Name: Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Glycine max mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie. Diese Technik ermöglicht die schnelle Bewertung genetischer Vielfalt in Pflanzenzuchtprogrammen.

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Diese Arbeit wird durch das Forschungsprojekt Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE) unterstützt, das von der Bill & Melinda Gates Foundation, der Foundation for Food and Agriculture Research und dem U.K. Foreign, Commonwealth & Development Office unter der Fördernummer OPP1172157 finanziert wird.

1. Saatgutpflanzung
<ol><li>Wählen Sie einen Feldstandort mit fruchtbarem, gut durchlässigem, aber nicht sandigem Boden und einem pH-Wert von fast 6,5. Markieren Sie 1,2 m Reihendiagramme mit 0,75 m Abstand, indem Sie den Boden mit einer Hacke ritzen.</li>
	<li>Pflanzen Sie 50 Samen/m von G.max cv. IA3023 in 3 cm Tiefe entlang jeder Parzelle zu Beginn der Vegetationsperiode, wenn die Bodentemperaturen zwischen 25 und 30 °C liegen. HINWEIS: Für das Screening der genetischen Vielfalt wird erwartet, dass mehrere verschiedene Genotypen gezüchtet und verglichen werden. Pflanze 2-5 Reihen pro Genotyp, die in einem zufälligen Blockdesign angeordnet sind. Es sollte berücksichtigt werden, ob die klimatischen Bedingungen für das Wachstum von Sojabohnen geeignet sind, einschließlich Bodentyp, Temperatur und Tageslänge.</li>
</ol>2. Blattproben vom Feld sammeln
<ol><li>Probieren Sie die Pflanzen 30 Tage nach der Keimung am Feldstandort aus. HINWEIS: Nach 30 Tagen befinden sich Sojabohnenpflanzen in der vegetativen Phase. Die Anzahl der Tage nach der Keimung vor der Probenahme hängt von der biologischen Frage ab, die behandelt wird.</li>
	<li>Füllen Sie Brunnen einer 24-Well-Platte bis zu 1/3rd mit destilliertem Wasser. Beschriften Sie den Deckel und die Seite der Platte mit den zu beprobenden Repliken.</li>
	<li>Wählen Sie das jüngste vollständig expandierte Blatt an der Spitze der Pflanze, das beprobt werden soll. Halten Sie das Blatt gegen einen Gummistopfen.</li>
	<li>Drücken Sie einen # 2 Humboldt-Korkbohrer durch das Blatt und drehen Sie ihn, um eine Scheibe zu schneiden, während Sie die Mittelrippe vermeiden. Sammle nacheinander 5 Scheiben aus demselben Blatt für technische Replikate. Nehmen Sie ungefähr 30% mehr Blattscheiben für jede Parzelle als erforderlich, falls das Blattgewebe während des Transports oder bei der Probenahme beschädigt wird. HINWEIS: Die Anzahl der biologischen Replikate (Parzellen oder Pflanzen) und die Anzahl der technischen Replikate (Blattscheiben derselben Pflanze oder Parzelle) können je nach Versuchsplan variieren.</li>
	<li>Drücken Sie die Blattscheiben mit einem Wattestäbchen aus dem Korkbohrer in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Überprüfen Sie, ob alle Blattscheiben im Wasser schwimmen. Wenn nicht, bewegen Sie Blattscheiben, die an der Seite eines Brunnens haften, vorsichtig in eine schwimmende Position mit einem Wattestäbchen.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Plot fort und wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.5. Schieben Sie die Blattscheiben mit einem Wattestäbchen aus dem Korkbohrer in einen separaten Brunnen in einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt, um ein drittes biologisches Replikat zu sammeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6, bis eine vollständige 24-Well-Platte abgetastet wurde. Legen Sie einen Deckel auf und verschließen Sie ihn mit einer halbtransparenten, flexiblen Folie. Lagern Sie den Teller vor direkter Sonneneinstrahlung, in einem Beutel, einer Schachtel oder einem leeren Kühler (kein Eis).</li>
</ol>3. Vorbereitung der Proben für die Analyse
<ol><li>Kehren Sie nach der Probenahme in einen sauberen Laborraum zurück. Klopfen Sie auf den Deckel der versiegelten Platte, um Blattscheiben zu entfernen, die während des Transports am Deckel haften. Wickeln Sie die Folie aus und entfernen Sie den Deckel.</li>
	<li>Übertragen Sie eine Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte in eine frische 96-Well-Platte, wobei die Blattscheibe am Boden des Bohrlochs flach nach unten zeigt.</li>
	<li>Schneiden Sie einen Nasensaugerfilter in zwei Hälften. Tauchen Sie den resultierenden Filter halb in Wasser und tupfen Sie auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Setzen Sie den Filter mit der Blattscheibe in den Brunnen ein, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Nehmen Sie eine zweite Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte und platzieren Sie sie mit der Vorderseite nach unten in der nächsten verfügbaren Position der 96-Well-Platte. Tauchen Sie die restliche Hälfte des in Schritt 3.3 hergestellten Nasenfilters in Wasser und tupfen Sie es auf ein Papiertuch, bevor Sie es mit der zweiten Blattscheibe in den Brunnen einführen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4 für eine dritte Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte.</li>
