Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

Durch die direkte Anwendung von Insektiziden auf das Insekt und nicht durch Oberflächenkontakt gibt es nur minimale Unterschiede in der Insektizidbelastung, und dies ermöglicht es uns, das Anfälligkeitsprofil von Mückenpopulationen genauer zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir massenrelativierte tödliche Dosen eines Insektizids anstelle von tödlichen Konzentrationen berechnen können, was die Vergleiche der Resistenzverhältnisse erheblich verbessert. Achten Sie darauf, die Insektizide ordnungsgemäß zu lagern, vermeiden Sie es, Ihre Werkzeuge zu kontaminieren, und stellen Sie sicher, dass die Spritzenteile in gutem Zustand sind.

Dies wird Ihnen helfen, konsistente Ergebnisse zu erzielen. Entfernen Sie zunächst die benötigten Insektizidlösungen aus dem Gefrierschrank. Wirbeln Sie die Lösung sofort um oder invertieren Sie sie fünfmal und legen Sie sie in einen lichtbeständigen Behälter bei Raumtemperatur, um die Insektizide vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen zu lassen.

Stellen Sie fünf Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 0,5 Millilitern Aceton auf. Füllen Sie den Spritzenzylinder vollständig mit Aceton aus dem ersten Röhrchen. Dann das Aceton in einen Abfallbehälter ausstoßen, indem Sie schnell auf den Kolben drücken, und wiederholen Sie vier weitere Male, um insgesamt fünf Acetonwäschen aus demselben Acetonaliquot durchzuführen.

Füllen Sie dann den Spritzenlauf vollständig mit Luft und leiten Sie die Luft und mögliche Acetonreste in den Abfallbehälter aus. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male, um drei Wäschen mit Luft durchzuführen. Erstellen Sie eine Lufttasche innerhalb des Zylinders zwischen dem Spritzenkolben und der Oberseite der Nadel, indem Sie den Kolben etwa fünf Millimeter in den Lauf ziehen.

Beschriften Sie die Plastikbecher mit der zufälligen ID für die Blindensterblichkeitsbewertung. Mit einem Aspirator, der durch Absaugen aus dem Einatmen angetrieben wird, aspirieren Sie die gewünschte Anzahl von drei bis fünf Tage alten erwachsenen Moskitos. Legen Sie die Spitze des Aspirators in das Rohr mit Baumwolle, die um die Spitze gewickelt ist.

Atme vorsichtig aus und tippe auf den Aspirator, um die Moskitos in eine konische Röhre zu bringen. Verwenden Sie die Baumwolle, um das Rohr zu verstopfen, wenn die Aspiratorspitze entfernt wird, und schließen Sie es dann mit dem Deckel ab. Schlagen Sie die Moskitos kurz in den Röhren nieder, indem Sie sie für mindestens 10 Minuten bei vier Grad Celsius platzieren oder unter dem Eis in einer Eisschale vergraben.

Bringen Sie die niedergeschlagenen Moskitos in das Insektenhandhabungszelt. Kippen Sie die Moskitos vorsichtig auf ein Plastiktablett, das auf dem Eis platziert ist, und gießen Sie etwa 50 Moskitos gleichzeitig, um sicherzustellen, dass jede das kühle Tablett darunter berührt und niedergeschlagen bleibt. Sortieren Sie die Moskitos nach Geschlecht, indem Sie sie vorsichtig an den Beinen oder Flügeln mit einer Pinzette aufheben, gefolgt von jedem Geschlecht in eine separate Haltetasse legen und aufhören, wenn die gewünschte Anzahl erreicht ist.

Entfernen Sie beim Sortieren alle Moskitos, die verletzt sind oder besonders groß oder klein sind. Um das Gewicht des Mückenbechers aufzuzeichnen, legen Sie eine leere Tasse mit einer Petrischale als Deckel auf die Waage und tieren Sie die Waage. Gießen Sie die Moskitos in den Behälter und legen Sie den Deckel darauf.

Legen Sie den Behälter auf die Waage und notieren Sie das Endgewicht zusammen mit der Anzahl der Moskitos. Stellen Sie die Tasse der Proben sofort wieder auf das Eis, um sie immobilisiert zu halten, bis alle Becher des Exemplars gewogen sind. Teilen Sie die vorbereiteten Moskitos in fünf bis 10 separate Tassen, die auf Eis gelegt und mit zufälligen IDs beschriftet sind.

Verwenden Sie eine Pinzette und eine Handtheke, um 20 bis 25 Moskitos pro Tasse zu erreichen. Um die Fruchtfliegen zu sortieren, betäuben Sie die Fliegen sieben Sekunden lang mit Kohlendioxid. Gießen Sie die Fliegen auf einen Eisbeutel, der in Bankpapier eingewickelt ist.

