Name: Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie die FRET-Mapping-Methodik zur Identifizierung von Ligandenbindungsstellen und konformationellen Änderungen in Proteinen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung dynamischer Bewegungen in Lösung und erweitert strukturbiologische Erkenntnisse erheblich.

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Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health-Zuschuss R15GM135904 (verliehen an IM) und den National Institutes of Health Grant GM110552 (an DBO vergeben) unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Durch die Verwendung der FRET-Mapping-Methodik identifizierten wir die Signalsequenz-Bindungsstelle auf dem SecA-Protein. Wichtig ist, dass das Vorhandensein einer 3D-Kristallstruktur des Komplexes unsere Studie erheblich erleichtert hat. Die Stärke dieser Mapping-Methodik liegt in der Fähigkeit, eine vorhandene Struktur zu verwenden, um Standorte für die Kennzeichnung zu identifizieren. Diese Methodik kann nicht verwendet werden, um eine 3D-Struktur zu bestimmen; Die Bestimmung der Strukturelemente 56, die Verfeinerung ...

Für Proteine führt die Aufklärung der Dynamik zusammen mit 3-dimensionalem (3-D) Strukturwissen zu einem verbesserten Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen biomolekularer Systeme. Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie und kryogene Elektronenmikroskopie erfassen eine statische Struktur und erfordern häufig die Bestimmung mehrerer Strukturen, um Aspekte der Biomolekülbindung und -dynamik aufzuklären1. In diesem Artikel wird eine lösungsbasierte Methode zum Zuordnen globaler Strukturelemente wie Bindungsstellen oder Bindungsinteraktionen erläutert, die potenziell vorübergehender sind und von statischen Methoden weniger leicht erfasst werden können. Starke Kandidatensysteme für diese Methodik sind solche, bei denen eine 3D-Struktur zuvor durch Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie oder andere Strukturmethoden bestimmt wurde. In diesem Fall nutzen wir die Röntgenkristallstruktur des SecA-SecYEG-Komplexes, einem zentralen Akteur im allgemeinen Sekretionsweg des Proteins, um die Position einer Signalpeptid-Bindungsstelle mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) vor dem Transport des Präproteins über die Membranabzubilden 2. Die Manipulation des biologischen Systems durch genetische Modifikationen in Verbindung mit unserem Wissen über die 3-D-Struktur ermöglichte die Bestimmung der Konformation der Signalsequenz und der frühen reifen Region unmittelbar vor dem Einfügen in den Kanal 3.
FRET beinhaltet die strahlungslose Übertragung von Energie von einem Molekül (Donor) zu einem anderen (Akzeptor) in einer entfernungsabhängigen Weise, die durch Raum 4,5 erfolgt. Die Effizienz dieses Transfers wird entweder durch eine Abnahme des Spenders oder eine Erhöhung der Akzeptorfluoreszenzintensität überwacht. Die Effizienz der Energieübertragung kann wie folgt beschrieben werden:
E = R 0 6/(R0 6 + R 6)
wobei derR0-Wert der Abstand ist, bei dem die Übertragung einen Wirkungsgradvon 50 % aufweist 6. Die Technik wurde zuvor als molekulares Lineal beschrieben und ist wirksam bei der Bestimmung von Abständen im Bereich von 2,5-12 nm, abhängig von der Identität der Spender-Akzeptor-Farbstoffe 4,7,8,9. Die Fluoreszenzintensitäten und Lebensdauern des Spenders mit oder ohne Akzeptor ermöglichen die Bestimmung der Transfereffizienzen und folglich der Abstände 5,8. Aufgrund der Verfügbarkeit der Technologie, der Empfindlichkeit der Methode und der Benutzerfreundlichkeit hat FRET auch breite Anwendung in Bereichen wie der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der konfokalen Mikroskopiegefunden 6. Das Aufkommen fluoreszierender Proteine wie grün fluoreszierendes Protein hat die Beobachtung der intrazellulären Dynamik und der Lebendzellbildgebung relativ einfach gemacht10,11. Viele FRET-Anwendungen wie diese werden in dieser virtuellen Ausgabe ausführlich diskutiert.
