Name: Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Quantifizierung bakterieller Schwarmmotilität auf Induktorgradientenplatten. Diese kosteneffiziente Technik ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung mikrochemotaktischer Reaktionen für die Arzneimittelforschung.

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Die Entwicklung dieser Technik wurde durch die Mittel des National Key R&D Plan (2018YF0902604) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, des Forschungsfonds für internationale Nachwuchswissenschaftler (22050410270) der National Natural Science Foundation of China und der Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001) unterstützt. Wir möchten Frau Chen Xinyi unseren aufrichtigen Dank für ihre Unterstützung beim Korrekturlesen des Dokuments und des Labormanagements aussprechen.

1. Herstellung von Gradientenschwarmplatten
<ol><li>Herstellung von Schwarmmedium HINWEIS: Im Diskussionsabschnitt finden Sie einen kurzen Vergleich verschiedener mittlerer Viskositäten. 0,7% (w/v) Agarkonzentration von Schwarmmedium wurde in diesem Protokoll verwendet.<ol>
<li>Lysogeny Brühe (LB) Pulver mit Agar in zwei konischen Kolben vorbereiten; Jeder Kolben enthält 2 g Trypton, 2 g Natriumchlorid, 1 g Hefeextrakt und 1,4 g Agar. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) hinzu und rühren Sie die Suspension mit einem magnetischen Rührstab um. Stellen Sie die Endlautstärke auf 200 ml ein, indem Sie zusätzliches ddH2O hinzufügen.</li>
		<li>Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 20 min. Verwenden Sie einen luftdurchlässigen Verschluss oder eine Flaschensiegelfolie mit einer Lüftungsöffnung. HINWEIS: Agar löst sich auf, wenn es im Autoklaven erhitzt wird.</li>
		<li>Wenn die Temperatur auf 65 °C sinkt, mischen Sie die Lösung, um Homogenität zu gewährleisten, und geben Sie das Medium zur kurzfristigen Verwendung in einen 65 °C-Inkubator oder ein Wasserbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufbereitung des Bodenlagen-Schwarmmediums HINWEIS: Das Medium der unteren Schicht ist die Mischung aus Schwarmmedium und Induktor-Stammlösungen. Die Formulierung von Induktorgradienten-Schwarmplatten ist in Tabelle 1 dargestellt.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 100 mM Resveratrol-Stammlösung vor, indem Sie 114,12 mg lyophilisiertes Resveratrolpulver in 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen und die Lösung bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 20% (w/v) Arabinose-Stammlösung vor, indem Sie 6 g Arabinosepulver in 30 ml ddH2O auflösen; Warten Sie 10-15 Minuten, damit sich die Arabinose auflösen kann; und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entnehmen Sie das Medium aus dem 65 °C Inkubator und legen Sie es bei Raumtemperatur ab; Lassen Sie das Schwarmmedium abkühlen, bis der Erlenmeyerkolben kühl genug ist, um zu halten (~ 50 ° C). Legen Sie das Schwarmmedium nicht für längere Zeit auf Raumtemperatur, da dies zu einer Erstarrung von Agar führt.</li>
		<li>Das erforderliche Volumen der Induktor-Stammlösung wird dem Schwarmmedium bei 50 °C beigemessen (Tabelle 1). Verwenden Sie eine Pipette, um die Induktorlösung zu dosieren, anstatt sie zu gießen. Vorsichtig schwenken, um den Induktor mit dem Schwarmmedium zu mischen. HINWEIS: Dieser Schritt ist für Induktoren, die nicht autoklaviert werden können. Achten Sie darauf, keine Blasen in das Medium einzuführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von zweilagigen Gradientenschwarmplatten HINWEIS: Das Medium der oberen Schicht ist LB-Medium, das 0,7% (w/v) Agar enthält.<ol>
