Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Das Protokoll verfolgt gleichzeitig bakterielle Schwarmreaktionen auf unterschiedliche Induktorkonzentrationen auf einem halbfesten Agar. Dies wird kostengünstig erreicht. Diese Hochdurchsatz-Screening-Technik macht die Notwendigkeit von Agar mit verschiedenen Induktorkonzentrationen zur Beobachtung der mikrochemotaktischen Reaktionen zunichte.

Die Technik ist für das Wirkstoff-Screening und auch zur Beobachtung der mikropathogenen SD-Reaktionen konzipiert. Es kann auch verwendet werden, um Mikroreaktionen auf verschiedene biochemische Hinweise im menschlichen Wirt zu untersuchen. Diese Methode kann einen Einblick in die bakterielle Chemotaxis geben.

Bakterien reagieren auf verschiedene Konzentrationen von chemischen Lockstoffen, die als positive Chemotaxis oder chemische Repellentien bekannt sind, die als negative Chemotaxis bekannt sind. Ein sorgfältig vorbereiteter Aufbau ist unerlässlich, um Abweichungen zwischen dem Gelwinkel der unteren Schicht zu vermeiden, um das Reproduzierbarkeitsproblem zu vermeiden. Beschriften Sie zunächst 13 x 13 Zentimeter große quadratische Petrischalen mit Flecken und Induktornamen.

Dann stützen Sie das Geschirr über den Rand der Deckel. Fügen Sie Arabinoselösung zu warmem Bodenschichtmedium hinzu. Fügen Sie 40 Milliliter warmes unteres Schichtmedium hinzu.

Lassen Sie das untere Schichtmedium eine Stunde lang unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube ungestört aushärten. Sobald die untere Schicht vollständig erstarrt ist, entfernen Sie die Deckel und legen Sie die Petrischalen in eine Laminar-Flow-Haube. Fügen Sie 40 Milliliter warmes Oberschichtmedium mit einem motorisierten Pipettenfilter hinzu.

Die doppellagigen Platten abgedeckt und ungestört eine Stunde lang aushärten und dann 24 Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Legen Sie das markierte A4-Papier unter eine gut verfestigte Verlaufsplatte. Schieben Sie die breitere Seite einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze an der markierten Position in die halbfeste mittlere Oberfläche und drücken Sie die Pipettenspitze, bis sie den Boden des oberen Schichtmediums erreicht.

Wenn die Spitze den Boden berührt, hören Sie auf, vertikale Kraft auf die Spitze auszuüben, und drehen Sie die Spitze vorsichtig, um den Inhalt des zylindrischen Brunnens zu isolieren. Bewegen Sie die Pipettenspitze horizontal in einem kleinen Abstand, um den Luftstrom in den schmalen Platz zu ermöglichen. Drücken Sie die Spitze mit dem Zeigefinger, um den Gasfluss in der Spitze zu blockieren.

Ziehen Sie die Spitze vertikal heraus und halten Sie den Brunneninhalt in der Spitze, während Sie ihn herausziehen. Fügen Sie 80 Mikroliter der Übernachtwachstumskultur in jedes Bohrloch hinzu. Nehmen Sie die Schwarmplatten alle 12 Stunden nacheinander aus dem Inkubator und legen Sie sie in das Gelbildgebungssystem.

Wählen Sie den Gelbildgebungsmodus, setzen Sie die Schwarmplatte weißem Licht aus und passen Sie die Brennweite an, um eine klare Sicht auf Schwärme zu erhalten. Verbessern Sie die Helligkeit der Schwärme für eine präzise Beobachtung, indem Sie die Belichtungszeit auf 300 Millisekunden einstellen. Passen Sie den Schwellenwert an, um Störungen durch das Hintergrundlicht zu minimieren.

Speichern Sie die Bilddatei zur weiteren Analyse. Notieren Sie die Abbildungszeit, den Induktortyp, die Verlaufsausrichtung und die Dehnungen in einer txt-Datei. Klicken Sie auf "Verarbeiten" und dann auf "Schatten", um die Schärfe des Bildes zu verbessern.

Klicken Sie auf Prozess, gefolgt von Batch, um das Bild zu verarbeiten. Verarbeiten Sie dann ein Bild als Referenz, indem Sie auf Prozess, Schatten und Süden klicken. Klicken Sie auf Prozess, Stapel, Makro, um das Fenster Stapelverarbeitungsprozess zu öffnen.

Suchen Sie nach den Befehlen, die im Fenster angezeigt werden. Geben Sie die Ordneradresse der Originalbilder in die Adresse der Ausgabedatei ein, indem Sie im Fenster Stapelverarbeitung auf Verarbeiten klicken. Verwenden Sie das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um Schwärme einzeln auszuwählen, und doppelklicken Sie auf das Zauberstab-Nachlaufwerkzeug, um die Toleranz anzupassen, bis die erzeugte Linie korrekt zur Schwarmgrenze passt.

Klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen, um den Flächenwert zu exportieren. E.coli K12 YdeH wurde auf Arabinose-Gradientenplatten getestet, die verwendet wurden, um den Oberflächenschwarmprozess mit Überlappung zwischen benachbarten Bohrlöchern zu demonstrieren. Eine Platte mit drei Testvertiefungen ermöglichte die Bildung von nicht überlappenden Grenzen.

P.aeruginosa PAO1 YdeH Schwarmmotilität wurde mit erhöhter Arabinosekonzentration von der niedrigsten Konzentration gefördert, aber allmählich mit höheren Konzentrationen Arabinose-Konzentrationen eingeschränkt. E.coli K12 Wildtyp-Stämme, die auf Resveratrol-Gradientenplatten im Konzentrationsbereich von null bis 400 Mikrolitern getestet wurden, zeigten eine moderate Einschränkung der Schwarmmotilität mit zunehmender Resveratrol-Konzentration. Schwarmflächen wurden von der ImageJ-Software quantifiziert.

Die Schwarmkurve zeigte die multiplen Konzentrationsreaktionen an. Der wichtigste Teil dieses Verfahrens ist die Herstellung einer zweilagigen Schwarmplatte mit einem bestimmten Konzentrationsbereich von Induktoren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, das induzierte Oberflächenschwärmen innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereichs zu untersuchen und die Auswirkungen anderer Induktoren und Komponenten auf das Schwärmen zu quantifizieren.