In dieser Studie konzentrieren wir uns insbesondere auf die Verwendung von FRET-Messungen, um Abstandswerte zur Bestimmung struktureller Details zu erhalten. Bisher wurden FRET-Messungen effektiv verwendet, um die Konformation von DNA-Molekülen zu bestimmen, wenn sie an Protein 12,13,14, die interne Dynamik von Proteinen und Proteinbindungsinteraktionen 15,16,17 gebunden sind. Die Vorteile dieser Methode liegen in der Fähigkeit, flexible und dynamische Strukturelemente in einer Lösung mit relativ geringen Materialmengen zu bestimmen. Bezeichnenderweise ist diese Methode besonders effektiv, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen Strukturinformationen verwendet wird, und kann nicht als Mittel zur 3D-Strukturbestimmung verwendet werden. Die Methode bietet den besten Einblick und die beste Verfeinerung der Struktur, wenn die Arbeit auf vorhandenen Strukturinformationen aufbaut, die häufig mit einer computergestützten Simulation gekoppelt sind18,19. Hierbei wird die Verwendung von Abständen beschrieben, die aus stationären und zeitaufgelösten FRET-Messungen gewonnen werden, um eine Bindungsstelle, deren Lage nicht bekannt war, auf einer bestehenden kristallographischen Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes, Hauptproteinen im allgemeinen sekretorischen Weg3, abzubilden.
Der allgemeine sekretorische Weg, ein hochkonserviertes System von Prokaryoten über Eukaryoten bis hin zu Archaeen, vermittelt den Transport von Proteinen entweder über oder in die Membran zu ihrem funktionellen Ort in der Zelle. Für gramnegative Bakterien, wie E. coli, den in unserer Studie verwendeten Organismus, werden Proteine in das Periplasma eingeführt oder über diese transloziert. Der bakterielle SecY-Kanalkomplex (Translokon genannt) koordiniert sich mit anderen Proteinen, um das neu synthetisierte Protein zu translozieren, das durch eine Signalsequenz, die sich typischerweise am N-Terminus20,21 befindet, zu seiner korrekten Position in der Zelle geleitet wird. Für Proteine, die für das Periplasma gebunden sind, assoziiert das ATPase SecA-Protein mit dem Austrittstunnel des Ribosoms und mit dem Präprotein, nachdem etwa 100 Reste transzitiert wurden22. Zusammen mit dem SecB-Chaperonprotein hält es das Präprotein in einem entfalteten Zustand. SecA bindet an den SecYEG-Translokon und erleichtert durch viele Zyklen der ATP-Hydrolyse den Proteintransport über die Membran23,24.
SecA ist ein Multi-Domain-Protein, das in zytosolischer und membrangebundener Form vorkommt. SecA ist ein homodimeres Protein im Zytosol und besteht aus einer Präproteinbindungs- oder Vernetzungsdomäne25, zwei Nukleotid-bindenden Domänen, einer helikalen Flügeldomäne, einer spiralförmigen Gerüstdomäne und dem Zwei-Helix-Finger (THF) 26,27,28,29 (Abbildung 1). In früheren kristallographischen Studien des SecA-SecYEG-Komplexes deutete die Lage des THF darauf hin, dass er aktiv an der Proteintranslokation beteiligt war, und nachfolgende Vernetzungsexperimente mit dem Signalpeptid belegten die Bedeutung dieser Region bei der Proteintranslokation30,31. Frühere Studien unter Verwendung der FRET-Mapping-Methodik zeigten, dass exogene Signalpeptide an diese Region von SecA 2,32 binden. Um die Konformation und Lage der Signalsequenz und der frühen reifen Region des Präproteins vor dem Einfügen in den SecYEG-Kanal vollständig zu verstehen, wurde eine Proteinchimäre erstellt, in der die Signalsequenz und die Reste der früh reifen Region durch einen Ser-Gly-Linker an SecA gebunden wurden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieses biologisch lebensfähigen Konstrukts wurde weiter gezeigt, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins parallel an den THF binden2. Anschließend wurde die FRET-Mapping-Methodik verwendet, um die Konformation und Position der Signalsequenz und der frühen reifen Region in Gegenwart von SecYEG aufzuklären, wie untenbeschrieben 3.
Die Kenntnis der 3D-Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes33,34,35 und der möglichen Lage der Bindungsstelle ermöglichte es uns, Spender-Akzeptor-Etiketten umsichtig an Orten zu platzieren, an denen der Schnittpunkt einzelner FRET-Entfernungen den Standort der Bindungsstelle identifiziert. Diese FRET-Mapping-Messungen zeigten, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins eine Haarnadel bilden, wobei sich die Spitze an der Mündung des SecYEG-Kanals befindet, was zeigt, dass die Haarnadelstruktur vor dem Einfügen des Kanals mit einer Vorlage versehen ist.