	<li>Fahren Sie mit der zweiten Position der 24-Well-Platte fort und wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel auf die Platte, wenn in alle Vertiefungen Blattscheiben und Nasensaugerfilter eingesetzt sind. Kleben Sie die obere rechte Ecke ab, um die Platte im Dunkeln für die Bildgebung auszurichten.</li>
	<li>Dichten Sie Platten mit einer halbtransparenten, flexiblen Folie ab und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie. Schreiben Sie die Plot-IDs und die Platten-ID auf die Aluminiumfolie.</li>
	<li>Legen Sie die Platten für mindestens 30 Minuten in eine dunkle Box oder einen Schrank, um die Entspannung der ersten beiden Phasen des NPQ (qE, qT, qZ) zu ermöglichen. Verwenden Sie eine längere, dunkle Inkubationszeit von 1 h vor der Bildgebung, wenn Langzeitphasen des NPQ von Interesse sind.</li>
	<li>Bereiten Sie eine zusätzliche Dummy-Platte für die Fokussierung während der Analyse vor. Um dies zu tun, legen Sie eine Blattscheibe in jede der Ecken einer frischen 96-Well-Platte und eine in der Mitte. Sichern Sie Blattscheiben mit Nasenfiltern wie bei früheren Platten. Die Platte versiegeln und im Dunkeln bei Raumtemperatur (24 °C), ~50% relativer Luftfeuchtigkeit inkubieren.</li>
</ol>4. Messung der nicht-photochemischen Abschreckung mit Chlorophyll-Fluoreszenz-Imager
<ol><li>Schalten Sie den Imager ein und öffnen Sie die Imaging-Software. Klicken Sie auf Einstellungen > Protokoll, um ein Fenster für die Eingabe von Schritten im experimentellen PAM-Protokoll zu öffnen. Die technischen Spezifikationen der Maschine sind der Ergänzenden Tabelle 3 zu entnehmen.</li>
	<li>Stellen Sie das Programm so ein, dass es mit einem gesättigten Puls beginnt, um die maximale Quanteneffizienz der dunkel angepassten Photosynthese zu messen, indem Sie 20 s in die Box eingeben: Nach einer Verzögerung von. Klicken Sie auf das Feld Impuls anwenden und geben Sie 1 in das Feld ein: Diese Anzahl von Malen.</li>
	<li>Stellen Sie den Puls PPFD auf 6152, die Pulslänge auf 800 ms und aktivieren Sie das Kontrollkästchen F '& Fm 'Bilder mit allen Impulsen aufnehmen. Klicken Sie auf Einfügen nach, um dem Protokoll einen zweiten Schritt hinzuzufügen.</li>
	<li>Geben Sie 30 s in das Feld ein: Nach einer Verzögerung von. Wählen Sie die Option Aktinik ändern und geben Sie 50 in das Feld ein: Aktinische PPFD, um die Lichtintensität in der Kammer auf 50 PPFD einzustellen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Einfügen nach , um dem Protokoll einen neuen Schritt hinzuzufügen. Geben Sie 150 s in das Feld ein: Wählen Sie nach einer Verzögerung von Pulse anwenden und geben Sie 4 in das Feld ein: Diese Anzahl von Malen, um Messimpulse alle 150 s anzuwenden, 4x hintereinander, während das aktinische Licht bei 50 PPFD gehalten wird.</li>
	<li>Vollständige Informationen des Protokolls finden Sie in Tabelle 1, verwenden Sie die Schritte 4.2 und 4.3, um die Lichtintensität zu ändern, und die Schritte 4.4 und 4.5, um in Zyklen von Sättigungsimpulsen einzutreten. Passen Sie die Verzögerung und Lichtintensität für jeden Schritt entsprechend den in Tabelle 1 angegebenen Werten an. Speichern Sie Ihr Protokoll als PCL-Datei an einem bekannten Speicherort.</li>
	<li>Schalten Sie das Licht aus, legen Sie die Dummy-Platte auf den Probentisch und stellen Sie die Höhe des Probentisches so ein, dass sich die Blattscheiben 140 mm über dem Sockel des Instruments befinden. Eine Dummy-Platte wird verwendet, da beim Fokussieren wiederholt Licht auf die Platte geblitzt wird; Dies erfordert eine erneute Dunkelanpassung der zu messenden Proben und kann zu Lichtschäden führen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol Verbindung mit Imager-Kamera und Hardwarekamera verbinden/trennen, um die Kamera zu starten. Klicken Sie auf das Fokussymbol (Fluoreszenz), das durch ein rotes zweiseitiges Pfeilsymbol mit zwei grünen Linien an der Basis dargestellt wird. Passen Sie das Objektiv und die Belichtung an, um die Platte in den Fokus zu bringen.</li>
	<li>Klicken Sie erneut auf das Fokussymbol (Fluoreszenz), um das blinkende Licht auszuschalten. Wenn Sie im Dunkeln arbeiten, ersetzen Sie die Dummy-Platte durch die zu analysierende Platte.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Kamerasymbol Kartenbild . Passen Sie die Bildbelichtung an, indem Sie die Blende öffnen oder schließen, bis die Leiste im Popup-Fenster im grünen Bereich positioniert ist.</li>
	<li>Klicken Sie nach jeder Einstellung der Blende auf die Schaltfläche "Erneut versuchen ", bis die Belichtung korrekt eingestellt ist und das Instrument ein Bild aufnimmt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Bildisolierung anwenden, um Hintergrundsignale zu blockieren. Der fokussierte Blattbereich wird in Grau und der Hintergrund in Blau angezeigt.</li>
