Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten
5. Januar 2022
Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.
Das Protokoll verfolgt gleichzeitig bakterielle Schwarmreaktionen auf unterschiedliche Induktorkonzentrationen auf einem halbfesten Agar. Dies wird kostengünstig erreicht. Diese Hochdurchsatz-Screening-Technik macht die Notwendigkeit von Agar mit verschiedenen Induktorkonzentrationen zur Beobachtung der mikrochemotaktischen Reaktionen zunichte.
Die Technik ist für das Wirkstoff-Screening und auch zur Beobachtung der mikropathogenen SD-Reaktionen konzipiert. Es kann auch verwendet werden, um Mikroreaktionen auf verschiedene biochemische Hinweise im menschlichen Wirt zu untersuchen. Diese Methode kann einen Einblick in die bakterielle Chemotaxis geben.
Bakterien reagieren auf verschiedene Konzentrationen von chemischen Lockstoffen, die als positive Chemotaxis oder chemische Repellentien bekannt sind, die als negative Chemotaxis bekannt sind. Ein sorgfältig vorbereiteter Aufbau ist unerlässlich, um Abweichungen zwischen dem Gelwinkel der unteren Schicht zu vermeiden, um das Reproduzierbarkeitsproblem zu vermeiden. Beschriften Sie zunächst 13 x 13 Zentimeter große quadratische Petrischalen mit Flecken und Induktornamen.
Dann stützen Sie das Geschirr über den Rand der Deckel. Fügen Sie Arabinoselösung zu warmem Bodenschichtmedium hinzu. Fügen Sie 40 Milliliter warmes unteres Schichtmedium hinzu.
Lassen Sie das untere Schichtmedium eine Stunde lang unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube ungestört aushärten. Sobald die untere Schicht vollständig erstarrt ist, entfernen Sie die Deckel und legen Sie die Petrischalen in eine Laminar-Flow-Haube. Fügen Sie 40 Milliliter warmes Oberschichtmedium mit einem motorisierten Pipettenfilter hinzu.
Die doppellagigen Platten abgedeckt und ungestört eine Stunde lang aushärten und dann 24 Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Legen Sie das markierte A4-Papier unter eine gut verfestigte Verlaufsplatte. Schieben Sie die breitere Seite einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze an der markierten Position in die halbfeste mittlere Oberfläche und drücken Sie die Pipettenspitze, bis sie den Boden des oberen Schichtmediums erreicht.
Wenn die Spitze den Boden berührt, hören Sie auf, vertikale Kraft auf die Spitze auszuüben, und drehen Sie die Spitze vorsichtig, um den Inhalt des zylindrischen Brunnens zu isolieren. Bewegen Sie die Pipettenspitze horizontal in einem kleinen Abstand, um den Luftstrom in den schmalen Platz zu ermöglichen. Drücken Sie die Spitze mit dem Zeigefinger, um den Gasfluss in der Spitze zu blockieren.
Ziehen Sie die Spitze vertikal heraus und halten Sie den Brunneninhalt in der Spitze, während Sie ihn herausziehen. Fügen Sie 80 Mikroliter der Übernachtwachstumskultur in jedes Bohrloch hinzu. Nehmen Sie die Schwarmplatten alle 12 Stunden nacheinander aus dem Inkubator und legen Sie sie in das Gelbildgebungssystem.
Wählen Sie den Gelbildgebungsmodus, setzen Sie die Schwarmplatte weißem Licht aus und passen Sie die Brennweite an, um eine klare Sicht auf Schwärme zu erhalten. Verbessern Sie die Helligkeit der Schwärme für eine präzise Beobachtung, indem Sie die Belichtungszeit auf 300 Millisekunden einstellen. Passen Sie den Schwellenwert an, um Störungen durch das Hintergrundlicht zu minimieren.
Speichern Sie die Bilddatei zur weiteren Analyse. Notieren Sie die Abbildungszeit, den Induktortyp, die Verlaufsausrichtung und die Dehnungen in einer txt-Datei. Klicken Sie auf "Verarbeiten" und dann auf "Schatten", um die Schärfe des Bildes zu verbessern.
Klicken Sie auf Prozess, gefolgt von Batch, um das Bild zu verarbeiten. Verarbeiten Sie dann ein Bild als Referenz, indem Sie auf Prozess, Schatten und Süden klicken. Klicken Sie auf Prozess, Stapel, Makro, um das Fenster Stapelverarbeitungsprozess zu öffnen.
Suchen Sie nach den Befehlen, die im Fenster angezeigt werden. Geben Sie die Ordneradresse der Originalbilder in die Adresse der Ausgabedatei ein, indem Sie im Fenster Stapelverarbeitung auf Verarbeiten klicken. Verwenden Sie das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um Schwärme einzeln auszuwählen, und doppelklicken Sie auf das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um die Toleranz anzupassen, bis die erzeugte Linie korrekt zur Schwarmgrenze passt.
Klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen, um den Flächenwert zu exportieren. E.coli K12 YdeH wurde auf Arabinose-Gradientenplatten getestet, die verwendet wurden, um den Oberflächenschwarmprozess mit Überlappung zwischen benachbarten Bohrlöchern zu demonstrieren. Eine Platte mit drei Testvertiefungen ermöglichte die Bildung von nicht überlappenden Grenzen.