<table><tbody><tr><td>490 nm LED-Laser</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimid//DIBO Alkinen</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimid/DIBO Alkinen</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkinen</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy; 4 Zentrifugalfilter (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltosid (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310<</td><td></td></tr><tr><td>em>E. coli alkalisches Phosphatase-Signalpeptid SP22</td><td>Biomoleküle Midwest</td><td>N/A</td><td>Synthetisiertes</td></tr><tr><td>kundenspezifisches Peptid mit erweitertem Signalpeptid SP41</td><td>Biomoleküle Midwest</td><td>N/A</td><td>Synthetisiertes kundenspezifisches Produkt</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Horiba</td><td>Version 2.4</td><td>Spektralaufnahmeprogramm für Fluoromax4 Spektrofluorometer</td></tr><tr><td>Fluoromax 4 Spektrofluorometer</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td><td></td><td>Spektralanalyseprogramm für zeitaufgelöste Zerfälle</td></tr><tr><td>H&shy; 4&schüchtern; Azido&schüchtern; Pheu & schüchtern; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 kolloidales Siliciumdioxid (40 Gew.-% Suspension in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>Verdünnung ist erforderlich, um eine geeignete Streulösung herzustellen</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>Version 4.1.0.4096</td><td>spektrales Erfassungsprogramm für PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Instrument</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Molekulares Grafikprogramm</td><td>Schrödinger</td><td>Version 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

förster resonance energy transfer mapping: eine neue methodik zur aufklärung globaler strukturmerkmale

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist eine etablierte fluoreszenzbasierte Methode, mit der Abstände in und zwischen Biomolekülen sowohl in vitro als auch innerhalb von Zellen erfolgreich gemessen werden. In FRET bezieht sich die Effizienz der Energieübertragung, gemessen an Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer, auf den Abstand zwischen zwei fluoreszierenden Molekülen oder Markierungen. Die Bestimmung von Dynamik und Konformationsänderungen aus den Entfernungen sind nur einige Beispiele für die Anwendung dieser Methode auf biologische Systeme. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Methodik bestehende Röntgenkristallstrukturen ergänzen und verbessern, indem sie Informationen über Dynamik, Flexibilität und Anpassung an Bindungsoberflächen liefert. Wir beschreiben die Verwendung von FRET und zugehörigen Entfernungsbestimmungen zur Aufklärung struktureller Eigenschaften durch die Identifizierung einer Bindungsstelle oder der Orientierungen von Dimer-Untereinheiten. Durch die umsichtige Auswahl der Markierungsstellen und oft den Einsatz mehrerer Markierungsstrategien haben wir diese Mapping-Methoden erfolgreich angewendet, um globale strukturelle Eigenschaften in einem Protein-DNA-Komplex und dem SecA-SecYEG-Proteintranslokationssystem zu bestimmen. Im SecA-SecYEG-System haben wir FRET-Mapping-Methoden verwendet, um die Präproteinbindungsstelle zu identifizieren und die lokale Konformation der gebundenen Signalsequenzregion zu bestimmen. Diese Studie beschreibt die Schritte zur Durchführung von FRET-Mapping-Studien, einschließlich der Identifizierung geeigneter Markierungsstellen, der Diskussion möglicher Markierungen einschließlich nicht-nativer Aminosäurereste, der Markierungsverfahren, der Durchführung von Messungen und der Interpretation der Daten.