<li>Beschriften Sie quadratische 13 x 13 cm große Petrischalen mit Induktornamen und -sorten, und stützen Sie die Schalen über den Rand der Deckel (Abbildung 1B).</li>
		<li>Fügen Sie 40 ml warmes Bodenschichtmedium (50 °C) mit einer 50 ml Pipette oder einem 50 ml Zentrifugenröhrchen hinzu. HINWEIS: Alternativ ist für 13 x 13 cm quadratische Petrischalen 40 ml Unterschicht und Oberschicht Medium geeignet; für 10 x 10 cm quadratische Petrischale, 25 ml Unterschicht und Oberschicht Medium ist geeignet.</li>
		<li>Lassen Sie das Medium der unteren Schicht 1 h lang in einer Laminar-Flow-Haube unbedeckt aushärten. Quadratische Petrischalen nicht stören, während das Medium erstarrt. HINWEIS: Während der Aushärtung der unteren Schicht sollte Schwarmmedium, das keine Induktoren enthält, in einem 65 °C Inkubator oder Wasserbad aufbewahrt werden.</li>
		<li>Sobald die untere Schicht vollständig erstarrt ist, entfernen Sie die Deckel und legen Sie die quadratischen Petrischalen in eine laminare Flow-Haube.</li>
		<li>Fügen Sie 40 ml warmes Medium der oberen Schicht (50 °C) mit einer 50 ml Pipette oder einem 50 ml Zentrifugenröhrchen hinzu. HINWEIS: Das Medium der oberen Schicht enthält keine Induktoren.</li>
		<li>Aushärten Sie die doppellagigen Platten auf der Tischplatte abgedeckt und ungestört für 1 h. Lagern Sie die vorbereiteten Platten bei 4 °C für bis zu 24 h. HINWEIS: Längere Aushärtungszeiten würden den Feuchtigkeitsgehalt reduzieren und die Schwarmmotilität einschränken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Wachstum von E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1
<ol><li>Bereiten Sie 500 ml LB-Medium vor, indem Sie 5 g Trypton, 5 g NaCl und 2,5 g Hefeextrakt in ddH2O geben und die Lösung auf 500 ml auffüllen. Autoklavieren Sie die Lösung im Flüssigkeitszyklus für 20 min bei 121 °C und lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml 1,5% (w/v) LB-Agar-Medium vor, indem Sie 1 g Trypton, 1 g NaCl, 0,5 g Hefeextrakt und 1,5 g Agar in ddH2O geben und die Lösung auf 100 ml auffüllen. Autoklavieren Sie die Lösung im Flüssigkeitszyklus für 20 min bei 121 °C. Überführen Sie das Medium in ein 50 °C warmes Wasserbad, um eine Verfestigung des Agars zu verhindern.</li>
	<li>Wenn der LB-Agar-Mediumkolben angenehm zu halten ist, fügen Sie 20 ml LB-Agar-Medium in eine Petrischale (10 cm Durchmesser) mit einer 25-ml-Pipette hinzu. Lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur stehen und lagern Sie die LB-Agarplatte bei 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie Bestandskulturen auf, die bei -80 °C gelagert werden, streifen E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 und P. aeruginosa PAO1-YdeH Stämme auf LB-Agar Petrischalen unter Verwendung von Einweg-Impfschleifen. Brüten Sie die Petrischalen über Nacht auf den Kopf bei 37 ° C um.</li>
	<li>Wählen Sie einzelne Kolonien für verschiedene Stämme aus den Petrischalen aus, impfen Sie jede Kolonie in 5 ml LB-Medium und inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C in einem Labororbitalschüttler, der auf 220 U / min eingestellt ist.</li>
	<li>Wenn die Kulturdichte OD600nm ~ 1.0 erreicht, entfernen Sie die Kultur aus dem Shaker und legen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Passen Sie die Kulturdichte auf OD600nm = 1.0 an, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben.</li>
</ol>3. Impfung und Inkubation von Gradientenschwarmplatten
<ol><li>Vorbereitung von Impfbrunnen HINWEIS: 3D-Druckabdeckungsmodelle, die in der Lage sind, Vertiefungen zu erzeugen, die durch einen Standardabstand getrennt sind, können anstelle der unten beschriebenen Methode verwendet werden (Ergänzende Abbildung S1).<ol>
