Name: Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die kombinierte Zwei-Photonen-Fluoreszenz- und stimulierende Raman-Streumikroskopie zur bildgebenden Darstellung zellulärer Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse. Diese duale Methode liefert biochemische und biophysikalische Informationen für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde vom Hong Kong Research Grants Council durch Zuschüsse 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, der Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), dem Area of Excellence Scheme des University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) und der Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) durch den Zuschuss RPC10EG33 unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen und haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In diesem Protokoll wird der grundlegende Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops ausführlich beschrieben. Für die SRS-Bildgebung sind die Pumpe und die Stokes-Strahlen innerhalb des OPO zeitlich und räumlich überlappt. Diese Überlappung kann jedoch nach dem Durchlaufen des Mikroskopsystems unterbrochen werden. Daher ist sowohl die räumliche als auch die zeitliche Optimierung der Kolokalisation der Pumpe und der Stokes-Träger notwendig und entscheidend, um eine optimale SRS-Bildgebung zu erreichen. Die zeitliche Verzögerung zwisc...

Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 . Das Signal der stimulierten Raman-Streuung (SRS), das als stimulierter Raman-Gewinn (SRG) oder stimulierter Raman-Verlust (SRL) erfasst wird, ist hintergrundfrei und zeigt eine perfekte spektrale Ähnlichkeit mit spontaner Raman-Streuung11,12. Darüber hinaus sind SRL und SRG linear von der Analytkonzentration abhängig, was eine quantitative Analyse der biochemischen Komponenten ermöglicht9,11,13. Die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) wurde aufgrund ihrer inhärenten optischen Schnittfähigkeit, tiefen Eindringtiefe und geringen Phototoxizität häufig für die biologische In-vivo-Bildgebung eingesetzt14,15,16. Die Leistung der TPEF-Bildgebung hängt jedoch von den Eigenschaften fluoreszierender Tags ab, und die Anzahl der auflösbaren Farben ist aufgrund der breitbandigen Fluoreszenzspektren begrenzt8,17,18,19. Markierungsfreie SRS-Bildgebung und fluoreszenzbasierte TPEF-Bildgebung sind zwei komplementäre Bildgebungsmodalitäten, und ihre Kombination kann reichlich biophysikalische und biochemische Informationen über Gewebe liefern. Diese beiden Bildgebungsmodalitäten basieren beide auf den nichtlinearen optischen (NLO) Prozessen, die eine einfache Integration in ein Mikroskopsystem ermöglichen. Die Kombination der SRS- und TPEF-Bildgebung, die sogenannte dual-modale Bildgebung, ermöglicht eine hochdimensionale Bildgebung und Profilierung von Zellen und Geweben und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis komplexer biologischer Systeme. Insbesondere kann die Pikosekunden-SRS-Mikroskopie eine chemische Bindungsbildgebung mit hoher spektraler Auflösung im Vergleich zur Femtosekunden-SRS-Technik (fs)11 erreichen, die es ermöglicht, mehrere biochemische Komponenten in biologischem Gewebe zu unterscheiden, insbesondere in der überfüllten Fingerabdruckregion20,21. Darüber hinaus zeigt SRS im Vergleich zu einem anderen häufig verwendeten dual-modalen NLO-Mikroskopsystem mit Integration eines kohärenten Anti-Stokes-Streumikroskops (CARS) eine überlegene Leistung gegenüber CARS in Bezug auf Spektral- und Bildinterpretation sowie Detektionsempfindlichkeit11. Das SRS-TPEF-Mikroskop wurde als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung verschiedener biologischer Systeme verwendet, wie Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis Kaulquappengehirn5, Mausgehirn23,24, Rückenmark25,26, peripherer Nerv27 und Fettgewebe7 usw.
