Interview: Glycolipid Antigen-Präsentation durch CD1d und das therapeutische Potenzial von NKT Zellen-Aktivierung

Hallo, mein Name ist Mitchell Cronenberg und ich befinde mich am La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Eigentlich bin ich Präsident und wissenschaftlicher Direktor, aber ich leite gleichzeitig ein sehr aktives Forschungslabor, und genau darüber werden wir natürlich sprechen – insbesondere über eine der Technologien, die wir nutzen, nämlich CD1D-Tetramere. Der größte Teil der Arbeit in meinem Labor befasst sich mit CD1D-reaktiven T-Zellen.

Und diese Zellen sind einzigartig, weil sie Glykolipide statt Peptide erkennen. Ein weiterer Forschungsbereich meines Labors beschäftigt sich mit einem völlig anderen Thema, dem Schleimhaut-Immunsystem und dessen Regulation. CD1-Moleküle sind Antigen-präsentierende Moleküle, was bedeutet, dass sie Antigene oder Fragmente von Proteinen oder anderen Molekülen binden und diese für die Erkennung durch T-Zellen präsentieren.

Es gibt nun tatsächlich zwei verschiedene Arten von antigenpräsentierenden Molekülen. Einige binden oder präsentieren Peptide, während andere Lipide und Glykolipide binden. Die CD1-Moleküle halten Lipide und Glykolipide.

Das ist ihre Funktion, und sie binden bzw. präsentieren diese Lipide und Glykolipide für T-Zellen. Tatsächlich gibt es vier verschiedene Arten von CD1-Molekülen: CD1A, CD1B, CD1C und CD1D. Wir konzentrieren uns insbesondere auf CD1D, das vermutlich am besten untersucht ist, unter anderem weil Mausmodelle existieren. CD1D präsentiert Glykolipide einer besonderen Art von T-Zelle, der sogenannten natürlichen Killer-T-Zelle, einer ungewöhnlichen weißen Blutkörperchenart, die Merkmale der angeborenen und adaptiven Immunantwort aufweist.

Die präsentierten Glykolipide können körpereigene Glykolipide sein, obwohl diese bisher nicht sehr gut charakterisiert sind, oder sie können mikrobielle Glykolipide sein. Die Glykolipide, von denen wir wissen, dass sie präsentiert werden, stammen aus zwei Quellen. Eine Quelle sind sogenannte FMS-Bakterien, die vermutlich die häufigsten Bakterien in der Biosphäre sind.

Sie leben im Ozean, sie leben in Pflanzen, sie leben im Boden. Dennoch verursachen sie bei vielen Menschen keine Krankheiten. Wir sind es wohl sehr gewohnt, mit diesen Bakterien zu leben.

Und die zweite uns bekannte Kategorie, eine andere Art von Glykolipiden, sogenannte Diacylglycerol-haltige Glykolipide. Diese kommen in Borrelia burgdorferi vor, dem Erreger der Lyme-Borreliose, und vermutlich auch in vielen anderen Krankheitserregern. Wir beginnen erst jetzt, die verschiedenen Bakterientypen zu identifizieren, die diese Glykolipide besitzen.

Wir haben also sogenannte Glycosphingolipide von SMS und Diacylglycerol-Lipide von Borrelia und vermutlich viele andere, die tatsächlich pathogen sind. Diese Lipide werden vorwiegend auf CD1d-Moleküle dendritischer Zellen geladen, möglicherweise aber auch auf B-Lymphozyten, Kupffer-Zellen in der Leber und vielleicht andere Zelltypen. Diese CD1d-Moleküle durchlaufen Lysosomen und Endosomen, wo sie wahrscheinlich diese Lipide binden, und transportieren anschließend das Lipid an die Zelloberfläche, wo es durch T-Zellen erkannt wird, einschließlich der bereits erwähnten natürlichen Killer-T-Zellen.

Eines der Dinge, die geschehen, wenn Sie einem Bakterium ausgesetzt sind, das Glykolipide besitzt, ist, dass die NK-T-Zellen sehr schnell aktiviert werden. Konventionelle T-Zellen, also peptidreaktive T-Zellen, benötigen typischerweise drei bis vier Tage, um eine gute Immunantwort zu entwickeln, insbesondere wenn sie keine Erfahrung mit dem Antigen haben.