<li>Markieren Sie die Bohrlochpositionen auf A4-Papier in Abbildung 1C. Stellen Sie drei Testkonzentrationen in einer quadratischen Petrischale mit zwei oder drei Repliken ein.</li>
		<li>Legen Sie das markierte A4-Papier unter eine erstarrte Verlaufsplatte. Schieben Sie die breitere Seite einer 100-μL-Pipettenspitze an der markierten Position in die halbfeste mittlere Oberfläche. Drücken Sie die Pipettenspitze, bis sie den Boden des oberen Schichtmediums erreicht.</li>
		<li>Wenn die Spitze den Boden berührt, üben Sie keine vertikale Kraft auf die Spitze aus. Drehen Sie die Spitze vorsichtig, um den Inhalt des zylindrischen Brunnens zu isolieren.</li>
		<li>Bewegen Sie die Pipettenspitzen horizontal in einem sehr kleinen Abstand, um den Luftstrom in den schmalen Platz zu ermöglichen. Drücken Sie die Spitze mit dem Zeigefinger, um den Gasfluss in der Spitze zu blockieren, während Sie die Pipette mit Daumen und Mittelfinger halten.</li>
		<li>Ziehen Sie die Spitze vertikal heraus und halten Sie den Brunneninhalt in der Spitze, während Sie ihn herausziehen. HINWEIS: Wenn der Brunneninhalt verrutscht, üben Sie etwas mehr Druck mit dem Zeigefinger aus, um die Spitze vollständig zu versiegeln.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.5 an jeder markierten Position. Decken Sie die Schwarmplatte vor der Impfung ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gradientenplattenimpfung und Inkubation<ol>
<li>Passen Sie die Wachstumskulturdichte über Nacht auf OD600nm = 1,0 an.</li>
		<li>Pipette 80 μL der Übernachtwachstumskultur in jedes Bohrloch. Verschütten Sie die Bakterienkultur nicht außerhalb der Brunnen.</li>
		<li>Wickeln Sie die Platten mit Siegelfolie ein. Für die Langzeitbeobachtung (3-5 Tage) wickeln Sie die Platten mit sterilem Laborgummiband ein. HINWEIS: Es ist weniger wahrscheinlich, dass Gummiband bricht.</li>
		<li>Legen Sie ein mit ddH2O gefülltes Becherglas in den Inkubator, um die Feuchtigkeit im Inkubator aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Gradientenschwarmplatten bei 37 °C. HINWEIS: Bebrüten Sie die Schwarmplatten nicht kopfüber; Dies führt dazu, dass die Bakterienkultur aus den Brunnen austritt.</li>
		<li>Stellen Sie die Schwarmplatte unmittelbar nach der Impfung ab und notieren Sie dies als 0 h Zeitpunkt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Abbildung von Bakterienoberflächenschwärmen
<ol><li>Nehmen Sie die Schwarmplatten alle 12 Stunden nacheinander aus dem Inkubator, halten Sie die Platte horizontal und legen Sie sie in das Gelbildgebungssystem (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Hinterlassen Sie keine Fingerabdrücke auf der Oberfläche von Platten; Halten Sie die Seite der Schwarmplatte mit sauberen Handschuhen fest.</li>
	<li>Wählen Sie den Gelbildgebungsmodus ; die Schwarmplatte weißem Licht aussetzen; und passen Sie die Brennweite an, um die klarste Sicht auf Schwärme zu erhalten. HINWEIS: Verwenden Sie die gleiche Brennweite für alle Platten in einer bestimmten Charge.</li>
	<li>Verbessern Sie die Helligkeit der Schwärme für eine klare Beobachtung, indem Sie die Belichtungszeit auf 300 ms einstellen. Passen Sie den Schwellenwert an, um Störungen durch das Hintergrundlicht zu minimieren. HINWEIS: Der Schwellenwert wird auf der Bedienoberfläche des Gelbildgebungssystems angepasst. Erhöhen Sie die Werte auf der linken Seite, um Störungen durch Hintergrundlicht zu minimieren. Verringern Sie die Werte auf der rechten Seite, um die Helligkeit der Schwärme zu erhöhen. In diesem Protokoll liegt die Region normalerweise zwischen 6.000 und 50.000.</li>
