Interview: Glycolipid Antigen-Präsentation durch CD1d und das therapeutische Potenzial von NKT Zellen-Aktivierung

Hallo, mein Name ist Mitchell Cronenberg und ich bin am La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Ich bin eigentlich der Präsident und wissenschaftliche Direktor, aber ich habe ein sehr aktives Forschungslabor, und das ist es, worüber wir sprechen werden, natürlich ist eine der Technologien, die wir haben, nämlich CD-1D-Tetramere. Der größte Teil der Arbeit in meinem Labor betrifft CD 1D, reaktive T-Zellen.

Und diese Zellen sind einzigartig, weil sie Glykolipide und keine Peptide erkennen. Und ein anderer Zweig meines Labors befasst sich mit einem ganz anderen Thema, dem mukösalen Immunsystem und seiner Regulation. CD one Moleküle sind Antigen präsentierende Moleküle, und das bedeutet, dass sie Antigene oder Fragmente von Proteinen oder anderen Molekülen binden und für die T-Zell-Erkennung aufhalten.

Nun gibt es wirklich zwei verschiedene Arten von Antigen-präsentierenden Molekülen. Es gibt solche, die Peptide enthalten oder präsentieren, und es gibt solche, die Lipide und Glykolipide enthalten. Und die CD one-Moleküle enthalten Lipide und Glykolipide.

Das ist ihre Funktion und sie halten diese Lipide und Glykolipide für T-Zellen aufrecht oder präsentieren sie. Und es gibt tatsächlich vier verschiedene Arten von CD 1-Molekülen, CD eins, A, B, C und D.Und eigentlich konzentrieren wir uns auf CD 1D und CD 1D im Besonderen ist wahrscheinlich die beste Studie, zum Teil, weil es Mausmodelle gibt. Und CD 1D präsentiert Glykolipide an eine bestimmte Art von T-Zelle, die als natürliche Killer-T-Zelle bezeichnet wird, ein ungewöhnliches weißes Blutkörperchen, das Merkmale der angeborenen und adaptiven Immunantwort aufweist.

Bei den vorgestellten Glykolipiden kann es sich um Selbstglykolipide handeln, obwohl diese zu diesem Zeitpunkt noch nicht sehr gut charakterisiert sind, oder es kann sich um mikrobielle Glykolipide handeln. Und die Glykolipide, von denen wir wissen, dass sie präsentiert werden, stammen aus zwei Quellen. Eines davon sind die sogenannten FMS-Bakterien, die wahrscheinlich die am häufigsten vorkommenden Bakterien in der Biosphäre sind.

Sie leben im Ozean, sie leben in Pflanzen, sie leben im Boden. Viele Menschen machen sie aber nicht krank. Ich nehme an, wir sind sehr daran gewöhnt, mit diesen Bakterien zu leben.

Und die zweite Kategorie, die wir kennen, ist eine andere Art von Glykolipiden, die als Dylglycerin bezeichnet werden und Glykolipide enthalten. Diese finden sich in Borrelien borre, die Borreliose verursachen und wahrscheinlich in vielen anderen Krankheitserregern. Und wir decken gerade erst auf, was die verschiedenen Arten von Bakterien sind, die diese Glykolipide haben.

Wir haben also das, was man Glyko-Sintal-Lipide aus SMS und Dylglycerin-Lipide aus den Borrelien nennt und wahrscheinlich viele andere, die wirklich pathogen sind. Diese Lipide werden auf CD 1D-Moleküle auf dendritischen Zellen geladen, überwiegend, obwohl es sich um B-Lymphozyten, ER-Zellen in der Leber und vielleicht andere Zelltypen handeln könnte. Diese CD-1D-Moleküle durchlaufen Lysosomen und Endosomen, wo sie wahrscheinlich diese Lipide binden und dann das Lipid zur Zelloberfläche transportieren, wo es von T-Zellen erkannt wird, einschließlich der natürlichen Killer-T-Zellen, die ich bereits erwähnt habe.

Eines der Dinge, die passieren, wenn Sie einem Bakterium ausgesetzt sind, das Glykolipide enthält, ist, dass die NK-T-Zellen sehr schnell aktiviert werden. Konventionelle T-Zellen. Mit anderen Worten, peptidreaktive T-Zellen brauchen in der Regel drei oder vier Tage, um eine gute Immunantwort in Gang zu setzen, insbesondere wenn sie keine Antigenerfahrung haben.