	<li>Wählen Sie den Bereich / die gewünschten Pixel aus, um nur die Blattscheiben einzuschließen, indem Sie das Histogramm und den Gammapegel im Pulldown-Menü "Bild ändern" anpassen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Hohe und niedrige Schnitte löschen (Farbkarte), um den hellblau hervorgehobenen Bereich zu löschen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Delete Strays (Heavy), um alle Pixel zu entfernen, die mindestens drei andere Pixel nicht berühren. HINWEIS: Alle Bereiche auf dem Bild, die als isolierte Inseln erscheinen, werden separat analysiert und in die endgültige Datenausgabe aufgenommen. Die Bildisolierung und das Entfernen von Streupixeln führen zu sauberen, verständlichen Daten.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol Protokoll ausführen , um das Programm zu starten, am unteren Bildschirmrand erscheint ein Timer, der Sie darüber informiert, wie lange das Protokoll noch läuft.</li>
	<li>Warten Sie, bis das Protokoll abgeschlossen ist, klicken Sie auf Datei > Speichern unter, und speichern Sie die Daten als IGR-Datei. Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf das rote Kreuz oben rechts im Fenster klicken, bevor Sie eine weitere Beispielplatte ausführen.</li>
	<li>Öffnen Sie eine neue Datei für das nächste Beispiel, indem Sie Datei > Neu auswählen, und wiederholen Sie die Schritte 4.10 bis 4.15, bis alle Platten gemessen wurden. HINWEIS: Es ist ratsam, die Platten innerhalb eines Zeitraums von 4 h oder weniger zu messen, um die potenziellen Auswirkungen der zirkadianen Regulierung auf die Ergebnisse zu minimieren.</li>
</ol>5. Verarbeitung von Chlorophyllfluoreszenzdaten
<ol><li>Öffnen Sie die IGR-Datei in der Imaging-Software. Exportieren Sie die Daten, indem Sie auf Datei > In Ordner exportieren klicken, um einen neuen Ordner mit allen erforderlichen Dateien zu erstellen.</li>
	<li>Kopieren Sie die folgenden drei MATLAB-Dateien in den resultierenden Ordner: MapAndLabelDiscs.m (Zusatzdatei 1), ProcessFoFm.m (Zusatzdatei 2) und ProcessNPQdata.m (Zusatzdatei 3) sowie die R-Datei: create_file_to_process. R (Zusatzakte 4).</li>
	<li>Öffnen Sie MapAndLabelDiscs.m (Supplementary File 1) in MATLAB und führen Sie es aus. Speichern Sie die Karte der nummerierten Blattscheiben, die in einem Popup-Fenster generiert wurden, als .png-Datei, um die Blattplattennummerierung später zu überprüfen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Datei ProcessFoFm.m (Supplementary File 2) in MATLAB und führen Sie sie aus, um die Werte F o und F m für jede Blattfestplatte zu berechnen. Führen Sie ProcessNPQdata.m (Ergänzende Datei 3) aus, um NPQ-Werte zu jedem Zeitpunkt zu berechnen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Datei create_file_to_process. R (Supplementary File 4) in Rstudio und fügen Sie das Datum in den Code in Zeile 5 ein. Fügen Sie das Kennzeichen in Zeile 8 in create_file_to_process.R hinzu</li>
	<li>Führen Sie create_file_to_process aus. R, um F v/Fm-Werte und NPQ-Daten in einer Datei zu konsolidieren, die nach den Daten mit dem Suffix -cf-summary.csv benannt ist. Überprüfen Sie die Blattdatenträgernummerierung in der cf-summary-Datei aus Schritt 5.5 mithilfe der .png Datei aus Schritt 5.3. Add-In-Informationen in Bezug auf Grundstücksnummer und Beitritt.</li>
	<li>Öffnen Sie das R-Skript CF-data-processing_2.R (Supplementary File 5) und ändern Sie Zeile 13 in den Arbeitsverzeichnispfad. Ändern Sie Zeile 16 in CF-data-processing_2.R in den Namen der Datei aus Schritt 5.5.</li>
	<li>Ändern Sie Zeile 48 in CF-data-processing_2.R in den Namen einer Ausgabedatei. Führen Sie das Skript CF-data-processing_2.R aus, um die Daten für die Kurvenanpassung neu zu formatieren.</li>
	<li>Öffnen Sie das Skript MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Supplementary File 6) in MATLAB und ändern Sie Zeile 5 auf den Namen der Ausgabedatei aus Schritt 5.8. Ändern Sie Zeile 85 in MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m in einen neuen Namen der Ausgabedatei. Führen Sie Skript MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m aus, um NPQ-Relaxationsparameter zu berechnen.</li>
</ol>

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Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten

Die sorgfältige Auswahl und Handhabung von Blattscheiben ist entscheidend, um zuverlässige Messungen des NPQ zu erhalten. Erstens führt eine Schädigung des Gewebes, wie z. B. die grobe Handhabung mit einer Pinzette, zu Stress, was zu niedrigen Werten für die maximale Quanteneffizienz der Photosynthese führt. Nicht gestresste Pflanzen haben typischerweise Fv / F m-Werte von etwa 0,83bis 18, wobei signifikante Rückgänge auf eine Verringerung der photosynthetis...