	<li>Speichern Sie die Bilddatei zur weiteren Analyse. Notieren Sie die Abbildungszeit, den Induktortyp, die Verlaufsorientierung und die Dehnungen in einer .txt Datei .</li>
</ol>5. Quantifizieren Sie die Schwarmfläche mit der ImageJ-Software
<ol><li>Importieren Sie die mit dem Gelbildgebungssystem aufgenommene Bilddatei.</li>
	<li>Legen Sie die Skalierungsleiste mit der ImageJ-Software fest und wenden Sie sie auf alle Bilder an.<ol>
<li>Erstellen Sie ein Liniensegment, das die Länge der Platine markiert, indem Sie auf das Linienwerkzeug klicken.</li>
		<li>Klicken Sie auf | analysieren Skalierung festlegen, um das Fenster Skalierung festlegen zu öffnen.</li>
		<li>Geben Sie die tatsächliche Länge in das Feld Bekannte Entfernung und Längeneinheit ein. HINWEIS: Da in dieser Arbeit 13 x 13 cm quadratische Petrischalen verwendet wurden, ist die tatsächliche Länge "130" und die Längeneinheit ist "mm".</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global .</li>
		<li>Fügen Sie eine Maßstabsleiste ein, indem Sie auf | analysieren klicken Tools | Skalierungsleiste, geben Sie Breite in mm, Höhe in Pixel, Schriftgröße ein, und wählen Sie im Dropdown-Menü Farbe, Hintergrund und Position aus. Alternativ können Sie Fetter Text, Text ausblenden, Serifenschrift und Überlagerung auswählen, indem Sie die Kontrollkästchen aktivieren. HINWEIS: Die Auswahl dieser Parameter wird vom Benutzer und den Eigenschaften der Bilder bestimmt. In diesem Protokoll wurde die Breite in mm auf 25, die Höhe in Pixeln auf 20, die Schriftgröße auf 80 festgelegt, und die Skalierungsleiste wurde in der unteren rechten Ecke platziert, indem Sie Position | Unten rechts. Andere Parameter können vom Benutzer ausgewählt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf | verarbeiten Schatten zur Verbesserung der Schärfe des Bildes, insbesondere der Begrenzungen (Ergänzende Abbildung S2A). Klicken Sie auf | Prozess Batch zum Verarbeiten von Bildern. HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, eine genauere Grenzziehung zu ermöglichen.<ol>
<li>Verarbeiten Sie ein Bild als Referenz, indem Sie auf | verarbeiten klicken Schatten | Süden.</li>
		<li>Klicken Sie auf | Prozess Batch-| Makro, um das Fenster Stapelverarbeitung zu öffnen. Suchen Sie nach den folgenden Befehlen, die im Fenster angezeigt werden: run("Süd"); run("Speichern"); close();</li>
		<li>Geben Sie die Ordneradresse der Originalbilder und die Adresse der Ausgabedatei ein, indem Sie im Fenster Stapelverarbeitung auf Verarbeiten klicken. HINWEIS: Es wird empfohlen, Bilder mit Schatten in einen anderen Ordner zu exportieren und eine Kopie der Originalbilder aufzubewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie das Zauberstabwerkzeug (Tracing), um Schwärme einzeln auszuwählen und die Toleranz anzupassen (Doppelklick auf Wand (Tracing), bis die erzeugte Linie korrekt zur Schwarmgrenze passt (Ergänzende Abbildung S2B). HINWEIS: Klicken Sie zunächst auf das Zauberstab-Werkzeug (Ablaufverfolgung) und wählen Sie einen Schwarm auf einem Bild aus. Wenn die Berandungen nicht korrekt dargestellt wurden, doppelklicken Sie auf das Stab-Werkzeug (Ablaufverfolgung), um die Fenster des Stab-Werkzeugs zu öffnen, in denen die Toleranz angepasst werden kann.</li>
	<li>Klicken Sie auf | analysieren Maßnahme , um den Flächenwert zu exportieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1-5.1.5, bis alle Schwärme gemessen sind, speichern Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse in einer .csv Datei.</li>
</ol>