Mit anderen Worten, wenn sie es tun, sind sie naiv. Im Gegensatz dazu können die NK-T-Zellen innerhalb weniger Stunden aktiviert werden und beginnen in sehr, sehr kurzer Zeit mit der Produktion von Zytokinen wie Gamma-Interferon, die für die bakterielle Beseitigung wichtig sind. Und auf diese Weise ähneln sie Aspekten der angeborenen Immunantwort aus dem Modell.

Aus der Untersuchung von Modellantigenen. Wir wissen, dass CD 1D in späte Endosomen und Lysosomen gelangt, sehr saure intrazelluläre Kompartimente, in denen die Glykolipid-Antigene in CD 1 geladen werden, und sie sind in der Tat spezielle Transferproteine innerhalb der Antigen-präsentierenden Zellen wie die dendritischen Zellen, die helfen, die Lipide mit diesen Fona-Bakterien in das CD 1D-Molekül zu bekommen. Borre-Bakterien und andere hatten es mit extrazellulären Bakterien zu tun. Die Lipidantigene müssen also irgendwie in die Zelle transportiert werden, wahrscheinlich in ein Lysosom, das in das CD-1-Molekül geladen ist.

Und dann gibt es eine sofortige Aktivierung der NKT-Zelle, und all dies muss innerhalb weniger Stunden in den Sinuskurven, im Liv der Leber, in der Milz, vielleicht im Knochenmark und an anderen Stellen stattfinden, an denen NKT-Zellen gefunden werden. Die tetramere Struktur ist der Schlüssel zur eindeutigen Definition dieser natürlichen Killer-T-Zellen, die diese angeborenen Eigenschaften haben, die sie von anderen T-Zellen unterscheiden. Die anderen Marker, die zur Verfügung stehen, sind wirklich zu zweideutig, aber dies, die Tetramere, ermöglichen es Ihnen, die Zellen anhand ihrer Antigenrezeptorspezifität zu identifizieren, was die Schlüsseltatsache ist, die sie in gewisser Weise definiert, die Herstellung von Tetrameren reicht weit zurück.

Es wurde von Mark Davis und John Alman erfunden, und die Idee war, dass der T-Zell-Rezeptor eine geringe Affinität hat, und wenn man Zellen definieren oder Zellen anhand ihrer Spezifität identifizieren möchte, haben die Peptide, die sie erkennen, oder die Komplexe von Peptiden und Antigen-präsentierenden Molekülen nicht genug Affinität, genug Bindungsstärke, um die Zelle identifizieren zu können. Was Mark Davis und John Allman also erfanden, war diese Tetramer-Technologie, eine Methode, um in einigen Fällen OCRs des Antigen-präsentierenden Moleküls plus des Moleküls, das sie präsentieren, zu erzeugen, was im Grunde die Affinität oder die Affinität der Wechselwirkung erhöht. Sie können also die Zelle sehen, die spezifisch für das Grippepeptid ist, und ein bestimmtes Antigen präsentierendes Molekül oder was auch immer das Antigen ist, an dem Sie interessiert sind.

Eine sehr wichtige Technologie, weil man damit zum Beispiel sehen kann, wie wirksam ein Impfschema sein könnte. Was wir in den späten Neunzigern gemacht haben, war ursprünglich eine Arbeit, die im Jahr 2000 veröffentlicht wurde und inzwischen etwa 500 Mal zitiert wurde. Was wir getan haben, ist, diese Technologie einfach auf Lipide zu übertragen.

Wir haben also lösliche CD-1-Moleküle hergestellt, und wir waren in der Lage, sie mit Methoden, ich werde sie gleich beschreiben, misieren, mit anderen Worten, sie mit spezifischen Glykolipiden hinzufügen, und auf diese Weise konnten wir sie als Reagenzien verwenden, um auf spezifische T-Zell-Rezeptoren zu testen. Mit anderen Worten, diejenigen, die das Glykolipid, an dem wir interessiert sind, plus CD 1D sehen würden. Das Tetris kann in jeder Situation verwendet werden, in der Sie die Anzahl der NKT-Zellen und ihren Aktivierungszustand und ihre Funktion analysieren möchten.

