Name: Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten erwachsener Mäuse mit dem Seahorse XF Analyzer. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Untersuchungen mitochondrialer Funktion für neurodegenerative Erkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Wangchen Tsering und Pamela Walter für ihre kritische Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 bis C.J. L. und NS098393 bis H.Z.) und dem Department of Neuroscience der Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.) unterstützt.

Alle Verfahren, einschließlich der Tierarbeit, wurden nach nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Thomas Jefferson University genehmigt. Männliche FVB/NTac-Mäuse im Alter von 3 bis 14 Monaten wurden verwendet. Die folgenden Schritte wurden in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt, aber Vorsicht ist geboten, um alles so sauber wie möglich zu halten.
HINWEIS: Die hier vorgestellte Methode wurde in der von Zhi et al.24 berichteten Forschung etabliert und verwendet. Die hier beschriebenen Experimente verwendeten einen extrazellulären Flussanalysator Seahorse XF24 (siehe Materialtabelle). Diese Methoden können für den XFe24-Analysator angepasst werden, und einige Ergebnisse wurden mit diesem Analysator bestätigt.
1. Hydratkartuschensensoren (1 Tag vor dem Assay)
<ol><li>Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie sowohl die Sensorkartusche (grün) als auch die Utility-Platte (klar; Abbildung 1A). Legen Sie die Sensorpatrone zur Seite (Sensoren hoch) und berühren Sie die Sensoren nicht.</li>
	<li>600 μL Kalibrantlösung (pH 7,4) in jede Vertiefung der Gebrauchsplatte geben. Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrantlösung. Stellen Sie sicher, dass die dreieckige Kerbe der Versorgungs- und Sensorpatronenplatte korrekt ausgerichtet ist (Abbildung 1B).</li>
	<li>Verschließen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit mit einer Dichtfolie, um eine Verdampfung der Kalibrantlösung zu verhindern, und legen Sie es dann über Nacht in einen 37 °C-Inkubator, der nicht mit CO2 oder Sauerstoff ergänzt wurde.</li>
</ol>2. Bereiten Sie die Gewebeplatte vor (am Tag des Assays)
<ol><li>Öffnen Sie die Insel-Capture-Mikroplatte und nehmen Sie die Inselplatte für das Gewebesitzen heraus.</li>
	<li>Ein geeignetes Volumen (625 μL pro Well) der voroxygenierten modifizierten künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, Zusammensetzung 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4, 0,3 mM KH 2 PO4, 25 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH7,2) Puffer in einem 50 ml Schlauch auf 37 °C erwärmen. Dann fügen Sie BSA zu einer Endkonzentration von 4 mg / ml hinzu, um den Atmungspuffer vorzubereiten. Im Allgemeinen reichen 50 ml für eine Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 625 μL Atmungspuffer (voroxygenierter ACSF-Puffer mit 25 mM Glukose und 4 mg / ml BSA) vorsichtig zu jeder Vertiefung der Inselplatte hinzu und vermeiden Sie ein Schütteln der Platte. Stellen Sie sicher, dass sich keine Resttropfen auf der Oberseite der Sensorpatrone befinden und keine Luftblasen im Puffer jedes Bohrlochs vorhanden sind.</li>
</ol>3. Akute striatale Scheibenvorbereitung und ausgeschnittene Scheibenplatzierung
<ol><li>Enthaupten Sie die Maus nach Zervixdislokation und sezieren Sie sofort das Gehirn in 10 ml eiskalter, voroxygenierter Schneidlösung (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 3,7 mMMgSO 4,0,3 mM KH2PO 4, 10 mM Glukose, pH7,4).</li>
	<li>Sektion koronale Striatalscheiben mit einem Vibratom nach Herstellerangaben (siehe Materialtabelle) in einer Dicke von 150 μm in eiskalter, voroxygenierter Schneidlösung.</li>
	<li>Die Scheiben werden in 50 ml sauerstoffhaltigem ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mMNaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4, 0,3 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4,2 mM HEPES, pH7,4) gewonnen und bis zu 30 min bei Raumtemperatur (RT) in Lösung gehalten.</li>
	<li>Nach der Gewinnung die Scheiben in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale mit 5 ml Atempuffer geben.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Biopsiestempel aus Edelstahl (z. B. 1,5 mm Durchmesser), um ein kreisförmiges Stück Gewebe im gewünschten Bereich des geschnittenen Gehirns zu erzeugen. Halten Sie die Scheibe im Puffer, während Sie mit dem Schlag vorsichtig nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass der Stempel hart genug nach unten gedrückt wird, um das Gewebe zu schneiden. Entfernen Sie den Rest des Gewebes, heben Sie den Schlag weg und entfernen Sie das kreisförmige Stück Gewebe in den Puffer.</li>
	<li>Schneiden Sie das äußerste Ende einer 1-ml-Pipettenspitze, um ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5-2,0 mm zu machen, und verwenden Sie es, um die gestanzte Scheibe zu halten und an die Oberseite des Aufnahmebildschirms zu übertragen. Saugen Sie ein Stück gestanztes Hirngewebe ab und legen Sie das Gewebe vorsichtig auf die Netzseite des Erfassungsbildschirms (Abbildung 2A). Der Aufnahmebildschirm wird ein kreisförmiges Stück Kunststoff sein, an dem das Netz an einer Seite befestigt ist. HINWEIS: Die Aufnahmebildschirme sind im Mikroplattenpaket enthalten (siehe Materialtabelle) und ähneln der in Schuh et al.23 verwendeten.</li>
