Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

FEB ist eine kennzeichnungsfreie und kostengünstige _________ Interaktionserkennungsplattform, die schnelle und genaue Messungen ermöglicht. Diese Methode bietet die Validierung bekannter oder unbekannter Wechselwirkungen und eine einfache Möglichkeit, auf potenzielle Inhibitoren der biomolekularen Wechselwirkungen zu testen. Der Hauptvorteil von FEB ist seine automatisierte, benutzerfreundliche Software, die den Benutzer während des gesamten Experiments mit einer offenen Handpipetting-Plattform begleitet, sodass Benutzer mit wenig oder sogar ohne Training arbeiten können.

Die FEB-Technologie bietet auch Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Pharmazeutika, der biomolekularen Analyse von kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen, der Arzneimittelvalidierung durch die einfache Umsetzung biologischer In-vitro-Aktivität in die In-vivo-Wirksamkeit. Als Anfänger stehen Sie möglicherweise vor Herausforderungen bei der Auswahl der richtigen Analytkonzentrationen, um das Experiment zu optimieren und einen zuverlässigen KD-Wert zu erhalten. Wir empfehlen, auf den Chipfunktionalisierungsprozess und den richtigen Pufferaustausch zu achten.

Beginnen Sie mit dem Mischen gleicher Volumina von EDC- und Sulfo-NHS-Lösung, indem Sie es nach oben und unten pipettieren. Legen Sie den vom Unternehmen gelieferten Biosensorchip in eine Glas-Petrischale mit montiertem Deckel. Es wird empfohlen, alle Funktionalisierungsschritte bei der Chipaktivierung in der Petrischale durchzuführen.

Tragen Sie 50 Mikroliter einmolaren MES-Puffer auf den Biosensorchip auf. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie dann den Puffer ab und tragen Sie sofort 50 Mikroliter EDC-Sulfo-NHS-Lösung auf den Sensorchip auf.

Die Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die EDC-Sulfo-NHS-Lösung aus dem Chip ab und wenden Sie 50 Mikroliter einmolaren MES-Puffer an. Saugen Sie den MES-Puffer ab und spülen Sie den Chip zweimal mit 50 Mikrolitern 1X PBS.

Saugen Sie das PBS vom Chip ab und fügen Sie das Zielmolekül Hsp90 hinzu. Die Glas-Petrischale abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann aspirieren Sie die Lösung, die das Zielmolekül enthält, und spülen Sie sie dreimal mit 50 Mikrolitern 1X PBS ab.

Saugen Sie die 1X PBS-Lösung vom Chip ab und fügen Sie 50 Mikroliter der Quench-One-Lösung hinzu. Die gläserne Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die Quench-One-Lösung aus dem Chip ab und fügen Sie 50 Mikroliter der Quench-Two-Lösung hinzu.

Die gläserne Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach saugen Sie die Abschrecklösung aus dem Chip und spülen Sie den Chip fünfmal mit 50 Mikrolitern 1X PBS ab, wobei der letzte PBS-Tröpfchen auf dem Sensor verbleibt. Bereiten Sie die Analytverdünnungsreihe für Cdc37 im gewünschten Konzentrationsbereich vor.

Entwerfen Sie das Experiment so, dass es mindestens acht verschiedene Analytkonzentrationen umfasst, um eine zuverlässige Dissoziationskonstante oder einen KD-Wert zu erhalten, und bereiten Sie diese verschiedenen Verdünnungen im selben Puffer vor, der für die Kalibrierung und das Zielprotein verwendet wird. Platzieren Sie den Chip vorsichtig am Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Software eingeschaltet ist und die LED-Anzeige grün leuchtet.

Als nächstes drücken Sie das Run Experiment-Modul in der automatisierten Software und wählen Sie 10 Punkte mit Regeneration oder einem anderen gewünschten Protokoll. Geben Sie die Details wie Operatorname, Experimentname, Datum, Regenerationspuffer, immobilisiertes Ziel und den Analyten in Lösung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment beginnen, die in der Software angezeigt wird, und folgen Sie den Anweisungen der automatisierten Software.

Um die Gerätekalibrierung durchzuführen, saugen Sie die verbleibende PBS-Lösung vom Chip ab und tragen Sie 50 Mikroliter des Kalibrierpuffers auf. Drücken Sie die Taste Continue und warten Sie fünf Minuten, bis der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den für den Kalibrierungsschritt ermittelten Endpunkt mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.

Als nächstes führen Sie eine Analytassoziation durch, indem Sie den Kalibrierpuffer vom Chip absaugen und 50 Mikroliter der niedrigsten Analytkonzentration anwenden. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie fünf Minuten, bis der Zuordnungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Assoziationsschritt mit einem Warnalarm an, um fortzufahren.