Und in unserem Labor kann es aus einem von mehreren verschiedenen Projekten stammen. Wenn Sie zum Beispiel fragen möchten, ob eine bestimmte Mutante und ein Signalweg die Entwicklung von NK-T-Zellen beeinflussen, können wir das mit unseren Tetrameren tun, fragen Sie nach der Anzahl der NKT-Zellen. Und dann gibt es noch andere Marker, andere Zelloberflächenproteine, die wir uns ansehen können, die uns helfen zu beurteilen, ob die NKT-Zellen reif sind oder ob sie mit den Tetrameren aktiviert werden. Nach einer antigenen Stimulation können wir auch fragen, ob sie nicht nur aktiviert sind, sondern welche Zytokine sie produzieren.

Wir können also die Tetramerfärbung beispielsweise mit der intrazellulären Zytokinfärbung kombinieren und fragen, wie viel Prozent der NKT-Zellen Gamma-Interferon produzieren, wie viel Prozent Sie IL vier herstellen, wie viel Prozent Sie herstellen, beides mit Multiparameter-Durchflusszytometrie, wir können, wir können eine Vielzahl von Fragen zur Zytokinproduktion direkt ex vivo durch diese Zellen stellen. Wir können auch, wir können auch weitere Experimente durchführen. Zum Beispiel können wir die Tetramere verwenden, um NK-T-Zellen für die Kultur in vitro zu reinigen, um zu fragen, wie sie mit anderen Zelltypen interagieren, oder sogar für den Transfer auf ein Empfängertier, dem beispielsweise aus genetischen Gründen NK-T-Zellen fehlen könnten.

Diese Funktion wollen wir wiederherstellen. Wir können das tun und fragen und fragen, wo die Zellen zu Hause sind und wie sie funktionieren. Schließlich weiß ich, dass im Fall von menschlichen NKT-Zellen die Menschen die Tetramere tatsächlich verwendet haben, um Zelllinien in vitro zu erweitern, um Zellen zu Analysezwecken zu züchten Und möglicherweise sogar für therapeutische Zwecke.

Nun, wir verwenden ein Bao-Virus-Expressionssystem zur Erzeugung von CD-1D-Tetrameren. Der Prozess beginnt also mit einem, einem gemeinsamen DNA-Konstrukt, das den Promotor und die Expression des BID zwei Mikroglobulins und der CD 1D-Schwerkette enthält. Dieses CD-Molekül ist also ein Heterodimer aus zwei Polypeptiden.

Wir haben also dieses Expressionssystem mit zwei, zwei Promotoren, und wir infizieren Insektengewebekulturzellen mit den Vao-Virusviren, die sorgfältig titriert werden, wie unser Kanal erklärt hat. Und dann infizieren wir die Zellen und ernten aus dem Gewebekulturmedium das Protein, das von den Zellen exprimiert wird. Die schwere Kette CD 1D wurde speziell für die Herstellung von Tetrameren entwickelt.

Es gibt zwei Dinge, oder besser gesagt, drei Dinge, die ich sagen sollte, die wir tun. Eine davon ist, dass wir das Transmembranstück entfernen. Wir, wir haben, wir exprimieren ein lösliches Protein.

Zweitens haben wir ein Hexa, his Tag, hinzugefügt, damit das Protein durch Metallionenchromatographie aufgereinigt werden kann. Und drittens haben wir ein sogenanntes Bier, einen Ort für enzymatisches Biotin. Und das ist die Innovation.

Es war sehr wichtig, als Davis und Alman die Technologie zur Herstellung von Tetrameren erfanden. Nachdem wir das Protein geerntet haben, wird es dort durch Nickelsäulenchromatographie auf der Nickelverbindung gereinigt. Manchmal führen wir danach eine Größenausschlusschromatographie durch.

Und dann kann das Protein enzymatisch biotinyliert und inkubiert werden, und sobald es enzymatisch biotinyliert ist, bildet es Tetramere, wenn es mit Streptokokken inkubiert wird. Aber das lösliche CD-1-Protein, das atifiziert wird, kann im Grunde über Nacht in einer Lösung eines Glykolipids von Interesse inkubiert werden. Es ist sehr wichtig, dass das Glykolipid nicht in DMSO gelöst wird, denn das ist typisch für Glykolipide als Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, denn CD man reagiert sehr empfindlich darauf.