	<li>Verwenden Sie vorsichtig ein Papiertaschentuch, um den Aufnahmebildschirm kurz zu trocknen. Wenn die Feuchtigkeit entfernt wird, wird das Gewebe klebrig, wodurch die Scheibe an der Mitte des Netzes befestigt werden kann. Trocknen Sie die Scheibe nicht zu sehr, da sie sonst beschädigt wird.</li>
	<li>Halten Sie die Capture-Screen-Scheibe mit einer Pinzette nach unten und legen Sie sie in eine der Vertiefungen der Inkubationsinselplatte (Abbildung 2B). Achten Sie darauf, die Scheibe nicht fallen zu lassen. Wenn ja, nehmen Sie den Bildschirm heraus und legen Sie einen neuen Schnitt darauf. HINWEIS: Legen Sie keine Gehirnschnitte in die beiden Hintergrundkorrekturtöpfe (A1 und D6) in der Inselplatte.</li>
	<li>Die Inselplatte bei 37 °C in einem Inkubator für mindestens 30 min inkubieren, um ein Gleichgewicht zwischen Temperatur und pH-Wert zu ermöglichen, bevor der Assay durchgeführt wird.</li>
</ol>4. Beladung von Kartuschen mit gewünschten Mischungen
<ol><li>Die gewünschten Verbindungen werden in modifiziertem ACSF (37 °C) auf die endgültige Stammkonzentration von 10x, 11x, 12x und 13x der Arbeitskonzentration für die Ports A bis D verdünnt und auf pH 7,4 eingestellt. Der Test verabreicht die Verbindungen in der Reihenfolge von Port A nach D. Für dieses Experiment wurden die folgenden Lösungen verwendet, wobei ihre jeweilige Arbeitskonzentration vor ihnen erwähnt wurde: 10 mM Pyruvat (Port A), 20 μM Oligomycin (Port B), 10 μM oder andere Konzentrationen von FCCP (Port C) und 20 μM Antimycin A (Port D).</li>
	<li>Laden Sie 75 μL der verdünnten Compounds vorsichtig in die entsprechenden Einspritzöffnungen der Sensorkartusche vor. Platzieren Sie die Spitzen halb in den Einspritzöffnungen in einem Winkel von 45° mit der Spitze an der Wand des Einspritzanschlusses. Die Spitzen sollten nicht vollständig an der Unterseite der Einspritzöffnungen eingesetzt werden, da dies zu einem Auslaufen von Verbindungen durch den Anschluss führen kann.</li>
	<li>Ziehen Sie die Trinkgelder vorsichtig aus den Anschlüssen zurück, um Luftblasen zu vermeiden. Tippen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen nicht zu lindern.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Einspritzöffnungen visuell auf gleichmäßiges Laden. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Flüssigkeit im Anschluss befindet und keine Resttropfen auf der Oberseite der Patrone vorhanden sind.</li>
	<li>Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator (Nicht-CO2), damit sie sich wieder auf 37 °C erwärmen kann. Vorsichtig handhaben, indem Sie nur das Gebrauchskennzeichen festhalten. Bewegen Sie sich so wenig wie möglich.</li>
</ol>5. Kalibrierung und Durchführung des Assays
<ol><li>Laden Sie die Assay-Vorlage in die Software. Drücken Sie die grüne START-Taste .</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Sie das richtige Protokoll laden. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3 min Mix, 3 min Wartezeit und 2 min Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung). Ändern Sie den Abstand des Sondenkopfes in den Hardwareeinstellungen unter Geräteeinstellungen25 von 26.600 auf 27.800. Es ist nicht notwendig, den Sondenkopf für den XFe24-Analysator zu wechseln. Drücken Sie START.</li>
	<li>Legen Sie die Sensorkassette auf der Gebrauchsplatte in das Instrumentenfach ein. Die Kerbe geht in die vordere, linke Ecke. Stellen Sie sicher, dass die Platte richtig sitzt und flach ist. Legen Sie die mit Medikamenten gefüllte Sensorkartusche zur Kalibrierung in den Analysator ein.</li>
	<li>Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensoren zu kalibrieren und auszugleichen. Dies dauert ca. 30 min.</li>
	<li>Sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte und ersetzen Sie sie durch die Inselplatte (die das Netz und die Gewebescheiben enthält).</li>
	<li>Messen Sie den Sauerstoffverbrauch in jeder Vertiefung der Platte mit den Assay-Protokollen. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3 min Mix, 3 min Wartezeit und 2 min Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung), an welcher Stelle die OCR berechnet wird.</li>
	<li>Für das gesamte Experiment umfassen 4x OCR-Messungen, um eine Baseline zu erstellen, gefolgt von der Injektion von Port A (Pyruvat) mit 4x-Messungen, dann der Injektion von Port B (Oligomycin) mit 8x-Messungen, dann der Injektion von Port C (FCCP) mit 5x-Messungen und schließlich der Injektion von Port D (Antimycin A) mit 6x-Messungen. HINWEIS: Diese Anzahl der Messungen nach jeder zusammengesetzten Injektion wird in Abhängigkeit davon bestimmt, wann die Messung das Plateau erreicht.</li>
	<li>Analysieren Sie die OCR-Messdaten und die Kopplungseffizienzdaten.</li>
</ol>