Um eine Analytdissoziation durchzuführen, saugen Sie die Analytlösung vom Chip ab und wenden Sie 50 Mikroliter des Dissoziationspuffers an. Drücken Sie die Weiter-Taste. Nach der Dauer des Dissoziationsschritts zeigt die Software den Endpunkt für den Dissoziationsschritt mit einem Warnalarm an.

Als nächstes führen Sie die Chipregeneration durch, indem Sie die Dissoziationslösung vom Chip absaugen und 50 Mikroliter des Regenerationspuffers anwenden. Drücken Sie dann die Schaltfläche Weiter. Der Regenerationsschritt dauert in der Regel etwa 30 Sekunden.

Danach zeigt die Software den Endpunkt für den Regenerationsschritt mit einem Warnalarm an, der nachverfolgt werden muss. Zum Waschen des Chips die Regenerationslösung aus dem Chip absaugen und 50 Mikroliter des Waschpuffers auftragen. Saugen Sie die Lösung vom Chip ab und wiederholen Sie dies fünfmal.

Lassen Sie den letzten Tropfen des Waschpuffers auf dem Chip. Drücken Sie dann die Continue-Taste und warten Sie 30 Sekunden, bis die Dauer des Waschschritts in der Softwareanzeige abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die Schritte für jede verwendete Analytkonzentration.

Die fünf Schritte der Kalibrierung, der Analytassoziation, der Dissoziation, der Regeneration und des fünfmaligen Waschens bilden einen Zyklus. Drücken Sie am Ende des Experiments die Analysetaste in der automatisierten Analysesoftware. Es erscheint ein Anzeigefenster mit allen experimentellen Punkten.

Stellen Sie sicher, dass die für das vorgeschriebene Protokoll verwendeten Analytkonzentrationen korrekt sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse ausführen, um den KD-Wert automatisch zu generieren. Die Software erzeugt ein Hill-Fit-Diagramm, indem sie die Analytkonzentrationen gegen die entsprechenden I-Antworten aufzeichnet, aus denen die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht berechnet wird.

Das Zielprotein Hsp90 wurde auf den Chip immobilisiert, und für das erste Experiment wurden 10 Konzentrationen des Analytproteins Cdc37 im Bereich von 25 Nanomolaren bis 5.000 Nanomolaren hergestellt. Die aus dem ersten Experiment generierten Datendateien wurden hier gezeigt. Hier werden die in Echtzeit überwachten experimentellen Daten angezeigt.

Die Y-Achse entspricht der I-Antwort in den Biosensoreinheiten, und die X-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Das hier gezeigte grafische Bild stellt das Hügelanpassungsdiagramm dar, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wurde. Die Y-Achse entspricht der I-Antwort in den Biosensoreinheiten und die X-Achse entspricht den unterschiedlichen Analytkonzentrationen im Experiment.

Das hier gezeigte grafische Bild stellt das mit der statistischen Analysesoftware generierte Assoziationsdiagramm dar. Die Y-Achse entspricht der I-Antwort am Ende der Assoziationsphase und die X-Achse den unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten Cdc37. In Experiment zwei wurde ein anderer Satz von Konzentrationen im Bereich von 0,4 Nanomolar bis 200 Nanomolar verwendet, und die generierten Datendateien werden hier gezeigt.

Die grafischen Bilder stellen das ITC-Thermogramm der Interaktion zwischen Hsp90 und Cdc37 dar. Hier sind die entsprechenden Wärmeentwicklungskurven dargestellt, die aufgrund der aufeinanderfolgenden Injektionen von Cdc37 in Hsp90 bei 298,15 Kelvin erhalten wurden. Die hier verwendete Differenzleistung ist eine Funktion der Zeit.

Die integrierten Datenpunkte in diesem Diagramm bezeichnen die entsprechende normalisierte Wärme gegenüber dem Mueller-Verhältnis von Hsp90 zu Cdc37. Der hier verwendete offene Pipettieransatz erfordert, dass der Benutzer eine grundlegende Beherrschung des Handpipettierens hat und darauf achtet, den Biosensor nicht mit der Spitze zu berühren. Die Reproduzierbarkeit des Schritt-Timings hängt ganz vom Anwender ab.

Sobald der Forscher eine Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen charakterisiert, können wir ein Screening-Experiment durchführen, indem wir potenzielle Inhibitoren oder Modulatoren entwerfen, die auf die spezifische biomolekulare Wechselwirkung mit dem FEB-System abzielen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um bekannte und neuartige Wechselwirkungen zwischen Proteinen sowie kleinen Molekülen, einschließlich Arzneimitteln und Peptiden, zu identifizieren, zu verifizieren und zu quantifizieren.