Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

Bereits existierende Antikörper, die AAV neutralisieren, stellen ein Hindernis für die Weiterentwicklung von AAV-Gentherapien dar. Dieser Assay ist ein Screening-Tool zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV. Der Hauptvorteil ist, dass es kostengünstig, zeiteffizient und einfach einzurichten ist und minimale technische Fähigkeiten, Laborgeräte und Reagenzien erfordert.

Beginnen Sie am ersten Tag mit der Beschichtung von HT1080-Zellen, indem Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 auf die fünften Zellen pro Milliliter in vorgewärmten kompletten DMEM-Medien verdünnen. Dann säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in klare 96-Well-Platten mit flachem Boden bis zur Konzentration von 1 x 10 auf die vierten Zellen pro Vertiefung. Die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht für 16 bis 22 Stunden inkubieren.

Erzeugen Sie am zweiten Tag serielle Verdünnungen der interessierenden Serumproben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von vorgewärmtem vollständigem DMEM. Zu jedem Röhrchen mit verdünnten Serumproben werden 66 Mikroliter der 7,5x10 zu den sechs viralen Genomen pro Mikroliter-Virus-Arbeitslösung gegeben. Mischen Sie die Virusserumverdünnung durch Pipettieren und legen Sie dann die Röhrchen, die die Virusserummischungen enthalten, in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 30 Minuten, um eine mögliche Neutralisation zu ermöglichen.

Nach 30 Minuten 100 Mikroliter der Virusserummischung zu jeder Vertiefung auf der 96-Well-Platte, die 1x10 zu den vierten Zellen pro Vertiefung enthält, pipettieren und dann die Platte in eine Folie wickeln, um sie in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht für 16 bis 24 Stunden zu legen. Am dritten Tag saugen Sie das Medium mit einem Abzugsvakuum aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte ab, ohne die anhaftenden Zellen zu stören, und geben Sie 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Nachdem Sie den Teller in Folie eingewickelt haben, lassen Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Später waschen und aspirieren Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur. Nach der zweiten Wäsche werden 200 Mikroliter vorgewärmtes PBS in jede Vertiefung pipettiert und die Platte in Folie gewickelt, gefolgt von einer Inkubation bei 65 Grad Celsius für 90 Minuten, um die endogene alkalische Phosphataseaktivität zu denaturieren, nach inkubiert bei 50 Mikrolitern des frisch zubereiteten gelösten BCIP/NBT in jede Vertiefung und die verpackten Platten bei Raumtemperatur für zwei bis 24 Stunden inkubiert. Machen Sie später Fotos von jedem Bohrloch mit einem 4-fachen Objektiv in einer Lichtmikroskopkamera, um die konsistente Verwendung der gleichen Belichtungs-, Weißabgleich- und Lichteinstellungen für alle Assays sicherzustellen.

Um das Bild in ImageJ zu analysieren, wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf Öffnen. Konvertieren Sie für die farbigen Bilder in Graustufen, indem Sie die Registerkarten Bild, Typ und 8-Bit in der richtigen Reihenfolge auswählen. Gehen Sie dann zur Registerkarte Bild und wählen Sie Anpassen und Schwellenwert, um den Schwellenwert zu ändern, bis alle farbigen Bereiche farbig und rot sind, der Hintergrund jedoch nicht.

Klicken Sie auf Analysieren und Messungen festlegen und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Fläche, Flächenanteil, Grenzwert und Anzeigebeschriftung, bevor Sie auf OK.To den Signalwert einer bestimmten Vertiefung zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren und messen, damit die prozentuale Flächenspalte des Popup-Fensters den Signalwert anzeigt. Die Studie ermittelte die optimale Virusdosis durch Zugabe des AAV6-hPLAP-Reportergens in den Zellen in einer Reihe von Konzentrationen des viralen Genoms. Eine Vielzahl von Infektionen von 15.000 ergab eine Plattenfärbung von 36% und wurde als optimale Virusdosis ausgewählt.

Die repräsentative Analyse zeigt die Korrelation zwischen Färbung und Multiplizität der Infektion. Die höchste getestete Konzentration, die die lineare Korrelation zwischen Färbung und Viruskonzentration nicht beeinflusste, wurde erhalten. Die Untersuchung der neutralisierenden Aktivität an einem monoklonalen Anti-AAV6-Antikörper gegen das Adeno-assoziierte Virus oder AAV6 bei log 10-Verdünnung zeigte eine 50%ige Hemmung der AAV6-Transduktion oder TI50 bei einer Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter.

Im neutralisierenden Antikörper- oder NAb-Assay variierte der Grad der AAV-Neutralisation innerhalb der naiven Probenpopulation mit TI50-Titerwerten von 1/2 bis 1/80. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass die TI50-Titerwerte der AAV-Hemmung vor der Verabreichung der AAV zwischen 1/4 und 1/80 lagen. Nach AAV-Verabreichung stieg der TI50-Titer auf zwischen 1/2000 und mehr als 1/32.000, was einen deutlichen Kontrast der Titerwerte zwischen der Prä- und Post-AAV-Verabreichung zeigt.

Beim Fotografieren der Bohrlöcher ist es wichtig, während des gesamten Tests konsequent die gleichen Mikroskopeinstellungen zu verwenden und sicherzustellen, dass die Fotos direkt in der Mitte der Vertiefungen aufgenommen werden.