Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

Dieses Protokoll kann nützlich sein, um Fragen über die Rolle der Aderhautplexus und peripheren Immunzellen bei der Regulation des Gehirns in verschiedenen Kontexten in Mausmodellen zu beantworten. Dieses Protokoll ermöglicht eine eingehende quantitative und qualitative Analyse der einzigartigen Immunzellpopulationen im Aderhautplexus von Mäusen. Die Dissektion der Aderhautplexus kann am Anfang aufgrund ihrer geringen Größe und transparenten Farbe schwierig sein.

Wir empfehlen, zuerst an nicht durchbluteten Tieren zu üben. Positionieren Sie zunächst das Gehirn, das von einer C57 schwarzen Sechs-Maus-Rückenseite seziert wurde, in einer Petrischale und platzieren Sie die Schale unter den Zielen der binokularen Schleifen. Während Sie das Gehirn mit einer Pinzette an Ort und Stelle halten, führen Sie die beiden Enden eines anderen Pinzettenpaares durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären ein.

Ziehen Sie mit der Pinzette den Kortex mit dem Callosum und dem Hippocampus vom Septum weg und legen Sie den lateralen Ventrikel und einen Teil des dritten Ventrikels frei. Identifizieren Sie den Plexus choroidalis lateralis als einen langen Schleier, der den lateralen Ventrikel auskleidet und an beiden Enden aufflammt. Sammeln Sie dann mit zwei Enden einer dünnen Pinzette den lateralen Aderhautplexus.

Achten Sie darauf, den dreieckigen hinteren Teil zu sammeln, der von der hinteren Falte des Hippocampus verdeckt wird. Als nächstes ziehen Sie den Kortex mit dem Corpus callosum und dem Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre vom Septum weg, um den gesamten dritten Ventrikel und den gegenüberliegenden lateralen Ventrikel freizulegen. Sammeln Sie mit einer feinen Pinzette den dritten Aderhautplexus, der als kurze Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt identifiziert wurde.

Dann sammeln Sie den anderen lateralen Aderhautplexus. Als nächstes setzen Sie die beiden Enden der Pinzette zwischen dem Kleinhirn und dem Mittelhirn ein und lösen Sie das Kleinhirn von den Pons und der Medulla, um den vierten Ventrikel freizulegen. Identifizieren Sie dann den vierten Aderhautplexus als eine lange kugelförmige Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt, der den vierten Ventrikel vom lateralen rechten Ende zum linken Ende zwischen Kleinhirn und Medulla auskleidet.

Sammeln Sie mit einer feinen Pinzette den vierten Aderhautplexus. Nachdem Sie alle gesammelten Aderhautplexus mit Kollagenase IV inkubiert haben, pipettieren Sie vorsichtig etwa 10 Mal auf und ab, um die Dissoziation abzuschließen. Dann füllen Sie das Röhrchen auf 1,5 Milliliter mit MACS-Puffer, um die Kollagenase-IV-Aktivität zu stoppen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern MACS-Puffer waschen. Nach Zugabe der entsprechenden Kompensationsperlen und Antikörperlösungen die Proben 30 bis 45 Minuten lang auf Eis inkubieren und so vor Lichteinwirkung schützen. Dann füllen Sie die Röhrchen mit 1,5 Millilitern MACS-Puffer und zentrifugieren Sie die Zellen und Kompensationskügelchen.

Nachdem Sie die Zellen und Kompensationsperlen in 500 Mikrolitern MACS-Puffer resuspendiert haben, filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb. Nachdem Sie das Durchflusszytometer und die Software eingeschaltet haben, wählen Sie den Vorwärtsstreubereich gegenüber dem seitlichen Streubereich und das Gate für Zellen basierend auf der Größe. Erstellen Sie dann ein Tochtertor für einzelne Zellen mit Vorwärtsstreufläche im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe.

Erstellen Sie als Nächstes ein Tochtertor für lebende Zellen mit DAPI im Vergleich zum Vorwärtsstreubereich, um die DAPI-positiven Zellen auszuschließen. Erstellen Sie dann ein Tochtertor für CD45-positive Immunzellen mit CD45 im Vergleich zum Vorwärtsstreubereich. Erstellen Sie nun ein Tochtertor aus den CD45-positiven Zellen und wählen Sie F480 gegenüber CD11b, um die CD11b-positiven F480-positiven und die CD11b-positiven F480-negativen Populationen zu identifizieren.