P.aeruginosa PAO1 YdeH Schwarmmotilität wurde mit erhöhter Arabinosekonzentration von der niedrigsten Konzentration gefördert, aber allmählich mit höheren Konzentrationen Arabinose-Konzentrationen eingeschränkt. E.coli K12 Wildtyp-Stämme, die auf Resveratrol-Gradientenplatten im Konzentrationsbereich von null bis 400 Mikrolitern getestet wurden, zeigten eine moderate Einschränkung der Schwarmmotilität mit zunehmender Resveratrol-Konzentration. Schwarmflächen wurden von der ImageJ-Software quantifiziert.
Die Schwarmkurve zeigte die multiplen Konzentrationsreaktionen an. Der wichtigste Teil dieses Verfahrens ist die Herstellung einer zweilagigen Schwarmplatte mit einem bestimmten Konzentrationsbereich von Induktoren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, das induzierte Oberflächenschwärmen innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereichs zu untersuchen und die Auswirkungen anderer Induktoren und Komponenten auf das Schwärmen zu quantifizieren.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Hochdurchsatz-Screening-Technik unter Verwendung von Induktor-Gradientenplatten zur Bewertung der bakteriellen Schwarmbewegung. Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Verfolgung bakterieller Reaktionen auf verschiedene Induktorkonzentrationen auf halbfestem Agar.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Bakterielle Chemotaxis
- Arzneimittelscreening
Hintergrund
- Bakterielle Schwarmbewegung ist ein kritisches Verhalten für die Pathogenese.
- Traditionelle Methoden erfordern mehrere Agarplatten mit unterschiedlichen Induktorkonzentrationen.
- Hochdurchsatz-Techniken können die Effizienz von Screening-Prozessen verbessern.
- Das Verständnis bakterieller Reaktionen kann die Arzneimittelentwicklung und Behandlungsstrategien beeinflussen.
Zweck der Studie
- Um die bakterielle Schwarmbewegung mit einer kosteneffektiven Methode zu bewerten.
- Um mikrochemotaktische Reaktionen auf verschiedene biochemische Reize zu beobachten.
- Um das Arzneimittelscreening für Mikropathogenreaktionen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Induktor-Gradientenplatten für die gleichzeitige Verfolgung der Konzentrationsantwort.
- Halbfestes Agar zur Unterstützung des bakteriellen Wachstums und der Bewegung.
- Hochdurchsatz-Screening zur Minimierung des Ressourcenverbrauchs.
- Beobachtung der bakteriellen Chemotaxis als Reaktion auf verschiedene Reize.
Hauptergebnisse
- Die Methode verfolgt effektiv bakterielle Schwarmreaktionen.
- Sie bietet Einblicke in die bakterielle Chemotaxis und das Verhalten.
- Demonstriert Potenzial für Arzneimittelscreening-Anwendungen.
- Bietet eine kosteneffektive Alternative zu herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert das Verständnis der bakteriellen Motilität.
- Sie kann angewendet werden, um Reaktionen auf biochemische Reize bei menschlichen Wirten zu untersuchen.
- Die Methode hat Auswirkungen auf die zukünftige Arzneimittelentwicklung und mikrobiologische Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial swarming motility across inducer gradients enables high-throughput interrogation of microbial responses to biochemical cues. This approach supports early-stage drug screening and mechanistic de-risking by providing reproducible, multiplexed data on bacterial chemotaxis. Integrating gradient plate assays into discovery workflows enhances predictive confidence for anti-infective and microbiome-targeted portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic evaluation of bacterial responses to candidate inducers or inhibitors.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying chemotactic and motility phenotypes.
- Facilitates functional target validation for anti-virulence or microbiome modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, multiplexed platform for high-throughput screening of compound libraries.
- Delivers quantitative, reproducible measurements of swarming area using digital image analysis.
- Reduces assay variability by consolidating concentration gradients onto a single plate.
- Enables rapid comparison of multiple strains or conditions in parallel.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro motility phenotypes with disease-relevant bacterial behaviors.
- Supports translational biomarker identification for microbial response to host or therapeutic cues.
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by standardizing motility readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This gradient plate method bridges early discovery and screening, providing actionable data for lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies bacterial chemotaxis and motility in response to defined biochemical gradients.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, multiplexed evaluation of compound effects.
- Analytics: Generates quantitative area measurements for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Links in vitro motility changes to potential in vivo phenotypes when supported by downstream studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse bacterial species and inducer classes for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bacterial response profiling and target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by reducing plate-to-plate variability and manual handling.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions for anti-infective and microbiome-targeted programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds and mechanistic hypotheses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological technique and digital image analysis.
- Needs access to imaging systems and quantitative analysis software (e.g., ImageJ).
- Demands careful plate preparation to ensure gradient uniformity and reproducibility.
- Adaptable to various bacterial strains and inducer types with protocol optimization.
- Potential limitations include overlap of swarms at high density or suboptimal gradient formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:03
Preparation of Double-Layer Gradient Swarm Plates
1:51
Inoculation and Incubation of Gradient Swarm Plates
2:42
Imaging Bacterial Surface Swarming
3:29
Quantify the Swarm Area Using ImageJ Software
4:22
Results: Quantification of Bacterial Surface Swarming Motility
5:22
Conclusion