Die Photosynthese besteht aus Lichtabsorption, Primärelektronentransfer, Energiestabilisierung und der Synthese und dem Transport von photosynthetischen Produkten1. Das Verständnis jedes Schritts ist von entscheidender Bedeutung, um die Bemühungen zur Steigerung der photosynthetischen Effizienz von Pflanzen zu steuern. Licht beeinflusst die Photosyntheserate und erfordert eine ausgleichende Energieversorgung in Form von Photonen, wobei die Nachfrage nach reduzierenden Äquivalenten besteht. Wenn das Angebot die Nachfrage übersteigt, zum Beispiel bei hohem Licht oder während einer reduzierten CO 2-Fixierung, die durch einen Verschluss der Stomata verursacht wird, erhöht der Aufbau von abnehmender Leistung die Wahrscheinlichkeit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies mit dem Potenzial, den photosynthetischen Apparat zu schädigen und den Elektronentransport zu beeinträchtigen. Um Schäden zu vermeiden, haben Pflanzen daher mehrere Lichtschutzmechanismen entwickelt, darunter die Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies und die nicht-photochemische Abschreckung der angeregten Chlorophyllzustände (NPQ)2.
Die Aufrechterhaltung hoher Photosyntheseraten ist in einer Feldumgebung eine Herausforderung. Saisonale und tägliche Veränderungen, zusammen mit Umweltschwankungen wie windinduzierten Blattbewegungen und vorübergehender Wolkendecke, verursachen Verschiebungen in der Menge und Intensität des Lichts, das Pflanzen für die Photosynthese erhalten3. NPQ leitet überschüssige Lichtenergie ab und kann dazu beitragen, Lichtschäden zu vermeiden, während gleichzeitig eine anhaltende Photosyntheserate bei hohem Lichtermöglicht wird 4. Ein anhaltender NPQ während der Übergänge bei hohem bis niedrigem Licht führt jedoch weiterhin Energie ab, die für die Kohlenstoffreduktion verwendet werden könnte5. Infolgedessen kann die Beschleunigung der Relaxation von NPQ die Effizienz der Photosyntheseerhöhen 6, was die NPQ-Relaxation zu einem attraktiven Ziel für die Verbesserung der Ernte macht.
Die Analyse der pulsamplitudenmodulierten Chlorophyllfluoreszenz (PAM) kann verwendet werden, um den NPQ aus messbaren Parametern zu berechnen (Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2)7,8,9. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Bestimmung der NPQ-Entspannungsraten in Feldkulturpflanzen zum Zwecke des Screenings der natürlichen Variation im Keimplasma. Die PAM-Chlorophyll-Fluorometrie-Analyse kann jedoch auch für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, die auf Arten von Algen bis hin zu höheren Pflanzen angewendet werden, und wird an anderer Stelle überprüft 7,8,9.
In einem dunkel angepassten Blatt oder einer dunkel angepassten Zelle sind die Reaktionszentren des Photosystems II (PSII) offen, um Elektronen zu empfangen, und es gibt keinen NPQ. Das Einschalten eines Messlichts mit geringer Intensität löst Chlorophyllfluoreszenz aus, während der Elektronentransport durch PSII vermieden wird. Die aufgezeichnete minimale Fluoreszenz in diesem dunkelangepassten Zustand wird durch den Parameter Fo beschrieben. Das Anlegen eines hochintensiven Lichtpulses an ein dunkel angepasstes Blatt kann den ersten stabilen Elektronenakzeptorpool von Chinonen, die an die Chinon-A-Stelle gebunden sind, schnell reduzieren. Dies blockiert vorübergehend die Elektronentransferkapazität in PSII-Reaktionszentren, von denen dann gesagt wird, dass sie geschlossen sind und keine Elektronen aus der Wasserspaltung empfangen können. Durch die Verwendung einer kurzen Pulsdauer bleibt nicht genügend Zeit, um den NPQ zu stimulieren. Die resultierende Chlorophyllfluoreszenz entspricht dem maximalen Wert, der in Abwesenheit von NPQ oder maximaler Fluoreszenz F m erreicht werden kann. Die Differenz zwischen minimaler und maximaler Fluoreszenz wird als variable Fluoreszenz, Fv. Die maximale photochemische Quantenausbeute des Photosystems II (F v/Fm) wird aus diesen beiden Parametern unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