Anders ausgedrückt: Wenn sie, sind sie naiv. Im Gegensatz dazu können die NK-T-Zellen innerhalb von Stunden aktiviert werden und beginnen bereits, Zytokine wie Gamma-Interferon zu produzieren, das für die bakterielle Eliminierung in sehr, sehr kurzer Zeit wichtig ist. Auf diese Weise ähneln sie Aspekten der angeborenen Immunantwort aus dem Modell.

Wenn man Modellantigene untersucht, weiß man, dass CD1D in späte Endosomen und Lysosomen gelangt, also in sehr saure intrazelluläre Kompartimente, in denen die Glykolipid-Antigene in CD1 geladen werden. Tatsächlich gibt es spezielle Transferproteine innerhalb der antigenpräsentierenden Zellen wie der dendritischen Zellen, die dabei helfen, die Lipide in das CD1D-Molekül einzulagern. Bei diesen Fona-Bakterien, Borre-Bakterien und anderen handelt es sich um extrazelluläre Bakterien. Die Lipidantigene müssen daher irgendwie in die Zelle transportiert werden, vermutlich in ein Lysosom, um in das CD1-Molekül geladen zu werden.

Und dann erfolgt eine sofortige Aktivierung der NKT-Zelle, und all dies muss innerhalb weniger Stunden in den Sinusoiden der Leber, in der Milz, möglicherweise im Knochenmark und anderen Orten, an denen NKT-Zellen vorkommen, stattfinden. Die tetramere Struktur ist entscheidend, um diese natürlichen Killer-T-Zellen eindeutig zu definieren, die diese angeborenen Eigenschaften besitzen, die sie von anderen T-Zellen unterscheiden. Die anderen verfügbaren Marker sind tatsächlich zu unspezifisch, doch die Tetramere ermöglichen es Ihnen, die Zellen anhand der Spezifität ihres Antigenrezeptors zu identifizieren, was entscheidend dafür ist, sie zu definieren. Die Herstellung von Tetrameren reicht lange zurück.

Es wurde von Mark Davis und John Alman erfunden, und die Idee bestand darin, dass der T-Zell-Rezeptor eine geringe Affinität aufweist und die Peptide, die sie erkennen, oder die Komplexe aus Peptiden und antigenpräsentierenden Molekülen, wenn man Zellen anhand ihrer Spezifität definieren oder identifizieren möchte, nicht über ausreichend Affinität bzw. Bindungsstärke verfügen, um die Identifizierung der Zelle zu ermöglichen. Mark Davis und John Allman entwickelten daher die Tetramer-Technologie, eine Methode, um in einigen Fällen Tetramere aus den antigenpräsentierenden Molekülen und den von ihnen präsentierten Molekülen herzustellen, wodurch im Wesentlichen die Affinität oder Stärke der Wechselwirkung erhöht wird. So kann man die Zelle sichtbar machen, die spezifisch für ein Grippe-Peptid und ein bestimmtes antigenpräsentierendes Molekül – oder welches Antigen auch immer von Interesse ist – reagiert.

Sehr wichtige Technologie, da sie es Ihnen beispielsweise ermöglicht, zu beurteilen, wie wirksam ein Impfschema sein könnte. Was wir Anfang der späten neunziger Jahre begonnen haben, ursprünglich eine 2000 veröffentlichte Arbeit, die mittlerweile etwa 500-mal zitiert wurde. Was wir getan haben, war lediglich, diese Technologie auf Lipide zu übertragen.

Wir stellten also lösliche CD1-Moleküle her und konnten sie – mittels Methoden, die ich kurz beschreiben werde – multimerisieren, das heißt, sie mit spezifischen Glykolipiden kombinieren. Auf diese Weise ließen sie sich als Reagenzien zur Untersuchung spezifischer T-Zell-Rezeptoren verwenden, also solcher Rezeptoren, die das Glykolipid, das uns interessiert, zusammen mit CD1D erkennen. Die Tetramere können in jeder Situation eingesetzt werden, in der man die Anzahl der NKT-Zellen sowie deren Aktivierungsstatus und Funktion analysieren möchte.