<ol><li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson%27s+disease+and+monogenic+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li>
<li>Swerdlow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitochondrial+cascades+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).</li>
<li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+deficit+in+Huntington+disease+mouse+brain+under+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress.</a> Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).</li>
<li>Amo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+decrease+caused+by+loss+of+PINK1+is+not+due+to+proton+leak%2C+but+to+respiratory+chain+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects.</a> Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).</li>
<li>Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PINK1+causes+mitochondrial+functional+defects+and+increased+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).</li>
<li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777(2009).</li>
<li>Heeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+PINK1+affects+mitochondrial+metabolism%2C+calcium+homeostasis+and+energy+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink1+regulates+the+oxidative+phosphorylation+machinery+via+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).</li>
<li>Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+Parkinson%27s+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li>
<li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li>
<li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+respiration+and+bioenergetic+status+of+mitochondria+in+primary+cerebellar+granule+neuronal+cultures+exposed+continuously+to+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-referencing+oxygen-selective+microelectrode%3A+detection+of+transmembrane+oxygen+flux+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells.</a> TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).</li>
<li>Sure, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li>
<li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria%3A+implications+for+mechanistic+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317(2011).</li>
<li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li>
<li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li>
<li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li>
<li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559(2021).</li>
<li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die von uns entwickelte Methode ermöglichte die Verwendung eines XF-Analysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen über einen Zeitraum von 4 h. Diese Methode bietet eine neue Möglichkeit, zelluläre Bioenergetik in Stempeln zu messen, die aus anatomisch definierten Gehirnstrukturen herausgeschnitten wurden. Da die analysierten Gewebeproben eher klein sind, können die Stoffwechselparameter bestimmter Hirnareale, die an einer Krankheit beteiligt sind, untersucht werden. Darüber hinaus ahmt di...