Dies kann einen wichtigen Indikator für die Funktion und Belastung des Photosystems liefern. Das Einschalten eines aktinischen (photosynthetischen) Lichts stimuliert die nicht-photochemische Abschreckung, und die anschließende Anwendung eines Sättigungsblitzes ermöglicht die Messung der lichtangepassten maximalen Fluoreszenz, Fm'. Durch den Vergleich der Differenz zwischen dunkler und lichtangepasster maximaler Fluoreszenz kann der NPQ nach der Stern-Volmer-Gleichung10 berechnet werden:
NPQ = F m/Fm'- 1
In höheren Anlagen wurde NPQ als aus mindestens fünf verschiedenen Komponenten bestehend beschrieben, darunter qE, qT, qZ, qI und qH. Die genauen Mechanismen, die mit dem NPQ verbunden sind, sind nicht vollständig verstanden; qE gilt jedoch in den meisten Anlagen als Hauptkomponente des NPQ. Zu den entscheidenden Faktoren für das vollständige Engagement von qE gehören der Aufbau eines Protonengradienten über die Thylakoidmembran, die Aktivität der Photosystem II-Untereinheit S 11,12 und de-epoxidierte Xanthophylle, Antheraxanthin, Lutein und insbesondere Zeaxanthin13. qE entspannt die schnellste aller NPQ-Komponenten (< 2 min)14, und die reversible Aktivierung von qE ist daher besonders wichtig für die Anpassung an wechselnde Lichtintensitäten. Eine zweite langsamere Phase der NPQ-Relaxation (~ 2-30 min) umfasst sowohl qT, bezogen auf Zustandsübergänge, als auch qZ, einschließlich der Interkonversion von Zeaxanthin zu Violaxanthin15. Langsame Entspannung (> 30 min) von NPQ kann sowohl photoinhibitorisches Quenching (qI)16 als auch Prozesse unabhängig von Lichtschäden 17,18 umfassen, wie qH, das ein anhaltendes Abschrecken in den peripheren Antennen von PSII ist, das durch ein plastides Lipocalinprotein 19,20 vermittelt wird.
Der NPQ steigt bei starker Lichteinstrahlung. Die anschließende Übertragung auf schwaches Licht kann zu einer Herunterregulierung des NPQ führen. Der Zerfall von schnellen, mittleren und langsamen Entspannungsphasen kann in den Parametern einer biexponentiellen Funktion erfasst werden 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Die theoretische Grundlage für die biexponentielle Funktion basiert auf der Annahme der Verwendung hypothetischer Quencher erster Ordnung, einschließlich qE (Aq1), der kombinierten Relaxation von qZ und qT (Aq2) mit den entsprechenden Zeitkonstanten τq1 und τq2 und des langfristigen NPQ, der qI- und photoschadenunabhängige Prozesse (Aq3) umfasst. Daher bietet die biexponentielle Funktion eine realistischere Darstellung der mehreren miteinander verbundenen biologischen Prozesse, die an der Abschreckung der Chlorophyllfluoreszenz beteiligt sind, verglichen mit einer einfacheren Hill-Gleichung, der eine theoretische Grundlage fehlt24.
Der NPQ kann mit einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen PAM-Fluorometern25,26 gemessen werden, von einfachen Handgeräten 27 bis hin zu fortschrittlicheren geschlossenen Systemen 28. Eine Einschränkung einiger dieser Ansätze ist jedoch ein relativ niedriger Durchsatz, was das Screening großer Pflanzensammlungen ohne mehrere Geräte und ein Forscherteam schwierig macht. Um dieses Problem anzugehen, entwickelten McAusland et al. ein Verfahren, das auf ausgeschnittenem Blattgewebe basierte, und nutzten es, um Unterschiede in der Chlorophyllfluoreszenz zwischen zwei Weizensortenzu identifizieren 29. Der Reiz dieses Ansatzes besteht darin, dass die Abbildung von Blattscheiben, die mit einem einzigen Gerät von mehreren Pflanzen stammen, das Screening von Hunderten von Genotypen innerhalb eines Tages erleichtern kann. Dies ermöglicht es, die Variation der NPQ-Relaxation im Rahmen genomweiter Assoziationsstudien oder für das Screening von Zuchtpopulationen zu bewerten, die das Potenzial haben, die photosynthetische Effizienz und letztendlich den Ertrag von Pflanzen zu steigern.