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<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li>
<li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+swarming+motility%2C+biosurfactant+synthesis%2C+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Untersuchung der bakteriellen Schwarmmotilität auf halbfesten Gradientenplatten kann eine herausfordernde Aufgabe sein18,19,20, da sie mehrere Faktoren wie Substratviskosität, Feuchtigkeit und mittlere Komponenten umfasst. Unter diesen Faktoren spielt die Agarkonzentration eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der mikrobiellen Rückkehr zur Schwimm- oder Schwarmmotilität. Wenn die Agarkonzentration von 0,3% (w/v) auf 1...

Die bakterielle Schwarmmotilität bezieht sich auf die kollektive Migration von Bakterienzellen über die Oberfläche einer Substanz. Neben halbfesten Agarplatten, die speziell im Labor hergestellt wurden1, wird dieser Phänotyp auch auf einigen weichen Substraten wie tierischem Gewebe2, hydratisierten Oberflächen3 und Pflanzenwurzeln beobachtet4. Während eine halbfeste Oberfläche als eine der Grundbedingungen für bakterielle Schwärme gilt, benötigen einige Arten auch ein energiereiches Medium, um ihre Schwarmmotilität zu unterstützen5. Flagellenrotation treibt sowohl Schwimmen als auch Schwärmen Motilität an - Schwimmen beschreibt die einzellige Motilität innerhalb einer flüssigen Umgebung, während Schwärmen die synchrone Bewegung einer mikrobiellen Population über halbfeste Oberflächen ist.
Die Substratviskosität beeinflusst die bakterielle Motilität; Studien an pathogenen Mikroben wie Helicobacter pylori haben gezeigt, dass sich die Motilität des Erregers in Abhängigkeit von der Viskosität der Mucinschicht ändert, die durch die Versauerung der Umwelt im menschlichen Wirt beeinflusst wird6. Um diese Umgebungen zu replizieren, beschränken frühere Studien mit einer Agarkonzentration über 0,3% (w / v) die bakterielle Schwimmmotilität, um eine allmähliche Verschiebung in die Oberflächenschwärme zu bewirken. Die Verwendung einer Agarkonzentration über 1% (w/v) verhindert die Schwarmmotilität vieler Arten7. Die auf der Oberfläche gebildeten Koloniemuster sind vielfältig, darunter featureless mat8, bull's eye9, Dendrites10 und vortex11.
Obwohl die Relevanz solcher Muster unklar bleibt, scheinen diese Muster von umweltbedingten und chemischen Hinweisen abhängig zu sein12. Umwelthinweise decken verschiedene Aspekte ab, einschließlich Temperatur, Salzgehalt, Licht und pH-Wert, während chemische Hinweise das Vorhandensein von mikrobiellen Quorum Sensing-Molekülen, biochemischen Nebenprodukten und Nährstoffen umfassen. Autoinduktor-Quorum-Sensing-Signalmoleküle wie AHL (N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton) können das Schwärmen der Oberfläche beeinflussen, indem sie die Produktion von Tensid regulieren13,14. Resveratrol, eine Phytoalexinverbindung, könnte die Motilität des bakteriellen Schwärmens einschränken15.
In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Wirkung von Gradientenkonzentrationen von Resveratrol auf den Wildtyp-Escherichia coli K12-Stamm und untersuchen die Arabinose-induzierbare Schwarmmotilität von technisch hergestellten E. coli K12-YdeH- und Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-Arten. Die Produktion des YdeH-Enzyms wird durch Arabinose über den araBAD-Promotor induziert, was zu einer zellulären c-di-GMP-Störung führt und die bakterielle Schwarmmotilität beeinflusst16,17. Dieses induzierbare Schwarmverhalten wird unter Verwendung von Arabinose-Gradienten-Schwarmplatten mit E. coli K12-YdeH- und P. aeruginosa PAO1-YdeH-Stämmen untersucht.
Die Gradientenschwarmplatten werden durch sukzessives Erstarren von doppellagigem Medium hergestellt (Abbildung 1B). Die untere Schicht besteht aus dem mit dem Induktor hinzugefügten Medium, das auf eine Seite einer abgestützten Petrischale gegossen wird. Nach dem Erstarren der unteren Schicht wird die Petrischale auf eine ebene Oberfläche zurückgeführt, wobei die obere Schicht, die das Medium ohne den Induktor enthält, von der anderen Seite der Platte hinzugefügt wird. Nachdem die Schwarmplatten vollständig verfestigt sind, werden isometrisch angeordnete Haltebrunnen erzeugt, indem Löcher auf die Schwarmplatten nach einem festen Layout gebohrt werden (Abbildung 1C) oder indem die Vertiefungen mit einem 3D-gedruckten Modell der Plattenabdeckung, die Stifte enthält, während des mittleren Aushärtungsprozesses bedruckt werden (Ergänzende Abbildung S1). Ein Gelbildgebungssystem wird verwendet, um die Schwarmmorphologien zu verschiedenen Zeitpunkten zu erfassen (Abbildung 2). Die Analyse des Oberflächenschwärmens mit der ImageJ-Software (Supplemental Figure S2) liefert quantitative Ergebnisse des Oberflächenschwarmprozesses (Abbildung 3).
Daher schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Motilität des Oberflächenschwärmens innerhalb eines Konzentrationsbereichs von Induktoren zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere Konzentrationsreaktionen anderer Induktoren zu testen, indem der Induktor in das Medium der unteren Schicht gemischt wird, und kann auf andere bewegliche Spezies (z. B. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) angewendet werden. Dieser Ansatz könnte zuverlässige qualitative und quantitative Ergebnisse für das Screening eines einzelnen chemischen Induktors liefern, und separate Platten können verwendet werden, um mehr chemische Induktoren zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td>25 g, > 85% (GC)</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Aladdin</td><td>D103272</td><td>AR, > 99% (GC)</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose</td><td>Aladdin</td><td>A106195</td><td>98% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM90-15</td><td>Petrischalen aus Kunststoff, rund, 90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Aladdin</td><td>R107315</td><td>99% (GC), 25 g</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>AR, 99,5% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Quadratische Petrischalen</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM130F</td><td>Petrischalen aus Kunststoff, quadratisch, 13 mm x 13 mm</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0042</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0021</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biochemischer Inkubator</td><td>Blue pard</td><td>LRH-70</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 5200Multi-Imaging-System</td><td>Tanon</td><td>5200CE</td><td></td></tr><tr><td>Thermostatisches Wasser Badewanne</td><td>Jinghong</td><td>DK-S28</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der schwarmmotilität bakterieller oberflächen auf induktorgradientenplatten