Mitochondriale Dysfunktion wurde mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit und Alzheimer-Krankheit 1,2,3. PD-Modelle wie PINK1 Knockout (KO) Mäuse und Ratten zeigen eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondrien, die aus dem Striatum (STR) oder dem ganzen Gehirn der gealterten PINK1 KO-Maus isoliert wurden, weisen Defekte im Komplex I 7,10,12,13 auf. Die direkte Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Funktion, da die OCR mit der ATP-Produktion, der Hauptfunktion der Mitochondrien14, gekoppelt ist. Daher kann die Messung der OCR in Krankheitsmodellen oder von Patienten abgeleiteten Proben / Geweben helfen zu untersuchen, wie mitochondriale Dysfunktion zu Krankheiten führt.
Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten, die mitochondriale OCR zu messen, einschließlich der Clark-Elektrode und anderer O2-Elektroden, desO2-Fluoreszenzfarbstoffs und des extrazellulären Flussanalysators 15,16,17,18,19. Als Vorteil ermöglichen O2-Elektroden-basierte Verfahren die einfache Zugabe verschiedener Substrate. Sie reichen jedoch nicht aus, um mehrere Proben gleichzeitig zu messen. Im Vergleich zu herkömmlichen O2-Elektroden-basierten Methoden bietet der extrazelluläre Flussanalysator, ein häufig verwendetes Werkzeug für OCR in Zellkulturen oder gereinigten Mitochondrien, einen verbesserten Durchsatz15,18,20. Dennoch werden alle diese Methoden in der Regel angewendet, um OCR in isolierten Mitochondrien oder Zellkulturen 6,16,17,19,20,21 zu messen. Die Isolierung von Mitochondrien verursacht unbeabsichtigte Schäden, und extrahierte Mitochondrien oder Zellkulturen sind physiologisch weniger relevant als intakte Hirnschnitte22. Selbst wenn Mikroelektroden in Schnitten verwendet werden, sind sie weniger empfindlich und schwieriger zu bedienen als in kultivierten Zellen23.
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir mit dem XF24 extrazellulären Flussanalysator eine Methode entwickelt, die die Analyse mehrerer Stoffwechselparameter aus akuten striatalen Hirnschnitten von Mäusen24 ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche direkte Quantifizierung der mitochondrialen Atmung über die OCR. Kurz gesagt, kleine Abschnitte von striatalen Hirnschnitten werden in Vertiefungen der Inselplatte platziert, und der Analysator verwendet Sauerstoff- und Protonenfluoreszenz-basierte Biosensoren, um die OCR und die extrazelluläre Versauerungsrate zu messen, bzw. 17,21,25.
Eines der einzigartigen Merkmale des Analysators sind die vier Injektionsquellen, die die kontinuierliche Messung der OCR ermöglichen, während nacheinander bis zu vier Verbindungen oder Reagenzien injiziert werden; Dies ermöglicht die Messung mehrerer zellulärer Atmungsparameter, wie z. B. basale mitochondriale OCR, ATP-verknüpfte OCR und maximale mitochondriale OCR. Die Verbindungen, die während der Messungen für das hier gezeigte Protokoll injiziert wurden, waren Arbeitskonzentrationen von 10 mM Pyruvat in der ersten Lösungsvertiefung (Port A), 20 μM Oligomycin in der zweiten Lösungsvertiefung (Port B), 10 μM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) in der dritten Vertiefung (Port C) und 20 μM Antimycin A in der vierten Vertiefung (Port D), basierend auf Fried et al.25. Es muss beachtet werden, dass diese Konzentrationen Arbeitskonzentrationen waren, und Stammlösungen von 10x, 11x, 12x und 13x wurden in die Lösungsports A bis D injiziert. Der Zweck der Verwendung jeder Lösung war wie folgt: 1) Pyruvat war notwendig, da ohne es die Zugabe von FCCP eine verringerte OCR-Reaktion hätte, die durch eine Einschränkung der verfügbaren Substrate verursacht wurde; 2) Oligomycin hemmt die ATP-Synthase und ermöglicht die Messung der ATP-verknüpften Atmung; 3) FCCP entkoppelt die Oxidation von der Phosphorylierung und ermöglicht die Messung der maximalen mitochondrialen Kapazität; 4) Antimycin A hemmt den Komplex III in der Elektronentransportkette und ermöglicht daher die Messung von OCR, die nicht mit den Mitochondrien verbunden sind.
Die verwendete Konzentration von Oligomycin wurde aus folgenden Gründen bestimmt: 1) Die empfohlene Dosis von Oligomycin für die meisten Zelltypen (isolierte Mitochondrien oder Zellkulturen) beträgt 1,5 μM. Aus Erfahrung wird normalerweise 3x-10x der dissoziierten Zelldosis für die Scheibenexperimente verwendet, da es einen Gradienten geben kann und das Eindringen von Lösung in die Scheiben Zeit in Anspruch nimmt. Daher sollte die Konzentration im Bereich von 5 μM bis 25 μM liegen. 2) Basierend auf Fried et al.25 wurde eine Konzentration von 20 μM ausgewählt. Höhere Konzentrationen wurden aufgrund der unspezifischen Toxizität von Oligomycin nicht ausprobiert. 3) In dem Bericht von Underwood et al.26 führten die Autoren ein Titrationsexperiment für Oligomycin durch und fanden heraus, dass Dosen bei 6,25, 12,5, 25 und 50 μg / ml zu einer ähnlichen Hemmung führten. Die höhere Konzentration von Oligomycin (50 μg/ml) hemmte nicht mehr, hatte aber eine größere Varianz. 4) Nach unserer Beobachtung scheint der bestimmende Faktor die Durchdringungsfähigkeit von Oligomycin zu sein. Es ist schwierig für Oligomycin, das Gewebe zu durchdringen, und deshalb dauert es mindestens 7 bis 8 Zyklen, um das Plateau, die maximale Reaktion, zu erreichen. Solange es das Plateau erreicht, wird die Hemmung als maximal angenommen.
Eine zentrale technische Herausforderung bei der Anpassung des extrazellulären Flussanalysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten besteht darin, Gewebehypoxie zu verhindern. Da der Puffer während der gesamten Messdauer (ca. 4 h) nicht mit Sauerstoff angereichert war, war die Hypoxie ein zentrales Thema. Dies gilt insbesondere für dickere Gewebeproben, bei denen Sauerstoff nicht durch die Proben diffundieren kann. Um dieses Problem zu lösen, wurden Scheiben mit einer Dicke von 150 μm geschnitten, so dass Umgebungssauerstoff die Mitte der Gehirnscheiben durchdringen konnte. Darüber hinaus wurden 4 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) dem voroxygenierten Puffer der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zugesetzt, was die Bestimmung der maximalen OCR erleichterte, wie zuvor vorgeschlagen23. Wir untersuchten, ob Zellen am Leben waren. Zunächst wurden Hoechst 33258 (10 μM) und Propidiumiodid (10 μM) verwendet, um zu untersuchen, ob Zellen unter diesen Bedingungen gesund sind. Wir untersuchten dann, ob mittelstachelige Neuronen funktionell gesund waren, indem wir Patch-Clamp-Recording verwendeten. Wir bewerteten weiter, ob Dopamin (DA) -Terminals in den striatalen Scheiben funktionell gesund waren, indem wir die DA-Freisetzung mittels Fast-Scan-Voltammetrie maßen. Die Ergebnisse zeigten, dass striatale Scheiben, die nicht mit Sauerstoff angereichert waren (ACSF/BSA-Gruppe), genauso gesund waren wie die sauerstoffhaltige Kontrollgruppe24.
Anschließend testeten wir verschiedene Kombinationen von Schichtdicke und Stanzgröße, um optimale striatale Schichtbedingungen für den Flussmittel-Atmungsassay zu bestimmen. Für die OCR-Analyse mit dem Analysator wurden dorsale Striatalscheiben mit unterschiedlichen Dicken (150 μm und 200 μm) und Stanzgrößen (1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Durchmesser) verwendet. Striatalscheiben, die 150 μm dick waren und eine Stanzgröße von 1,5 mm Durchmesser hatten, hatten die höchste Kopplungseffizienz und OCRs in einem optimalen Bereich für den Analysator24.