Das Rückenmark bildet zusammen mit dem Gehirn das zentrale Nervensystem (ZNS). Die Visualisierung zellulärer Aktivitäten im ZNS in vivo unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von ZNS-Erkrankungen28,29,30 und für die Entwicklung entsprechender Therapien31,32,33. Die Myelinscheide, die Axone für eine Hochgeschwindigkeits-Wirkungspotentialleitung umhüllt und isoliert, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Die Demyelinisierung gilt als Kennzeichen bei Erkrankungen der weißen Substanz wie der Multiplen Sklerose34. Darüber hinaus können Myelinreste nach einer Rückenmarksverletzung35 die Makrophagenaktivierung modulieren, was zu chronischen Entzündungen und Sekundärverletzungen beiträgt36. Daher ist die In-vivo-Bildgebung von Myelinhüllen zusammen mit Neuronen und Gliazellen in lebenden Mausmodellen eine große Hilfe, um die dynamischen Prozesse bei ZNS-Erkrankungen zu verstehen.
In diesem Protokoll werden die grundlegenden Setup-Verfahren eines selbst gebauten TPEF-SRS-Mikroskops beschrieben und die dual-modalen In-vivo-Bildgebungsverfahren für das Rückenmark der Maus vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>#2 Pinzette</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>Für Laminektomie</td></tr><tr><td>10X Objektiv</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Burn Creme</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Sony</td> <td>& alpha; 6300</td><td></td></tr><tr><td>Stromverstärker</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>Strom-Photomultiplier-Module</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm dichroitischer Langpassspiegel</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>Zur Lenkung des Epi-Fluoreszenzsignals auf das Detektionsmodul</td></tr><tr><td>D3 700 nm dichroitischer Kurzpassspiegel</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>Zur Trennung von SRS von TPEF Detektionsweg</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm Kurzpassfilter</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>Zum Blockieren des Strahls</td></tr><tr><td>FS1 Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>Zum Blockieren des Strahls</td></tr><tr><td>Fs2 Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>Zum Blockieren des YFP-Signals</td></tr><tr><td>Fs2 Kurzpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>Zum Blockieren von fs-Anregungslaserstrahlen</td></tr><tr><td>Halbwellenplatte</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Photodetektor</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>Zum Überprüfen der Stokes-Strahlmodulation</td></tr><tr><td>Jod-Betadin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Oszilloskop</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Infrarot-Viewer 2X Kit Modell 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, AB-Beschichtung</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in-Verstärker</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Flipper</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td>Multifunktionale Erfassungskarte</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiode</td><td>APE</td><td></td><td>Zur Detektion von SRS-Signalen</td></tr><tr><td>Pikosekunden-Laserquelle</td><td>APE</td><td>picoSmaragd</td><td></td></tr><tr><td>Polarisierender Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>Leistungsmesser</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scan-Objektiv L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>Scanning-Spiegel</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>Silikongel</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saphir fs Laser</td><td>Coherent</td><td>Chamäleon Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>Tubuslinse L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus bildgebung von biologischem gewebe mit kombinierter zwei-photonen-fluoreszenz und stimulierter raman-streumikroskopie