Erstellen Sie dann ein Tochtertor für CD11b-positive F480-positive Zellen und wählen Sie CX3CR1 gegenüber IA-IE, um sowohl CX3CR1-positive IA-IE-positive grenzassoziierte Makrophagen als auch CX3CR1-positive IA-IE-negative Makrophagen zu identifizieren. Als nächstes erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b-positive F480-positive CX3CR1-positive IA-IE-negative Makrophagen und wählen Sie F480 gegenüber CD11b, um sowohl die CD11b-Hoch-F480-Intermediär-CX3CR1-positiven IA-IE-negativen Kolmer-Epiplexus-Makrophagen als auch die CD11b-positiven F480-hohen CX3CR1-positiven IA-IE-negativen grenzassoziierten Makrophagen zu identifizieren. Dann von der CD11b positiven F480 negativen Population, Gate für Ly6C versus IA-IE.

Wählen Sie sowohl IA-IE-positive Ly6C-negative Population als auch IA-IE-negative Ly6C-positive Zellen aus, die hauptsächlich Monozyten oder Neutrophilen entsprechen. Erstellen Sie schließlich ein Tochtergatter für CD11b positive F480 negative IA-IE positive Ly6C negative Population und wählen Sie CD11b gegenüber CX3CR1. Identifizieren Sie dann sowohl CD11b hohe CX3CR1 niedrige als auch CD11b positive CX3CR1 negative Populationen.

Für das T-Zell-Gating erstellen Sie nach dem Ausschließen der DAPI-positiven Zellen wie zuvor beschrieben ein Tochtergatter für CD45-positive Immunzellen mit CD45 gegenüber FSC-A, erstellen Sie dann ein Tochtergatter aus den positiven CD45-Zellen und wählen Sie TCR beta gegenüber CD11b. Schließen Sie die CD11b-positiven myeloischen Zellen aus und wählen Sie die TCR-positive CD11b-negative T-Zell-Population aus. Erstellen Sie schließlich ein Tochtertor für die TCR-Beta-positive CD11b-negative Population und wählen Sie CD4 gegenüber CD8a.

Identifizieren Sie sowohl CD8-negative als auch CD4-positive T-Zellen und CD8-positive CD4-negative T-Zellen. Die hier gezeigten Durchflusszytometrie-Analysen zeigten erfolgreich wesentliche Teilmengen von myeloischen und T-Zellen und deren relative Gesamtzahl pro Maus in hochreproduzierbarer Weise auf. Durchflusszytometrie-Analysen der myeloischen Zellen zeigen, dass der Plexus choroidus von CD11b-positiven CX3CR1-positiven F480-Makrophagen mit hoher Grenze bevölkert ist, die 80% der CD45-positiven Immunzellen am Plexus choroidus repräsentieren.

Die CD11b hohe F480 intermediäre CX3CR1 positive IA-IE negative Population von Kolmers Epiplexus Makrophagen wurde ebenfalls identifiziert. Unter den CD11b-positiven F480-negativen Immunzellen wurden zwei verschiedene Populationen von Ly6C-negativen IA-IE-positiven Zellen charakterisiert und entsprechen wahrscheinlich dendritischen Zellen. Die Analyse- und Gating-Strategie von T-Zellen hob das Vorhandensein der geringen Population von CD45-positiven CD11b-negativen TCR-beta-positiven Zellen hervor.

Unter ihnen bevölkerten etwa 30-50 CD8-negative CD4-positive und CD8-positive CD4-negative T-Zellen pro Maus den Aderhautplexus unter physiologischen Bedingungen. Es ist wichtig, die Qualität der Perfusion zu kontrollieren, da jede Blutkontamination die Immunzusammensetzung des Plexus choroidalis verwischen kann. Auf diese Methode kann die Sortierung ausgewählter Zellpopulationen für weitere Analysen wie Bulk- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung folgen.