<table><tbody><tr><td>Accumet AB150 pH-Tischmessgerät</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td>Zur Messung des pH-Werts</td></tr><tr><td>Antimycin A aus Streptomyces sp.</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Zur Hemmung des Komplexes III der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A6003</td><td>Zur Herstellung von modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (BSA-ACSF)</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Zur Entkopplung der mitochondrialen</td></tr><tr><td>Atmung D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>G8270</td><td>Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>Zur Dissouvle von Verbindungen</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td>Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF)</td></tr><tr><td>Befeuchteter Nicht-CO2-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-683-230D</td><td>Zur Hydratisierung von Platten bei 37 & Grad; C</td></tr><tr><td>Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenes</td><td>SIGMA</td><td>O4876</td><td>Zur Hemmung der mitochondrialen ATP-Synthase</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Versiegelungsfolie</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Tocris</td><td>3616</td><td>Zur Hemmung des Komplexes I der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Seepferdchen XF Kalibrant Lösung 500 mL</td><td>Seepferdchen Bioscience</td><td>103681-100</td><td>Lösung zur Kalibrierung von Seepferdchen</td></tr><tr><td>Seahorse XF Extrazellulärer Flussmittelanalysator</td><td>Seepferdchen Bioscience-Gerät</td><td></td><td>zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate, alte Generation</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 Extrazelluläres Flussmessgerät</td><td>Seepferdchen Bioscience-Gerät</td><td></td><td>zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate,</td></tr><tr><td>neue Generation Seahorse XF24 FluxPaks</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101174-100</td><td>Packung mit Flux-Analysator-Sensorpatronen, Gewebekulturplatten, Capture-Bildschirmen&nbsp; Kalibrierlösung und Kalibrierplatten; Assay-Kit.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Zur Vermeidung von substratlimitierenden Einschränkungen bei der Substratzufuhr</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanzen aus Edelstahl</td><td>Miltex</td><td></td><td>Vorrichtung zum Stanzen von Scheiben</td></tr><tr><td>Sterile Zellkulturschale, 35 x 10 mm</td><td>Eppendrof</td><td>0030700102</td><td>Zur Scheibenstanze</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Zum Schneiden von Hirngewebe</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo Scientific Precision</td><td>282-115</td><td>Zum Erhitzen von Puffern und Lösungen</td></tr></tbody></table>