Trennen und zählen Sie mit einem Pinsel mit feiner Spitze die Männchen und Weibchen. Verwenden Sie den Pinsel, um die ausgewählten Fliegen vorsichtig aufzunehmen und in eine saubere, leere Lagerflasche zu legen. Nachdem Sie die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fruchtfliegen ausgewählt haben, beschriften Sie die Lagerflaschen mit dem Stammnamen und der Fruchtfliegensumme.

Anästhesieren Sie die Flasche Fruchtfliegen sieben Sekunden lang mit Kohlendioxid. Gießen Sie die Fruchtfliegen auf das Wiegepapier und verwenden Sie das Papier als Trichter, um die Fliegen in ein geteertes Fläschchen einzuführen, das mit einer zufälligen ID beschriftet ist.Nachdem Sie den Deckel der Petrischale auf die Durchstechflasche mit Fruchtfliegen gelegt haben, legen Sie sie auf die Waage. Notieren Sie das kombinierte Gewicht und die Anzahl der Proben auf dem Scoresheet.

Legen Sie sofort das Fläschchen mit Fruchtfliegen in ein Eistablett mit dem Deckel noch oben, um zu verhindern, dass die Fliegen entkommen. Laden Sie die Spritze mit der richtigen Insektizidkonzentration, beginnend mit der am wenigsten konzentrierten Dosis, und arbeiten Sie mit jeder Organismengruppe auf die konzentrierteste Dosis hin. Kippen Sie die Proben auf Wiegepapier, das auf einem Tablett auf dem Eis platziert ist.

Trennen Sie die Proben, die nahe beieinander liegen, mit einem sauberen, insektizidfreien Pinsel oder Wattestäbchen, um einen einfachen Zugang zu jeder Probe zur Dosierung zu ermöglichen. Tragen Sie mit der Spritze einen Tropfen Insektizidlösung auf den ventralen Thorax- und Bauchbereich für Moskitos und den Dorsum für Fruchtfliegen auf. Gießen Sie die Proben sofort wieder in den beschrifteten Plastikbecher.

Decken Sie die Tasse mit einem Netz und einem Gummiband ab. Beachten Sie eine aktualisierte Probenzählung auf dem Becher, wenn Exemplare dabei getötet, beschädigt oder entkommen sind. Legen Sie den fertigen Becher in ein Haltefach.

Notieren Sie für die erste Tasse den Zeitpunkt, zu dem die Dosierung abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die Dosierung für jede Tasse, bis alle Proben mit den richtigen Insektizidkonzentrationen dosiert wurden, und notieren Sie die Endzeit, wenn alle Proben dosiert wurden. Geben Sie 10% Saccharoselösung zu jeder Tasse über einen nassen Wattebausch und lagern Sie die Moskitos und Fruchtfliegen bei der gewünschten Temperatur und Luftfeuchtigkeit.

Erfassen Sie die Probensterblichkeit 24 Stunden nach Beginn der Insektizidexposition. Klassifizieren Sie Moskitos als lebendig, wenn sie fliegen können und halten Sie sich aufrecht und tot, wenn sie unbeweglich oder ataxisch sind, wie von der WHO beschrieben. Befolgen Sie die gleiche Mortalitätsbewertung für Fruchtfliegen.

Nach der Durchführung des Bioassays wurden Dosis-Wirkungs-Daten mit zwei Stämmen erhalten, die Rockefeller- und IICC-Genotyp für den männlichen und weiblichen Aedes aegypti sind. Die massenrelativierte mittlere letale Dosis für Rockefeller und IICC betrug 0,008 bzw. 0,336 Nanogramm pro Milligramm. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede zwischen den Dosis-Wirkungs-Kurven von weiblichen und männlichen Moskitos innerhalb jedes Stammes.

Daher wurden Daten beider Geschlechter kombiniert, um die medianen letalen Dosiswerte zu berechnen. Da sich die 95%-Konfidenzintervalle für die mediane letale Dosis dieser beiden Stämme nicht überschnitten, wurden diese Werte als signifikant unterschiedlich angesehen. Darüber hinaus war die IICC-Sorte bei der Berechnung der Widerstandsverhältnisse über 40-mal widerstandsfähiger als die anfällige Rockefeller-Sorte.

Dosis-Wirkungs-Daten für Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, Canton-S-Stamm, wurden ebenfalls erhalten, und die massenrelativierte mediane letale Dosis wurde mit 0,213 Nanogramm pro Milligramm festgestellt. Konsistenz ist entscheidend, insbesondere bei der Lagerung und Anwendung des Insektizids und der Beurteilung der Mortalität. Achten Sie auch beim Umgang mit der Probe darauf, Schäden oder Tod zu vermeiden, die nicht durch das Insektizid verursacht werden.

Mit dieser Methode können wir nun die technische Resistenz einer Mückenpopulation genau bestimmen und wie sich die Umweltbedingungen auf die Resistenz auswirken oder wie die technische Resistenz die praktische Resistenz vorhersagt.