Und in unserem Labor kann dies aus einem von mehreren verschiedenen Projekten stammen. Wenn Sie beispielsweise untersuchen möchten, ob ein bestimmter Mutant und ein Signalweg die Entwicklung von NK-T-Zellen beeinflussen, können wir dies mit unseren Tetrameren tun, indem wir die Anzahl der NKT-Zellen bestimmen. Außerdem gibt es andere Marker, andere Oberflächenproteine der Zellen, die wir analysieren können, um zu beurteilen, ob die NKT-Zellen reif sind oder aktiviert wurden. Mithilfe der Tetramere können wir nach einer antigenspezifischen Stimulation außerdem nicht nur feststellen, ob sie aktiviert sind, sondern auch, welche Zytokine sie produzieren.

Wir können also die Tetramer-Färbung beispielsweise mit einer intrazellulären Zytokin-Färbung kombinieren und untersuchen, welcher Anteil der NKT-Zellen Gamma-Interferon produziert, welcher Anteil IL-4 produziert und welcher Anteil beides produziert. Mithilfe der multiparametrischen Durchflusszytometrie können wir eine Vielzahl von Fragen zur Zytokinproduktion dieser Zellen direkt ex vivo beantworten. Außerdem können wir weitere Experimente durchführen. Beispielsweise können wir die Tetramere verwenden, um NK-T-Zellen für die Kultivierung in vitro zu reinigen, um zu untersuchen, wie sie mit anderen Zelltypen interagieren, oder sogar für die Übertragung auf ein Empfängertier, das beispielsweise aus genetischen Gründen keine NK-T-Zellen besitzt.

Wir möchten diese Funktion wiederherstellen. Das können wir tun und dabei untersuchen, wohin die Zellen wandern und wie sie funktionieren. Schließlich weiß ich, dass im Fall menschlicher NKT-Zellen tatsächlich Tetramere verwendet wurden, um Zelllinien in vitro zu expandieren, um Zellen für analytische Zwecke und möglicherweise sogar für therapeutische Zwecke zu kultivieren.

Nun, wir verwenden ein Bao-Virus-Expressionssystem zur Herstellung von CD1D-Tetrameren. Der Prozess beginnt also mit einem gemeinsamen DNA-Konstrukt, das den Promotor sowie die Expression von β2-Mikroglobulin und der CD1D-Schwererkette enthält. Dieses CD1-Molekül ist also ein Heterodimer aus zwei Polypeptidketten.

Wir verfügen also über dieses zweipromotorische Expressionssystem und infizieren Insektenzellkulturzellen mit den vao-Virus-Viren, die sorgfältig titriert wurden, wie unser Kanal erläutert hat. Anschließend infizieren wir die Zellen und gewinnen aus dem Zellkulturmedium das von den Zellen exprimierte Protein. Die CD1d-Schwere-Kette ist speziell für die Herstellung von Tetrameren konstruiert worden.

Es gibt zwei Dinge, oder besser gesagt drei Dinge, die wir tun. Erstens entfernen wir das transmembranäre Stück. Wir exprimieren also ein lösliches Protein.

Zweitens haben wir einen Hexa-His-Tag hinzugefügt, sodass das Protein mittels Metallionenchromatographie gereinigt werden kann. Und drittens verfügen wir über eine sogenannte BirA-Stelle für die enzymatische Biotinylierung. Dies stellt die Innovation dar.

Es war sehr wichtig, als Davis und Alman die Tetramer-Produktionstechnologie zuerst erfanden. Nachdem wir das Protein also gewonnen haben, wird es an einer Nickel-Säule mittels Nickel-Säulenchromatographie gereinigt. Manchmal führen wir danach eine Größenausschlusschromatographie durch.

Das Protein kann dann enzymatisch biotinyliert und inkubiert werden; sobald es enzymatisch biotinyliert ist, bildet es bei Inkubation mit Streptavidin-Antikörper (Strep-Ab) Tetramere. Das lösliche CD1-Protein kann grundsätzlich über Nacht in einer Lösung eines Glykolipids der Wahl inkubiert werden. Dabei ist es sehr wichtig, dass das Glykolipid nicht in DMSO gelöst ist, da dies typischerweise als Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel für Glykolipide verwendet wird, CD1 jedoch sehr empfindlich gegenüber DMSO ist.

Daher verwenden wir typischerweise einen Puffer, der eine geringe Menge Tween und PBS enthält. Dieser Puffer ist sehr wirksam beim Lösen der meisten unserer Glykolipide. Zum Beladen von CD1d, was anscheinend spontan erfolgt, verwenden wir Streptavidin von einem beliebigen aus einer Vielzahl von Herstellern.