messung des sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen schnitten von erwachsenen mäusen

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären ATP-Produktion, der reaktiven Regulierung der Sauerstoffspezies und der Ca2 + - Konzentrationskontrolle. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), der Huntington-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit. Um die Rolle der Mitochondrien in Modellen dieser Krankheiten zu untersuchen, können wir die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Proxy für die mitochondriale Funktion messen. OCR wurde bereits erfolgreich in Zellkulturen sowie isolierten Mitochondrien gemessen. Diese Techniken sind jedoch physiologisch weniger relevant als die Messung der OCR in akuten Hirnschnitten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickelten die Autoren eine neue Methode mit einem Seahorse XF-Analysator, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen. Die Technik ist optimiert mit einem Fokus auf das Striatum, ein Gehirnareal, das an PD und der Huntington-Krankheit beteiligt ist. Der Analysator führt einen Live-Cell-Assay mit einer 24-Well-Platte durch, der die gleichzeitige kinetische Messung von 24 Proben ermöglicht. Die Methode verwendet kreisförmig gestanzte Stücke von striatalen Hirnschnitten als Proben. Wir demonstrieren die Wirksamkeit dieser Technik, indem wir eine niedrigere basale OCR in striatalen Schnitten eines Mausmodells von PD identifizieren. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der PD und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein.