Aufbauend auf den Erkenntnissen von McAusland et al.29 verwenden wir die PAM-Chlorophyllfluoreszenzanalyse von Blattscheiben für das Hochdurchsatz-Screening der NPQ-Relaxationsraten in Glycine max (G.max; Sojabohne). Dieses Protokoll verwendet den CF Imager25, der mit anderen kommerziell erhältlichen geschlossenen PAM-Systemen wie der beliebten FluorCam26 vergleichbar ist. Mit einem dunklen Raum für die Anpassung von Proben können Benutzer 96-Well-Teller, Petrischalen und kleine Pflanzen abbilden. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Erhöhung des Durchsatzes durch die Verwendung von Blattscheiben im Vergleich zur sequenziellen Analyse einzelner Pflanzen. Hierin stellen wir repräsentative Ergebnisse und eine Methode zur Probenahme, Messung und Analyse des NPQ in Feldkulturpflanzen vor.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Antylia Scientific Scientific</td><td> 61018-56</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Schwarzer Filzstift</td><td>Sharpie</td><td>SAN30001</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>CF imager</td><td>Technologica Ltd.</td><td>N/A</td><td>Chlorophyllfluoreszenz-Imager Herkunftsland: Vereinigtes Königreich</td></tr><tr><td>Korkbohrer, 7mm</td><td>Humboldt Mfg Co</td><td>H9665</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>FluorImager V2.305 Software</td><td>Technologica Ltd.</td><td>N/A</td><td>Bildgebungssoftware Herkunftsland: Vereinigtes Königreich</td></tr><tr><td>iHank-Nose 100er-Pack Premium-Nasensauger-Hygienefilter</td><td>Amazon</td><td>&nbsp; B07P6XCTGV</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Markierungspfähle</td><td>John Henry Company</td><td>KN0151</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Papierschere</td><td>VWR</td><td>82027-596</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis Company Inc.</td><td>&nbsp; S3-594-6</td><td>Halbtransparente flexible Folie Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr><tr><td>Vollgummistopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-130M</td><td>Herkunftsland: Vereinigte Staaten von Amerika</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen abschreckung in kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter chlorophyllfluorometrie

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Die Photosynthese ist in modernen Pflanzensorten nicht optimiert und bietet daher eine Möglichkeit zur Verbesserung. Die Beschleunigung der Entspannung des nicht-photochemischen Abschreckens (NPQ) hat sich als effektive Strategie zur Steigerung der photosynthetischen Leistung erwiesen. Das Potenzial zur Züchtung für einen verbesserten NPQ und ein vollständiges Verständnis der genetischen Basis der NPQ-Entspannung fehlt jedoch aufgrund von Einschränkungen bei der Überstichprobenziehung und Datenerhebung von Feldkulturpflanzen. Aufbauend auf früheren Berichten präsentieren wir einen Hochdurchsatz-Assay zur Analyse der NPQ-Relaxationsraten in Glycine max (Sojabohne) unter Verwendung der pulsamplitudenmodulierten (PAM) Chlorophyllfluorometrie. Blattscheiben werden aus Feldsojabohnen beprobt, bevor sie in ein Labor transportiert werden, in dem die NPQ-Relaxation in einem geschlossenen PAM-Fluorometer gemessen wird. Die NPQ-Relaxationsparameter werden berechnet, indem den gemessenen NPQ-Werten nach einem Übergang von hohem zu schwachem Licht eine biexponentielle Funktion zugeordnet wird. Mit dieser Methode ist es möglich, Hunderte von Genotypen innerhalb eines Tages zu testen. Das Verfahren hat das Potenzial, Mutanten- und Diversitätspanels auf Variationen in der NPQ-Relaxation zu untersuchen, und kann daher sowohl auf grundlegende als auch auf angewandte Forschungsfragen angewendet werden.

Abbildung 1A zeigt eine typische Messung des NPQ in Feldsojabohnen. Pflanzen wurden im Sommer 2021 in Urbana, IL (Breitengrad 40,084604°, Längengrad -88,227952°) angebaut, wobei die Samen am 5. Juni gepflanzt wurden. 2021. Die Blattscheiben wurden nach 30 Tagen der Pflanzung von Samen beprobt und Messungen wurden mit dem bereitgestellten Protokoll durchgeführt (Tabelle 1). F v/Fm- und NPQ-Werte wurden für jede Blattscheibe berechnet (Ergänzende Tabe...

Das Protokoll führt eine Hochdurchsatzmethode zur Messung der Relaxation der nicht-photochemischen Abschreckung durch pulsamplitudenmodulierte Chlorophyllfluorometrie ein. Die Methode wird auf feldgezüchtetes Glycine max angewendet und kann an andere Arten angepasst werden, um nach genetischer Vielfalt oder Brutpopulationen zu suchen.

Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Diese Methode kann einen Einblick in die genetische Variation der nicht-photochemischen Abschreckung geben, die in genetischen Diversitätspanels oder Zuchtpopulationen verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist das Potenzial, eine große Anzahl von Genotypen innerhalb eines einzigen Tages auf Variationen in der nicht-photochemischen Abschreckung zu untersuchen. Das Protokoll wird für Glycine max oder Sojabohnen vorgestellt, kann aber angepasst werden, um andere Pflanzenräume zu analysieren, aus denen Liftscheiben gesammelt werden können.Für jemanden, der das Protokoll zum ersten Mal ausführt, ist der Schlüssel die Handhabung der Hebescheibe, um Schäden oder Übersättigung der Schwämme mit Wasser zu vermeiden. Um zu beginnen, beproben Sie die Pflanzen 30 Tage nach der Keimung auf dem Feldplatz. Füllen Sie 1/3 des destillierten Wassers in alle Brunnen einer 24-Well-Platte.Beschriften Sie den Deckel und die Seite der Platte mit den zu beprobenden Repliken. Halten Sie das jüngste vollexpandierte Blatt an der Oberseite der Pflanze gegen einen Gummistopfen. Drücken Sie einen Humboldt-Korkbohrer Nummer zwei durch das Blatt und drehen Sie, um eine Scheibe zu schneiden, wobei Sie die Mittelrippe vermeiden.Sammeln Sie nacheinander fünf Discs aus demselben Blatt für technische Replikate. Drücken Sie die Blattscheiben mit einem Wattestäbchen aus dem Korkbohrer in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte und wiederholen Sie dies für eine andere Pflanze desselben Genotyps. Überprüfen Sie, ob alle Blattscheiben im Wasser schwimmen.Wenn nicht, bewegen Sie Blattscheiben, die an der Seite eines Brunnens haften, vorsichtig in eine schwimmende Position mit einem Wattestäbchen. Fahren Sie mit dem Sampling von Discs aus dem folgenden Diagramm fort. Platzieren Sie den Deckel und versiegeln Sie ihn mit einer halbtransparenten flexiblen Folie.nach Abschluss der Probenahme in der gesamten 24-Well-Platte. Bewahren Sie die Platte vor direkter Sonneneinstrahlung in einem Beutel, einer Schachtel oder einem leeren Kühler auf. Klopfen Sie in einem sauberen Laborraum auf den Deckel der versiegelten Platte, um Blattscheiben zu entfernen, die während des Transports am Deckel haften.Wickeln Sie die Folie aus und entfernen Sie den Deckel. Übertragen Sie eine Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte in eine frische 96-Well-Platte, wobei die Blattscheibe flach nach unten am Boden des Bohrlochs zeigt. Schneiden Sie einen Nasensaugerfilter in zwei Hälften.Tauchen Sie den resultierenden Filter halb in Wasser und tupfen Sie auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Setzen Sie den Filter mit der Blattscheibe in den Brunnen ein, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Nehmen Sie eine zweite Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte und legen Sie sie mit der Vorderseite nach unten in die nächste verfügbare Position der 96-Well-Platte.Tauchen Sie die restliche Hälfte des in Wasser produzierten Nasenfilters und tupfen Sie ihn auf ein Papiertuch, bevor Sie ihn mit der zweiten Blattscheibe in den Brunnen einführen. Kleben Sie die obere rechte Ecke ab, um die Platte im Dunkeln für die Bildgebung auszurichten. Dichten Sie Platten mit einer halbtransparenten flexiblen Folie ab und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie ein.Schreiben Sie die Plot-IDs und die Platten-ID auf die Aluminiumfolie. Legen Sie die Platten für mindestens 30 Minuten in eine dunkle Box oder einen Schrank, um die ersten beiden Phasen des nicht-photochemischen Abschreckens zu entspannen. Verwenden Sie eine verlängerte dunkle Inkubationszeit von einer Stunde vor der Bildgebung, wenn Langzeitphasen des nicht-photochemischen Abschreckens von Interesse sind.Bereiten Sie eine zusätzliche Dummy-Platte für die Fokussierung während der Analyse vor, indem Sie eine Blattscheibe in jede Ecke einer frischen 96-Well-Platte und eine in der Mitte legen. Sichern Sie die Blattscheiben mit Nasenfiltern wie bei früheren Platten, versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur und 50% relativer Luftfeuchtigkeit. Schalten Sie den Imager ein und öffnen Sie die Imaging-Software.Klicken Sie auf Einstellungen gefolgt von Protokoll, um ein Fenster für die Eingabe von Schritten im experimentellen PAM-Protokoll zu öffnen. Legen Sie die technischen Spezifikationen der im Manuskript angegebenen Maschine fest. Stellen Sie das Programm so ein, dass es mit einem gesättigten Puls beginnt, um die maximale Quanteneffizienz der dunkelangepassten Photosynthese zu messen, indem Sie 20 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von eingeben.Klicken Sie auf das Feld Impuls anwenden, und geben Sie 1 in das Feld Diese Anzahl von Malen ein. Stellen Sie den Puls-PPFD auf 6, 152, die Pulslänge auf 800 Millisekunden und aktivieren Sie das Kontrollkästchen F-Prime- und FM-Prime-Bilder mit allen Impulsen aufnehmen. Aktivieren Sie Einfügen nach, um dem Protokoll einen zweiten Schritt hinzuzufügen.Geben Sie 30 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von ein. Wählen Sie dann die Option Aktinic ändern und geben Sie 50 in das Feld Actinic PPFD ein, um die Lichtintensität der Kammer auf 50 PPFD einzustellen. Klicken Sie auf Einfügen nach, um dem Protokoll einen neuen Schritt hinzuzufügen, und geben Sie 150 