Und es ist mit PE, FITC, Erythrosin oder einem PC-Phycocyanin-Farbstoff gekoppelt, wobei jeder dieser Farbstoffe sehr gut zu funktionieren scheint und uns eine sehr gute Färbung liefert. Insgesamt unterscheidet sich das Verfahren also nicht wesentlich von den gut etablierten Verfahren zur Herstellung von MHC-Klasse-I-Tetrameren, mit dem Unterschied, dass wir keine bakterielle Expression verwenden, sondern die Expression über Bakteriophagen, und natürlich verfügen wir über Lipidantigene anstelle von Peptiden. Ein Punkt, den ich betonen sollte, ist, dass Menschen NK-T-Zellen besitzen, die dieselbe Spezifität wie die NK-T-Zellen der Maus aufweisen.

Die Spezifität besteht also seit mindestens 60 Millionen Jahren, seit wir uns von den Nagetieren abgespalten haben, und tatsächlich stellen wir humane CD1d-Tetramere mit denselben Techniken her, die Sie in dem hier erstellten Video sehen können. Doch tatsächlich funktionieren humane NK-T-Zellen sehr gut mit Maus-Tetrameren und umgekehrt. Deshalb stellen wir die humanen Tetramere nicht so häufig her, da wir unsere Maus-Tetramere problemlos für Arbeiten am Menschen verwenden können.

Es gibt also viele Mausmodelle, in denen gezeigt wurde, dass NK-T-Zellen entscheidende Faktoren für den Verlauf der Immunantwort sind. Dies reicht von der Reaktion auf Krebserkrankungen und der Regulierung autoimmuner Erkrankungen über die Eliminierung infektiöser Erreger bis hin zur Entwicklung sklerotischer Plaques, einem chronisch-entzündlichen Prozess, der in den Arterien auftritt.

Es gibt einige, gewisse Zweifel hinsichtlich der Bedeutung dieser Zellen beim Menschen, wo sie etwas seltener vorkommen. Es gab zahlreiche Berichte, die darauf hindeuten, dass sie in autoimmunen Zuständen verändert sind, und es gibt auch Berichte, die zeigen, dass sie in den Lungen von Asthmapatienten stark angereichert sind. Obwohl diese Berichte einen Bericht im England Journal of Medicine beinhalten, besteht hierüber eine gewisse Kontroverse. Es gibt jedoch eine Reihe von Studien am Menschen, die darauf hindeuten, dass diese Zellen wichtig sein könnten.

In Bezug auf klinische Studien wurde die Stimulation von NKT-Zellen in vier Phase-I-Studien an Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen getestet. Es gibt einige Hinweise auf Wirksamkeit; natürlich sind diese Patienten sehr krank, und die Studien laufen noch in mehreren verschiedenen Krebsarten. Außerdem gibt es Forscher, die daran interessiert sind, die NK-T-Zell-Mediathetherapie auch bei Autoimmunerkrankungen einzusetzen, obwohl dies bisher noch nicht in die Praxis umgesetzt wurde.

Tetramere können in diesen Studien hauptsächlich im Hinblick auf die Analyse der Geschehnisse mit den NKT-Zellen nach der Agonisten-Therapie eine Rolle spielen. Die übliche Vorgehensweise besteht darin, Glykolipid-Agonisten oder in einigen Fällen sogar Glykolipid-Antagonisten – an denen andere Arbeitsgruppen arbeiten – je nach Reaktion und Zustand einzusetzen. Anschließend wird untersucht, was mit den NK-T-Zellen geschah, was man normalerweise mithilfe von Tetrameren durchführt.

Eine weitere mögliche Anwendung wäre die in-vitro-Expansion menschlicher NKT-Zellen. Es ist durchaus machbar und gut möglich, große Mengen menschlicher NKT-Zellen in vitro zu kultivieren, beispielsweise durch antigene Stimulation, die entweder mit Tetrameren oder mit Zellen, die die geeigneten Glykolipide enthalten, durchgeführt werden kann. Zusätzlich zur Verwendung von Tetrameren oder Zellen muss ein Zytokin hinzugefügt werden.