Der erste Schritt dieser Studie bestand darin, die Schichtdicke und die Stanzgröße zu optimieren, die verwendet wurden, um einen Abschnitt des Striatums aus der Scheibe zu entfernen (Abbildung 3A). Eine Scheibe mit einer Dicke von 150 μm und einer Stanzgröße von 1,5 mm lieferte die besten Ergebnisse, die durch die Kopplungseffizienz bestimmt wurden (Abbildung 3B-C). Wie in Abbildung 3B gezeigt, ist ...

Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist ein gängiger Proxy für die mitochondriale Funktion und kann zur Untersuchung verschiedener Krankheitsmodelle verwendet werden. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die einen Seahorse XF-Analysator verwendet, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen, die physiologisch relevanter ist als andere Methoden.

Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Wir haben eine neue Methode entwickelt, bei der wir einen XF-Analysator für Seepferdchen verwenden, um den Sauerstoffverbrauch direkt zu messen. Aber gemeinsamer Proxy für die mitochondriale Funktion in akutem Objektträgerschnitt von erwachsenen Mäusen. Diese Methode misst eine Zelle durch Energetik in Punktionen von anatomisch definierten Gehirnstrukturen.Die Verwendung akuter Scheiben ahmt die physiologische zelluläre Umgebung genauer nach, was nicht auf die Weise erreicht werden kann, wie mitochondriale oder Kulturzellen isoliert werden. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein. Öffnen Sie zunächst das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit und entfernen Sie sowohl die Sensorkassette als auch die Utility-Platte.Legen Sie dann die Sensorkassette beiseite und berühren Sie die Sensoren nicht. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter kalibrierte Lösung zu jeder Wand der Versorgungsplatte hinzu. Legen Sie die Sensorkassette auf die Gebrauchsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung, um sicherzustellen, dass die dreieckige Kerbe der Versorgungs- und Sensorpatronenplatte korr

measurement-oxygen-consumption-rate-acute-striatal-slices-from-adult

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Zhi, L. et al., Messung der Sauerstoffverbrauchsrate in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2022). Dieses Video zeigt, wie die mitochondriale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in striatalen Hirnschnitten von Mäusen gemessen werden kann. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Gewebeplatte und der Sensorpatrone, zum Laden in den Flussmittelanalysator und erklärt die zellulären Prozesse, die OCR-Mustern zugrunde liegen.

Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten Schnitten des Maushirns

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode, mit der Benutzer Lebensfähigkeit der akuten hippocampal und kortikalen Slice Vorbereitungen bei der Sammlung von Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Daten pflegen können.

Metabolische Unterstützung der herausgeschnitten, lebendes Gehirn Gewebe während der Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Akquisition

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Eine metabolische Analyzer ist eine angepasste und optimierte Protokoll genutzt. Micro-Gewebe Fesseln waren sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls entworfen und speziell für den Einsatz in dieser Analyse erstellt.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Messung der Veränderungen der Stoffwechselrate ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Progression von verschiedenen Krankheiten und Alterung. Hier präsentieren wir Ihnen eine neuartige Technik zur Messung der ganzen Kopf Sauerstoffverbrauch, die mehr ähnelt die physiologische Zustand und kann Hilfe bei der Aufdeckung von neuer Medikamenten, die mitochondriale Aktivität ändern.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemesseneO2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. DerO2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Erfahren Sie die Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten erwachsener Mäuse mit dem Seahorse XF Analyzer. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Untersuchungen mitochondrialer Funktion für neurodegenerative Erkrankungen.

Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen

Weitere Videos entdecken