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von ein.Wählen Sie Puls anwenden und geben Sie 4 in das Feld Diese Anzahl von Malen ein, um Messimpulse alle 150 Sekunden viermal hintereinander anzuwenden, während das aktinische Licht bei 50 PPFD gehalten wird. Passen Sie die Verzögerung und Lichtintensität für jeden Schritt entsprechend den im Manuskript angegebenen Werten an, bevor Sie das Protokoll als pcl-Datei am gewünschten Ort speichern. Schalten Sie das Licht aus und legen Sie die Dummy-Platte mit der Vorderseite nach unten auf den Probentisch, so dass die adaxiale Oberfläche des Blattes nach oben zum Detektor zeigt und der Schwamm nach unten zur Plattform zeigt.Stellen Sie die Höhe des Probentisches so ein, dass sich die Blattscheiben 140 Millimeter über dem Sockel des Instruments befinden. Klicken Sie auf das Symbol Verbindung mit Imager-Kamera und Hardwarekamera verbinden/trennen, um die Kamera zu starten. Klicken Sie auf das Fokusfluoreszenzsymbol, dargestellt durch ein rotes, zweiseitiges Pfeilsymbol mit zwei grünen Linien an der Basis, und passen Sie das Objektiv und die Belichtung an, um die Platte in den Fokus zu bringen.Klicken Sie erneut auf das Fokusfluoreszenzsymbol, um das blinkende Licht auszuschalten. Wenn Sie im Dunkeln arbeiten, ersetzen Sie die Dummy-Platte durch die zu analysierende Platte. Platzieren Sie es mit der Vorderseite nach unten mit dem Klebeband auf der Außenseite, das zum Ausrichten der oberen rechten Ecke verwendet wird, und klicken Sie auf das Kartenbild-Kamerasymbol.Passen Sie die Bildbelichtung an, indem Sie die Blende öffnen oder schließen, bis die Leiste im Popup-Fenster im grünen Bereich positioniert ist. Klicken Sie nach jeder Einstellung der Blende auf die Schaltfläche "Erneut versuchen", bis die Belichtung korrekt eingestellt ist und das Instrument ein Bild aufnimmt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Bildisolierung anwenden, um Hintergrundsignale zu blockieren.Der fokussierte Blattbereich wird grau und der Hintergrund blau dargestellt. Wählen Sie den Bereich oder die gewünschten Pixel aus, um nur die Blattscheiben einzuschließen, indem Sie das Histogramm und den Gammapegel im Pulldown-Menü Bild ändern anpassen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Hohe und niedrige Schnitte löschen, um die hellblau hervorgehobenen Bereiche zu löschen.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Streuner löschen, um alle Pixel zu entfernen, die die letzten drei anderen Pixel nicht berühren. Alle Bereiche auf dem Bild, die als isolierte Inseln erscheinen, werden separat analysiert und in die endgültige Datenausgabe aufgenommen. Klicken Sie auf das Symbol Protokoll ausführen, um das Programm zu starten.Am unteren Bildschirmrand erscheint ein Timer, der Sie darüber informiert, wie lange das Protokoll noch läuft. Warten Sie, bis das Protokoll abgeschlossen ist. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um die Daten als igr-Datei zu speichern.Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf das rote Kreuz oben rechts im Fenster klicken, bevor Sie eine weitere Musterplatte starten. Um die Chlorophyllfluoreszenzdaten zu exportieren, öffnen Sie die igr-Datei in der Bildgebungssoftware und klicken Sie auf Datei, gefolgt von In Ordner exportieren, um einen neuen Ordner mit allen erforderlichen Dateien zu erstellen. Eine typische Messung der nicht-photochemischen Abschreckung in Feldgezüchteten Sojabohnen zeigte, dass nach einem anfänglichen Sättigungsblitz zur Bestimmung von Fv / Fm, wenn die Blattscheiben einem schwachen Licht von 50 Mikromol pro Meter und Sekunde ausgesetzt wurden, die nicht-photochemische Abschreckung weniger als eins betrug.Darüber hinaus erhöhte sich bei der Übertragung auf Hochlicht von 2.000 Mikromol pro Meter und Sekunde die nicht-photochemische Abschreckung nach 15 Minuten auf den Maximalwert von vier. Eine fehlgeschlagene Messung zeigte einen minimalen Anstieg der nicht-photochemischen Abschreckung bei der Übertragung auf hohes Licht. Die Ausrichtung der Platten innerhalb des Imagers und ein klar definierter Plan für die Probenahme und Beschichtung von Blattscheiben sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Daten mit dem richtigen Genotyp verknüpft sind.Dieses Protokoll kann die Auswirkungen von Umweltvariablen wie Dürre und Shedding auf das nicht-photochemische Abschrecken quantifizieren oder nicht-photochemische Abschreckungen auf verschiedenen Baldachinniveaus bewerten, um Pflanzenmodelle zu verfeinern.

high-throughput-analysis-non-photochemical-quenching-crops-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Die aufgeschnittenen Vaseline Lücke Ansatz werden geringe Geräuschaufnahmen von ionischen und Anschnittströme von spannungsabhängigen Ionenkanälen in Xenopus-Oozyten mit hoher Auflösung von schnellen Kanal Kinetik ausgedrückt zu erhalten. Mit geringen Modifikationen können Spannungsklemm Fluorometrie an den aufgeschnittenen Oozyte Protokoll gekoppelt werden.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

Lernen Sie eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Glycine max mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie. Diese Technik ermöglicht die schnelle Bewertung genetischer Vielfalt in Pflanzenzuchtprogrammen.

Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie

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