Daher verwenden wir in der Regel a, einen Puffer, der eine kleine Menge Tween und PBS enthält. Und dieser Puffer ist, ist, ist sehr effektiv für die Auflösung der meisten unserer Glykolipide. Und für das Laden in CD 1D, das scheinbar spontan erfolgt, verwenden wir Streptavidin von einem der verschiedenen Hersteller.

Und es gekoppelt mit Pe-, Fico-, Eryn- oder PC-Phycocyanin-Farbstoffen, scheint jeder von ihnen sehr gut zu funktionieren und gibt uns eine sehr gute Färbung. Insgesamt unterscheidet sich das Verfahren also nicht allzu sehr von den gut charakterisierten Verfahren zur Herstellung von MHC-Tetrameren der ersten Klasse, außer dass wir keine bakterielle Expression verwenden, wir verwenden keine bakterielle Expression, wir verwenden die Expression von Bakterienviren und natürlich haben wir Lipidantigene anstelle von Peptiden. Ein Punkt, den ich betonen sollte, ist, dass Menschen NK-T-Zellen haben und sie die gleiche Spezifität wie die NK-T-Zellen der Maus haben.

Die Spezifität besteht also seit mindestens 60 Millionen Jahren, seit wir uns von den Nagetieren abgespalten haben, und tatsächlich stellen wir menschliche CD-1D-Tetramere mit den gleichen Techniken her, die Sie in dem Video sehen können, das hier gemacht wurde. Und tatsächlich funktionieren menschliche NK-T-Zellen sehr gut mit Maus-Tetrameren und umgekehrt. Wir stellen die menschlichen Tetramere also nicht so oft her, nur weil wir unsere Maus-Tetramere für die menschliche Arbeit verwenden können.

Es gibt also viele Mausmodelle, in denen sich gezeigt hat, dass NK-T-Zellen kritische Determinanten für das Ergebnis der Immunantwort sind. Und das reicht von der Reaktion auf Krebs über die Regulierung von Autoimmunerkrankungen bis hin zur Beseitigung von Infektionserregern und sogar der Entwicklung von sklerotischen Plaques. Das ist ein chronischer Entzündungsprozess, der in den Arterien stattfindet.

Es gibt einige, einige Fragen über die Bedeutung dieser Zellen beim Menschen, wo es etwas weniger häufig gibt, es gibt viele Berichte, die darauf hindeuten, dass sie in Autoimmunzuständen verändert sind, und es gibt auch Berichte, dass sie in der Lunge von Asthmapatienten sehr angereichert sind. Obwohl diese Berichte der einzige Bericht im England Journal of Medicine sind, gibt es einige Kontroversen darüber. Es gibt jedoch eine Reihe von Studien am Menschen, die darauf hindeuten, dass diese Zellen wichtig sein könnten.

In klinischen Studien wurde die Stimulation von NKT-Zellen in vier Phase-1-Studien für fortgeschrittene Krebspatienten getestet. Und es gibt einige Beweise für die Wirksamkeit, natürlich sind diese Menschen sehr krank und die Studien laufen bei verschiedenen Krebsarten. Und es gibt Menschen, die daran interessiert sind, die NK-T-Zellmedientherapie auch bei Autoimmunerkrankungen einzusetzen, obwohl das noch nicht in Gang gekommen ist.

Tetramere könnten in diesen Studien eine Rolle spielen, vor allem im Hinblick auf die Analyse, was mit den NKT-Zellen nach der Agonistentherapie passiert ist. Die Idee ist also typischerweise, Glykolipid-Agonisten oder in einigen Fällen sogar Glykolipid-Antagonisten zu verwenden, die andere Gruppen entwickeln, abhängig von der Reaktion und dem Zustand. Und dann zu beurteilen, was passiert, was mit den NK-T-Zellen passiert ist, was man normalerweise mit Tetrameren tun würde.

Die andere mögliche Anwendung wäre die In-vitro-Expansion von menschlichen NKT-Zellen. Es ist durchaus machbar und durchaus möglich, eine große Anzahl menschlicher NKT-Zellen in vitro zu züchten, zum Beispiel durch antigene Stimulation, was mit Tetrameren oder mit Zellen mit den richtigen Glykolipiden erfolgen könnte. Und zusätzlich zur Verwendung des Tetramers oder der Zellen müssen Sie Zytokin hinzufügen.