Diese Studie konzentrierte sich auf die Bestimmung der Position der Präproteinbindungsstelle auf SecA vor dem Einfügen des Präproteins in den SecYEG-Kanal. Um die Bindungsstelle zu kartieren, wurden FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen an den Proteinen SecA und SecYEG durchgeführt (Abbildung 1A-D). Aus den erhaltenen Entfernungen und dreidimensionalen Strukturen von SecA, SecYEG und dem Präprotein wu...

Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Wir haben eine FRET-Mapping-Methodik entwickelt, die die Identifizierung und Charakterisierung von Ligandenbindungsstellen, Untereinheitenorientierung, Konformationsänderungen im Zusammenhang mit der Ligandenbindung und dynamischen Bewegungen von Proteinen ermöglicht. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie in Lösung durchgeführt werden kann und die Moleküle sich frei bewegen können. Die mit dieser Technik gemessenen Entfernungen sind für biologische Systeme geeignet.FRET ist weitgehend auf viele Systeme anwendbar. Die Kartierung verbessert die Überwachung struktureller und dynamischer Veränderungen in jedem biomolekularen System und ist besonders effektiv, wenn dreidimensionale Strukturinformationen vorhanden sind. Nach der Reinigung des Proteins ist der schwierigste Teil das Markieren mit hoher Effizienz und das Entfernen des freien Farbstoffs.Für die Experimente hilft es, so wenig freien Farbstoff wie möglich zu haben. Wählen Sie zunächst Markierungsstellen innerhalb von 25 bis 75 Angström der Strafbindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins. Der Abstand bestimmt das spezifische FRET-Farbstoffpaar, das verwendet werden soll.Lokalisieren Sie die Markierungsstellen in Proteinregionen, die sich relativ voneinander unterscheiden. Die Standorte beschreiben also die Eckpunkte eines Dreiecks, wobei sich die Strafbindungsstelle in der Mitte befindet. Um die R0-Werte zu messen, bereiten Sie je nach gewünschter Küvettengröße und -volumen zwei Proteinproben mit der gleichen Konzentration des Gesamtproteins vor.Eines mit dem Protein, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, und eines mit dem Protein, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Schalten Sie das Fluorometer ein und öffnen Sie das Spektralerfassungs- und Analyseprogramm in der FluorEssence-Software, wenn Sie ein Spektrofluorometer verwenden. Klicken Sie auf das rote M, um den Computer mit dem Gerät zu verbinden, und wählen Sie Emissionsspektren.Geben Sie über das Menüelement Experiment erfassen Scanparameter ein, z. B. Anregungswellenlänge, den Bereich für den Emissionsscan, Temperatur und Probenänderung Ihrer Position. Klicken Sie auf RTC und optimieren Sie die Instrumenteneinstellungen, wie im Manuskript beschrieben, indem Sie die Fluoreszenzemission am Peak mit einer Anregungswellenlänge überwachen, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs eingestellt ist. Legen Sie die vom Spender markierte Proteinprobe in den Probenhalter und klicken Sie auf Ausführen, um einen Emissionsscan des Proteins zu erstellen, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, indem Sie die Probe am Farbstoffabsorptionsmaximum anregen und über die Emissionsspitze scannen.Legen Sie eine Baseline für den Scan fest, indem Sie den Scan um 25 bis 50 Nanometer über das Ende des Peaks hinaus verlängern. Messen Sie die Quantenausbeute des reinen Spenderproteins, indem Sie Absorptions- und Fluoreszenzmessungen an Proben unterschiedlicher Konzentration durchführen, wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie nur Spenderprotein, Akzeptorprotein und Spender-Akzeptor-Proteinproben in der gleichen Konzentration vor.Holen Sie sich den Spenderscan, um Fluoreszenzemissionsspektren