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Die bakterielle Schwarmmotilität ist ein häufiger mikrobiologischer Phänotyp, den Bakteriengemeinschaften verwenden, um über halbfeste Oberflächen zu wandern. Bei Untersuchungen der induzierten Schwarmmotilität ist die spezifische Konzentration eines Induktors möglicherweise nicht in der Lage, Ereignisse zu melden, die innerhalb des optimalen Konzentrationsbereichs auftreten, um die gewünschten Reaktionen einer Spezies hervorzurufen. Halbfeste Platten, die mehrere Konzentrationen enthalten, werden üblicherweise verwendet, um die Reaktion innerhalb eines Induktorkonzentrationsbereichs zu untersuchen. Separate halbfeste Platten erhöhen jedoch die Schwankungen der mittleren Viskosität und des Feuchtigkeitsgehalts innerhalb jeder Platte aufgrund der ungleichmäßigen Erstarrungszeit.
Dieses Papier beschreibt eine einstufige Methode zum gleichzeitigen Testen der Motilität des Oberflächenschwärmens auf einer einzelnen Gradientenplatte, wobei die isometrisch angeordneten Testvertiefungen die gleichzeitige Erfassung von Multikonzentrationsreaktionen ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Oberflächenschwärme von Escherichia coli K12 und Pseudomonas aeruginosa PAO1 als Reaktion auf einen Konzentrationsgradienten von Induktoren wie Resveratrol und Arabinose untersucht. In regelmäßigen Abständen wurden die Schwarmmorphologien mit einem Bildgebungssystem abgebildet, um den gesamten Oberflächenschwarmprozess zu erfassen.
Die quantitative Messung der Schwarmmorphologien wurde mit der ImageJ-Software erfasst und lieferte analysierbare Informationen über das Schwarmgebiet. Dieses Papier stellt eine einfache Gradientenschwarmplattenmethode vor, die qualitative und quantitative Informationen über die Auswirkungen der Induktoren auf die Oberflächenschwärme liefert, die erweitert werden können, um die Auswirkungen anderer Induktoren auf ein breiteres Spektrum beweglicher Bakterienarten zu untersuchen.