Aber unter diesen Bedingungen kann man eine große Anzahl menschlicher NK-T-Zellen vermehren. Und eine andere Gruppe ist mindestens eine Gruppe in Boston, die an dieser Art von Therapie interessiert ist, im Gegensatz zur Glykolipid-basierten Therapie. Ein weiterer Teil meines Labors befasst sich mit der Untersuchung der Immunität der Schleimhaut.

Die meisten Immunologen konzentrierten sich auf die Lymphozyten oder weißen Blutkörperchen im Lymphknoten und in der Milz. Und doch befindet sich die Mehrheit, die in unserem Körper vorkommt, vielleicht tatsächlich in der Darmschleimhaut, einer Stelle, an der wir auch zwischen dem 10. und dem 14. und wahrscheinlich dem 10. bis 15. Bakterium haben. Wir sind also aus mikrobieller Sicht meist steril, aber nicht in unserem Darm.

Und auch im Darm haben wir eine sehr große Ansammlung von weißen Blutkörperchen. Diese Zellen haben einzigartige Eigenschaften und sind eigentlich noch etwas wenig erforscht. Wir haben also einige grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen dieser Zellen.

Aber wir untersuchen auch einen Prozess dessen, was ich als Immundysregulation bezeichnen würde, den Darm, der zu entzündlichen Darmerkrankungen führt, was im Grunde immunvermittelte Erkrankungen des Dünn- oder Dickdarms sind, und sie werden Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa genannt. Und obwohl wir etwas menschliche Arbeit leisten, findet der größte Teil unserer Arbeit in Mausmodellen statt. Wir haben das, was ich für sehr gute Mausmodelle halte, für die Dysregulation des mukosalen Immunsystems, die zu Morbus Crohn-ähnlichen Symptomen führt.

Wir untersuchen diesen Prozess und Möglichkeiten, in diesen Prozess einzugreifen, letztendlich in der Hoffnung, bessere Therapien für Patienten zu entwickeln, die an diesen immunvermittelten Krankheiten leiden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir vielleicht ein wenig darüber nachdenken, wohin sich die Immunologie in den nächsten 10 Jahren entwickeln wird, und es ist wirklich schwierig, 10 Jahre in die Zukunft zu blicken. So überraschend das klingen mag.

Ich denke, dass das Immunsystem der Schleimhäute tatsächlich eines der wichtigsten unerforschten Gebiete der Immunologie ist. Obwohl sich immer mehr Menschen und immer mehr der hochkarätigen Gruppen für Studien zur Schleimhautimmunologie interessieren. Ich denke, ein weiterer Bereich, der enorme Auswirkungen haben wird, ist die Genetik, und insbesondere die Humangenetik: Wenn wir migrieren oder vordringen, sollte ich sagen, zu den 1.000 Sequenzen eines Genoms eines menschlichen Genoms vordringen, wird es wirklich möglich sein, Studien an Individuen durchzuführen und zu beurteilen, wie sich die DNA-Variabilität auf die Immunantwort auswirkt.

Im Moment beziehen die meisten der besten Untersuchungen grundlegender Signalwege Nagetiere ein. Nagetiere, insbesondere Mäuse, sind für unsere Studien von entscheidender Bedeutung. Aber ich denke, dass wir in Zukunft, wenn wir komplexe Autoimmunphänomene oder andere Dinge betrachten, die bei Individuen vor sich gehen könnten, in der Lage sein werden, dies auf der Grundlage menschlicher genetischer Polymorphismen zu tun.

Wir werden in der Lage sein, die Polymorphismen zu bewerten und dann diese Informationen zu nutzen, um vorherzusagen, wie sich dies auf die Immunreaktionen auswirken wird, und schließlich zu dem zu gelangen, was ich als personalisierte Immuntherapien bezeichnen würde und was andere als personalisierte Immuntherapie bezeichnen würden, oder im weiteren Sinne personalisierte Medizin. Die Genetik wird also einen enormen Einfluss haben. Wir haben bereits großartige Werkzeuge in der Mausgenetik.

Wir können jedes Gen ausschalten, das wir wollen. Wir können die Expression von Genen in bestimmten Zelltypen ausschalten. Wir können erstaunliche Dinge tun.

Aber ich denke, in Zukunft werden wir uns damit befassen, die Immunantwort und Immunität aus der Sicht der menschlichen Reaktionen zu verstehen.