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.

Die in vivo dual-modale Bildgebung von spinalen Axonen sowie Myelinscheiden wird mit den transgenen Thy1-YFPH-Mäusen durchgeführt, die EYFP in afferenten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions exprimieren (Abbildung 3). Diese gekennzeichneten afferenten Neuronen leiten die sensorischen Informationen vom peripheren Nerv an das Rückenmark weiter, wobei sich der zentrale Ast in der Rückenmarksdorsalsäule befindet. Mit dem TPEF-SRS-Mikroskop können dicht verteilte Myelinhüllen mittels ma...

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Die In-Vivo-Bildgebung von biologischem Gewebe mit subzellulärer Auflösung und chemischer Spezifität ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau beteiligt sind. Mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie können kritische biochemische und biophysikalische Informationen biologischer Gewebe aus mehreren Perspektiven mit subzellulärer Auflösung erfasst werden. Insbesondere kann diese dual-modale Mikroskopie verwendet werden, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen im Rückenmark der Maus abzubilden, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen.Schalten Sie zunächst den Titan-Saphirlaser ein, indem Sie den Schlüsselschalter von der Standby- in die Ein-Position schalten und 30 Minuten warten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Schalten Sie dann den OPO ein, indem Sie auf die Starttaste auf dem OPO Control Panel klicken und warten Sie 20 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Nachdem sich der Pikosekundenlaser erwärmt hat, überprüfen Sie die Modulationstiefe des Stokes-Strahls, indem Sie die Leistung des Stokes-Strahls auf etwa 20 Milliwatt senken, den Laserverschluss für den Stokes-Strahl öffnen und einen Hochgeschwindigkeits-Fotodetektor am OPO-Ausgang platzieren, um den Strahl zu erkennen.Als nächstes verbinden Sie den Ausgangsanschluss des Photodetektors mit dem Eingangsanschluss eines Oszilloskops über ein Koaxialkabel mit einem BNC-Anschluss, um den Laserpuls zu überwachen. Öffnen Sie dann das EOM-Steuerungsfenster in der OPO-Steuerungssoftware und passen Sie die EOM-Leistung und -Phase entsprechend dem auf dem Oszilloskop gezeigten Pulsintensitätsdiagramm an, um eine maximale Modulationstiefe von 20 Megahertz zu erreichen. Öffnen Sie in der OPO-Steuerungssoftware den Laserverschluss der Pumpe, während Sie die Stokes-Ausgabe stoppen.Klicken Sie anschließend auf das Stellwerk, um die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 796 Nanometer einzustellen, klicken Sie dann auf die eingestellte OPO-Stromversorgungsbox und geben Sie 20 ein, um die Leistung für die optische Ausrichtung auf das Minimum einzustellen. Als nächstes platzieren Sie die Ausrichtungsplatte P1 hinter dem polarisierenden Strahlteiler bei etwa 10 Zentimetern und platzieren Sie die Platte P2 hinter P1 bei etwa 30 Zentimetern auf dem optischen Weg. Nachdem Sie den Mikroskopverschluss für den Pikosekunden-Laserstrahl geöffnet haben, stellen Sie den Spiegel M1 so ein, dass er die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P1 lokalisiert. Verwenden Sie ein Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P1 beim Einstellen des Spiegels M1 zu beobachten. Stellen Sie den Spiegel M2 entsprechend ein, um die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P2 beim Einstellen des Spiegels M2 zu beobachten. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Pikosekundenstrahlmitte am Durchgangsloch beider Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Verschluss des Pikosekundenstrahls in der Mikroskopsteuerungssoftware.Öffnen Sie als Nächstes den Mikroskopverschluss für den Femtosekunden-Laserstrahl. Stellen Sie den Spiegel M3 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P1 lokalisiert, und stellen Sie dann den Spiegel M4 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P2 lokalisiert. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Femtosekunden-Laserstrahlmitte an den Durchgangslöchern der beiden Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Mikroskopverschluss für den Femtosekundenstrahl. Platzieren Sie als Nächstes eine Kamera an der Position des Objektivs, um die Position der beiden Strahlpunkte zu visualisieren, und markieren Sie die Position des Pumpstrahls auf dem Kamerabildschirm als Referenz.Platzieren Sie dann eine Ausrichtungsplatte P0 vor dem Objektiv L3 und stellen Sie den optischen Spiegel mit einer Hex-Taste so ein, dass die Stokes-Strahlmitte das Durchgangsloch der Ausrichtungsplatte am Laserausgangsanschluss passiert. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P0 während der Einstellung zu bestätigen. Entfernen Sie als Nächstes die Ausrichtungsplatte P0 und verwenden Sie die Hex-Taste, um den optischen Spiegel zwei so einzustellen, dass die Mitte des Stokes-Strahls mit der Referenzmarkierung des Pumpstrahls auf der Kamera kolokalisiert wird.Stellen Sie die Spiegel so lange ein, bis sich der Stokes-Strahl sowohl bei P0 als auch bei den Kameraebenen strikt mit dem Pumpenstrahl überlappt. Öffnen Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware und stellen Sie die Wellenlänge des Pumpenlasers auf 796 Nanometer und die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 50 bzw. 70 Milliwatt ein, was 15 bzw. 25 Milliwatt auf der Probe entspricht. Verwenden Sie dann Olivenöl für die Optimierung der Lock-in-Verstärkerphase.Das Olivenöl wird in einem Objektträger mit Seidenpapier an der Unterseite versiegelt, um die Signalrückstreuung oder EPI-SRS-Erkennung zu verbessern. Legen Sie die Olivenölprobe auf die Bühne und stellen Sie den Fokus des 25X-Objektivs auf die Probe ein. Stellen Sie mit der Mikroskopsteuerungssoftware die Bildgebungsparameter ein, wie im Textmanuskript erwähnt.Stellen Sie dann mit der Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware den Zeitkonstantenwert auf 10 Mikrosekunden ein. Als nächstes scannen Sie den Laserstrahl über die Probe und stimmen die Phase mit einer Schrittweite von 22,5 Grad ab, bis die SRS-Signalintensität das Maximum erreicht. Scannen Sie dann die Probe mit geschlossenem Laserverschluss und stimmen Sie den Offset-Wert mit einer Schrittweite von einem Millivolt ab, bis das durchschnittliche SRS-Signal nahe Null liegt.Öffnen Sie als Nächstes den Verzögerungsmanager-Dialog in der OPO-Steuerungssoftware und scannen Sie das Olivenöl, wobei Sie die Verzögerungsstufe abstimmen, bis das Olivenöl-SRS-Signal sein Maximum erreicht. Stoppen Sie dann den Scanvorgang und klicken Sie im Dialogfeld "Verzögerungsmanager" auf die Schaltfläche "Daten hinzufügen", um die aktuellen Verzögerungsdaten aufzuzeichnen. Nachdem Sie auf ähnliche Weise Verzögerungsdaten an verschiedenen Raman-Verschiebungen durch die Abbildung verschiedener chemischer Proben erfasst haben, wählen Sie die Datenanpassung in der Reihenfolge fünf im Verzögerungsmanagerdialogfeld, um die aktuellen Datenpunkte mit der polynomischen Funktion fünfter Ordnung abzugleichen.Wenden Sie dann die angepassten Daten an, indem Sie auf die Schaltfläche Als benutzerdefiniert verwenden klicken und das Kontrollkästchen aktivieren. Die Verzögerungsstufe wird bei verschiedenen Wellenlängen entsprechend der angepassten Verzögerungskurve automatisch angepasst. Für die In-vivo-Bildgebung fixieren Sie die Maus auf der Stabilisierungsstufe, wobei ihr Rückenmark freigelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht ist.Montieren Sie nun die Stabilisierungsstufe auf einer Fünf-Achsen-Stufe unter dem TPEF-SRS-Mikroskop. Sichern Sie dann den Mauskopf mit zwei Kopfstangen und senken Sie die Halteplatte ab, um genügend Platz für Brustbewegungen während der Atmung zu bieten und Bewegungsartefakte zu lindern. Als nächstes passen Sie das Z-Translationsstadium an, um den Fokus so einzustellen, bis das Hellfeldbild der Rückenmarksvaskulatur unter einem 10X-Objektiv beobachtet werden kann.Lokalisieren Sie die Rückenmarksvene in der Mitte des Sichtfeldes, indem Sie die zweiachsige Translationsstufe der fünfachsigen Stufe abstimmen. Passen Sie als Nächstes die Roll- und Nickwinkel der Fünf-Achsen-Stufe an, um die Rückenmarksoberfläche senkrecht zur Objektivachse basierend auf dem Hellfeldbild anzupassen. Ersetzen Sie dann das 10X durch ein 25X Wassertauchobjektiv für die TPEF-SRS-Bildgebung.Für die SRS-Bildgebung wählen Sie den Polarisationsstrahlteiler über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Wählen Sie für die TPEF-Bildgebung den dichroitischen Spiegel D2 über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Stellen Sie abschließend die Bildgebungsparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und beginnen Sie mit dem Scannen der Probe.In vivo zeigte die dual-modale Bildgebung von spärlich markierten YFP-Axonen und Myelinscheiden im Rückenmark der Maus, dass die Axone eng von einer dicken Schicht von Myelinscheiden umwickelt sind. Wie im TPEF-SRS-Rückenmarksbild zu sehen ist, haben die Knoten von Ranvier einen verringerten axonalen Durchmesser und das Axilemma ist direkt der extrazellulären Matrix ausgesetzt. In Kombination mit neuen Sonden für Fluoreszenz und SRS-Bildgebung mit Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz kann die SRS-Mikroskopie eine gleichzeitige strukturelle und funktionelle Bildgebung verschiedener Biomoleküle erreichen, was unser Verständnis komplexer biologischer Prozesse erleichtert.

