch die Notwendigkeit unmittelbarer Verarbeitung begrenzt, um artefaktbedingte Depolymerisierung der Mikrotubuli während der Probenhandhabung zu verhindern.