Doch unter diesen Bedingungen können große Zahlen menschlicher NK-T-Zellen vermehrt werden. Und mindestens eine Gruppe in Boston interessiert sich für diese Art der Therapie im Gegensatz zur glykolipidbasierten Therapie. Ein weiterer Bereich meines Labors beschäftigt sich mit der Erforschung der Schleimhautimmunität.

Die meisten Immunologen konzentrieren sich auf die Lymphozyten oder weißen Blutkörperchen in Lymphknoten und Milz. Doch möglicherweise findet man die Mehrheit dieser Zellen in unserem Körper tatsächlich in der Darmschleimhaut, einem Ort, an dem wir zudem zwischen 10¹⁰ und 10¹⁴ sowie 10¹⁵ Bakterien haben. Aus mikrobiologischer Sicht sind wir also größtenteils steril, nicht jedoch im Darm.

Und auch im Darm verfügen wir über eine sehr große Ansammlung von weißen Blutkörperchen. Diese Zellen weisen einzigartige Eigenschaften auf und sind tatsächlich bisher nur wenig erforscht. Daher führen wir einige Grundlagenforschungsuntersuchungen an diesen Zellen durch.

Doch wir untersuchen auch einen Prozess, den ich als immunologische Fehlregulation bezeichnen würde, bei dem der Darm zu entzündlichen Darmerkrankungen führt, die im Wesentlichen immunvermittelte Erkrankungen des Dünndarms oder Dickdarms sind und unter den Namen Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa bekannt sind. Obwohl wir auch am Menschen arbeiten, konzentrieren wir uns größtenteils auf Mausmodelle. Wir verfügen über Mausmodelle, die meiner Ansicht nach sehr gut die Fehlregulation des Mukosa-Immunsystems abbilden, die zu morbus-Crohn-ähnlichen Symptomen führt.

Wir untersuchen diesen Prozess und auch Möglichkeiten, in diesen Prozess einzugreifen, letztendlich in der Hoffnung, bessere Therapien für Patienten zu entwickeln, die an diesen immunvermittelten Erkrankungen leiden. Abschließend können wir uns daher kurz fragen, wohin sich die Immunologie in den nächsten etwa 10 Jahren entwickeln wird – eine Perspektive, die wirklich schwer vorauszusehen ist, so überraschend das auch klingen mag.

Ich denke tatsächlich, dass das mukosale Immunsystem eines der größten bislang unerforschten Gebiete der Immunologie ist. Obwohl immer mehr Personen und immer mehr hochkarätige Arbeitsgruppen Interesse an Studien zur mukosalen Immunologie zeigen. Ich denke, ein weiterer Bereich, der enorme Auswirkungen haben wird, ist die Genetik, insbesondere die Humangenetik, da wir voranschreiten – oder besser gesagt, uns weiterentwickeln – hin zur Sequenzierung von 1.000 menschlichen Genomen. Dann wird es wirklich möglich sein, Studien an Einzelpersonen durchzuführen und zu untersuchen, wie die Variabilität der DNA die Immunantwort beeinflusst.

Derzeit umfassen die meisten der besten Untersuchungen grundlegender Signalwege Nagetiere. Nagetiere, insbesondere Mäuse, sind für unsere Studien äußerst wichtig. Doch ich denke, dass wir in Zukunft, wenn wir komplexe autoimmune Phänomene oder andere Vorgänge betrachten, die bei Individuen auftreten können, dies auf der Grundlage menschlicher genetischer Polymorphismen durchführen können.

Wir werden in der Lage sein, die Polymorphismen zu bewerten und diese Informationen dann nutzen, um vorherzusagen, wie sich dies auf Immunantworten auswirken wird, und uns schließlich in Richtung dessen zu bewegen, was ich – und was andere – als personalisierte Immuntherapien oder im weiteren Sinne als personalisierte Medizin bezeichnen würde. Die Genetik wird daher eine enorme Bedeutung haben. Wir verfügen bereits über hervorragende Werkzeuge in der Mausgenetik.

Wir können jedes Gen ausschalten, das wir möchten. Wir können die Expression von Genen in bestimmten Zelltypen ausschalten. Wir können erstaunliche Dinge tun.

Aber ich denke, dass wir in Zukunft das Verständnis der Immunantwort und Immunität aus der Perspektive menschlicher Reaktionen betrachten werden.