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Espinoza, R., et al. Zweifarbige, zweifarbige Raman-Streubildgebung des Gehirns von Mäusen für die Gewebediagnostik. J. Vis. exp. (2022).  Das Video zeigt die zweifarbige Bildgebung der stimulierten Raman-Streuung (SRS) von Hirngewebeschnitten von Mäusen. Zwei synchronisierte Laserstrahlen werden auf den Gewebeschnitt gerichtet, um molekulare Schwingungen anzuregen, was zu einer relativen Intensitätsänderung der Strahlen führt. Lipide und Proteine im Gewebe werden mit Hilfe...

Zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung von Hirngewebe von Mäusen

Coherent Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie auf Basis von Eigenschwingung von Molekül Bindungen erlaubt die markierungsfreie chemisch selektive Live Cell Imaging. Diese Arbeit stellt die Implementierung einer komplementären Mikroskopietechnik auf einem Standard-Multiphotonen-Laserrastermikroskop auf Basis eines Femtosekunden- Ti: Saphir-Laser und einem OPO-Laser.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

In diesem Manuskript wird die Implementierung eines stimulierten Raman-Streumikroskops (SRS) beschrieben, das durch die Integration eines SRS-Experimentalaufbaus mit einem Laser-Scanning-Mikroskop gewonnen wurde. Das SRS-Mikroskop basiert auf zwei Femtosekunden (fs) Laserquellen, einem Ti-Sapphire (Ti:Sa) und einem synchronisierten optischen parametrischen Oszillator (OPO).

Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ermöglicht eine selektive, markierungsfreie Abbildung bestimmter chemischer Bestandteile und wurde effektiv zur Abbildung von Lipidmolekülen in vivo eingesetzt. Hier geben wir eine kurze Einführung in das Prinzip der SRS-Mikroskopie und beschreiben Methoden zu deren Einsatz bei der bildgebenden Lipidspeicherung bei Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Die elektronische präresonanzstimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen ist eine neue Plattform für die hochgradig gemultiplexte Epitop-basierte Proteinbildgebung. Hier stellen wir einen praktischen Leitfaden vor, der die Antikörpervorbereitung, die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage und die EPR-SRS-Gewebebildgebung umfasst.

Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Aufnahme chemischer Bilder mit breitbandig stimulierter Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie. Basierend auf einem SRS-Mikroskop, das mit differentieller Mehrkanal-Lock-in-Detektion arbeitet, beschreibt das Protokoll die Probenvorbereitung, die Anpassung der SRS-Vorrichtung und die Chemometrie, um verschiedene Bestandteile chemisch heterogener Proben zu entwirren.

Chemische Multiplex-Bildgebung auf Basis einer breitbandstimulierten Raman-Streumikroskopie

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Erfahren Sie die kombinierte Zwei-Photonen-Fluoreszenz- und stimulierende Raman-Streumikroskopie zur bildgebenden Darstellung zellulärer Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse. Diese duale Methode liefert biochemische und biophysikalische Informationen für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie (Video) | JoVE Journal

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

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