zu erzeugen. Stimulieren Sie die Lösung am maximalen Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs und scannen Sie die Abgaben- und Akzeptoremissionsspitzen. Tauschen Sie entweder die Probe gegen das Akzeptorprotein aus oder ändern Sie die Probe ändern Sie Ihre Position in die Küvette, die nur das Akzeptorprotein enthält.Erhalten Sie einen Emissionsscan des Proteins, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Stimulieren Sie die Probe bei der Wellenlänge der Spenderanregung. Tauschen Sie die Probe gegen die Spender-Akzeptor-Proteinprobe aus oder ändern Sie die Probe ändern Sie Ihre Position in die Küvette, die das mit dem Spender-Akzeptor markierte Protein enthält.Erhalten Sie einen Emissionsscan der Spender-Akzeptor-Proteinprobe mit den gleichen Einstellungen. Korrigieren Sie für alle Spektren die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die am Ende des Scans gemessenen Hintergrundzahlen subtrahieren. Verwenden Sie ein grafisches 3D-Betrachtungsprogramm wie PyMOL, um die Entfernungen auf die Struktur abzubilden, indem Sie die Befehle aus dem Skript direkt in das Befehlsfenster mit den entsprechenden Abstandsinformationen eingeben.Generieren Sie eine Shell für jede gemessene Entfernung und den zugehörigen Fehler. Bilden Sie die Position durch den Schnittpunkt der verschiedenen Schalen ab. Die Signalpeptid-Bindungsstelle wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Positionen auf SecA und SecYEG und vier verschiedenen Positionen auf dem Signalpeptid kartiert.FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen auf den SecA- und SecYEG-Proteinen bilden die Präproteinbindungsstelle und -orientierung ab. Die Strafbindungsstelle des Signalpeptids wurde zuvor als Zwei-Helix-Finger identifiziert, und der SecA C-terminale Schwanz schlug eine Orientierung parallel zum Zwei-Helix-Finger vor. Steady-State-FRET-Spektren zwischen SecA37 und PhoA2 und PhoA22 wurden erhalten.Die Verringerung der Spenderintensität deutete darauf hin, dass eine größere Energie von PhoA22 übertragen wird. Relativ zum PhoA2-Standort, der weiter von SecA37 entfernt liegt. Zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfallsspektren zeigten, dass der Donor-Akzeptor-Komplex einen kürzeren homogenen Zerfall aufweist, der mit einem Energietransfer übereinstimmt, der mit einer Entfernung verbunden ist.FRET-Distanzschalen, die zwischen dem SecA-PhoA2-Rest und den triangulierten Stellen konstruiert wurden, zeigten, dass sich jede Schale mit dem Zwei-Helix-Finger, der angenommenen Bindungsstelle, schneidet, die grün dargestellt ist. Der Schnittbereich ist kleiner als jede FRET-Schale und enthält einen großen Beitrag des spiralförmigen Gerüsts. FRET-Distanzschalen, die zwischen dem PhoA2-Rückstand und den markierten Stellen bestimmt werden, beschreiben einen kleineren Bereich, der sich näher an der Spitze des Zwei-Helix-Fingers und der Mündung des SecYEG-Kanals befindet.Dieser sich kreuzende Bereich befindet sich am gegenüberliegenden Ende des Zwei-Helix-Fingers von PhoA2. Zu den wichtigen Dingen, die zu berücksichtigen sind, gehört die richtige Auswahl der Kennzeichnungsstellen, um den Interessenbereich zu triangulieren, die Quantenausbeuten für jeden Standort zu messen und den gesamten freien Farbstoff zu entfernen. Diese Methode stimmt mit Strukturinformationen überein, die mit Methoden wie NMR oder Röntgenkristallographie erhalten wurden.Wenn die FRET-Ergebnisse in einen strukturellen Kontext gestellt werden, können die vorhandenen Informationen verbessert werden.

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Forschung

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Biochemistry

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