Der Arbeitsablauf, bestehend aus der Vorbereitung von Gradientenschwarmplatten, Impfung und Inkubation, ist in Abbildung 1B dargestellt. Um Gradientenschwimmplatten zu erzeugen, wird das Medium der unteren Schicht bei ~4,3° von der horizontalen Ebene in abgestützte Schalen gegossen (Ergänzende Abbildung S3), gefolgt von dem Gießen des oberen Schichtmediums, nachdem die untere Schicht vollständig erstarrt ist. Die Zusammensetzung des zweischichtigen Mediums ist in Tab...

Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Das Protokoll verfolgt gleichzeitig bakterielle Schwarmreaktionen auf unterschiedliche Induktorkonzentrationen auf einem halbfesten Agar. Dies wird kostengünstig erreicht. Diese Hochdurchsatz-Screening-Technik macht die Notwendigkeit von Agar mit verschiedenen Induktorkonzentrationen zur Beobachtung der mikrochemotaktischen Reaktionen zunichte.Die Technik ist für das Wirkstoff-Screening und auch zur Beobachtung der mikropathogenen SD-Reaktionen konzipiert. Es kann auch verwendet werden, um Mikroreaktionen auf verschiedene biochemische Hinweise im menschlichen Wirt zu untersuchen. Diese Methode kann einen Einblick in die bakterielle Chemotaxis geben.Bakterien reagieren auf verschiedene Konzentrationen von chemischen Lockstoffen, die als positive Chemotaxis oder chemische Repellentien bekannt sind, die als negative Chemotaxis bekannt sind. Ein sorgfältig vorbereiteter Aufbau ist unerlässlich, um Abweichungen zwischen dem Gelwinkel der unteren Schicht zu vermeiden, um das Reproduzierbarkeitsproblem zu vermeiden. Beschriften Sie zunächst 13 x 13 Zentimeter große quadratische Petrischalen mit Flecken und Induktornamen.Dann stützen Sie das Geschirr über den Rand der Deckel. Fügen Sie Ara

quantifying-bacterial-surface-swarming-motility-on-inducer-gradient

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Quelle: Heering, J., et al. Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzellbildgebung von Vibrio parahaemolyticus , Schwimmer- und Schwarmzellen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Induktion der Schwarmzelldifferenzierung in Vibrio parahaemolyticus unter Verwendung eines speziell präparierten Agarmediums. Durch die Manipulation von Umwelteinflüssen wie Eisenabbau, Kalziumergänzung und Oberflächenkontakt werden die Bakterien dazu angeregt, von ihrer Schwimmerform in längliche...

Induktion der Differenzierung von Vibrio parahaemolyticus in Schwarmzellen

Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

Quelle: Guo, S., et al. Quantifizierung der Motilität des bakteriellen Oberflächenschwarms auf Induktorgradientenplatten. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die Verwendung einer doppellagigen Gradientenschwarmplatte, um das Schwarmverhalten von Bakterien unter unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen zu untersuchen. Eine Platte mit einem gradientenbildenden Inhibitor in der unteren Schicht wird mit Bakterien beimpft und inkubiert. In regelmäßigen Abständen werden Bilder aufgenommen, um...

Beurteilung des Bakterienschwarms mit einer Gradientenhemmerplatte

Quelle: Scheidweiler, D., et al. Die Kombination von fluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Quantifizierung der bakteriellen Beweglichkeit durch eine poröse Matrix, die aus zufällig angeordneten Säulen besteht. Fluoreszierend markierte Bakterien werden in das Gerät eingeführt, mikroskopisch...

Beurteilung der bakteriellen Beweglichkeit mit einem mikrofluidischen Gerät

Die Schwarmmotilität wird durch physikalische und Umweltfaktoren beeinflusst. Wir beschreiben ein zweistufiges Protokoll und Richtlinien, um die Herausforderungen zu umgehen, die üblicherweise mit der Vorbereitung und Datenerfassung von Schwarmassays verbunden sind. Ein makroskopisches bildgebendes Verfahren wird eingesetzt, um detaillierte Informationen über das Schwarmverhalten zu erhalten, die von den derzeitigen Analysetechniken nicht bereitgestellt werden.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Dieses Protokoll ermöglicht die Einzelzellmikroskopie der unterschiedlich unterschiedlichen Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Zellen. Das Verfahren erzeugt eine Population von Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellanalyse leicht verfügbar sind, und umfasst die Herstellung von Zellkulturen, die Induktion von Swarmer-Differenzierung, Probenvorbereitung und Bildanalyse.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

Wir beschreiben eine einfache Methode, um hochauflösende Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren, die mit einem Flachbett-Dokumentenscanner auf Bakteriophage (Phagen) und Antibiotikastress reagieren. Dieses Verfahren ist eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Schwärmedynamik und kann angepasst werden, um die Beweglichkeit und das Wachstum anderer Bakterienarten zu untersuchen.

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.

Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Quantifizierung bakterieller Schwarmmotilität auf Induktorgradientenplatten. Diese kosteneffiziente Technik ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung mikrochemotaktischer Reaktionen für die Arzneimittelforschung.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

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