Name: Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Lernen Sie eine auf organischen Lösungsmitteln basierende Proteinfällungsmethode für die Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie. Dieses Protokoll maximiert Proteinrückgewinnung und Reinheit in wenigen Minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.

1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit.</li>
	<li>Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen. HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind.</li>
	<li>Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Polypropylen (PP), die ausreicht, um das erforderliche Volumen an Proben und Lösungsmitteln zu erhalten, um die Ausfällung zu induzieren.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die SDB-Konzentration in der auszufällenden Probe nicht größer als 2 % (w/v) ist. Wenn SDS höher ist, verdünnen Sie die Probe mit Wasser.</li>
	<li>Stellen Sie eine Proteinkonzentration zwischen 0,01 und 10 g/L für eine optimale Fällungseffizienz sicher. HINWEIS: Die optimale Masse für die Ausfällung liegt zwischen 1-100 μg Protein.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel und Lösungen vor dem Gebrauch frei von Feinstaub sind. Führen Sie entweder eine Filtration (<0,5 μm) oder einen Zentrifugationsschritt (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) durch, um ungelöste Partikel zu entfernen.</li>
	<li>Wenn Disulfidbindungsreduktion und Alkylierung erforderlich sind, führen Sie diese Schritte vor der Proteinausfällung durch. Überschüssige reduzierende und alkylierende Reagenzien werden durch den Fällungsprozess entfernt.</li>
	<li>Fallen Sie die Proteine aus, indem Sie eines der Protokolle auswählen und ausführen (Schritte 2, 3, 4 oder 5).</li>
</ol>2. Schnelle (Fläschchen-basierte) Proteinfällung mit Aceton
<ol><li>90 μL (partikelfreie) Protein- oder Proteomlösung in ein PP-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 μL wässriges NaCl von 1 M hinzu. HINWEIS: Wenn die Ionenstärke des Proteomextrakts bereits 100 mM übersteigt, ist kein zusätzliches Salz erforderlich.</li>
	<li>Pipettieren Sie 400 μL Aceton in die Probe. Verschließen Sie die Durchstechflasche und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Ein kräftiges Mischen ist nicht erforderlich. HINWEIS: Das Volumen von Protein, Salz und Aceton kann erhöht werden, solange das relative Verhältnis von jedem beibehalten wird.</li>
	<li>Lassen Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur ungestört mindestens 2 min inkubieren. HINWEIS: Längere Inkubationen, einschließlich solcher bei reduzierter Temperatur (z. B. herkömmliche Acetonfällung verwendet über Nacht Niederschlag im Gefrierschrank), können zur Bildung größerer (sichtbarer) aggregierter Proteinpartikel führen (Abbildung 1A), die im Allgemeinen die gesamte Proteinrückgewinnung nicht verbessern.</li>
	<li>Legen Sie nach der Inkubation Proben in eine Zentrifuge und notieren Sie die Ausrichtung der Durchstechflasche. Drehen Sie für mindestens 2 min, bei 10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Lösen Sie die Durchstechflasche und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie die Durchstechflasche langsam in einen Abfallbehälter umdrehen. Befestigen Sie die umgekehrte Durchstechflasche mit einem Papiertuch, um Lösungsmittelreste aus der Durchstechflasche zu ziehen. VORSICHT: Lösungsmittelabfälle sollten gemäß den entsprechenden Protokollen aufbewahrt und entsorgt werden.</li>
	<li>Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. HINWEIS: Schritt 2.6 ist optional.<ol><li>Zentrifugieren Sie die Probe sofort (10.000 x g oder höher für 1 min bei Raumtemperatur) und legen Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 2.5 beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Lassen Sie die Probe bei geöffneter Kappe vollständig trocknen (~ 1 min). Rekapitulieren Sie die Durchstechflasche und fahren Sie mit der Solubibilisierung des Pellets fort (Schritt 6).</li>
</ol>3. Ausfällung von niedermolekularen (LMW) Peptiden (ZnSO4 + Aceton)
<ol><li>Geben Sie 54 μL Proteomextrakt in eine 2 ml PP-Durchstechflasche ab und fügen Sie dann 6 μL 1 M ZnSO4 hinzu. HINWEIS: Eine optimale Rückgewinnung von LMW-Peptiden (≤5 kDa) wird durch Zugabe von Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % erreicht. Unter der Annahme einer 2 ml PP-Durchstechflasche beträgt das maximale Anfangsprobenvolumen 54 μL.</li>
	<li>1940 μL Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % hinzufügen. Zum Mischen vorsichtig schwenken und mindestens 2 min ungestört auf der Tischplatte stehen lassen.</li>
	<li>Zentrifen Sie (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Durchstechflasche umkehren und dann die Durchstechflasche mit einem Papiertuch berühren.</li>
	<li>Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. HINWEIS: Schritt 3.4 ist optional.<ol><li>Die Probe wird sofort gemäß Schritt 3.3 zentrifugiert, wobei die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor gelegt wird. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 3.3 beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Das resultierende trockene Pellet in einem wässrigen Lösungsmittel mit kurzer Vortex oder Beschallung (~ 5 min) wieder auflösen.</li>
</ol>4. Proteinausfällung durch Chloroform/Methanol/Wasser (CMW)
<ol><li>Geben Sie 100 μL der Protein- oder Proteomlösung in eine PP-Durchstechflasche ab. 400 μL Methanol hinzufügen, gefolgt von 100 μL Chloroform. Die Durchstechflasche und den Wirbel kurz verschließen, um sie zu mischen. HINWEIS: Für den CMW-Niederschlag werden 1,5 ml Fläschchen mit schmalem Boden bevorzugt (Abbildung 2A). ACHTUNG: Chloroform-Lösungsmittel sollte in einer geeigneten Lüftungshaube gehandhabt werden. Alle Lösungsmittel, die mit Chloroform in Berührung kommen, sollten bei der Entsorgung als halogenierter Abfall behandelt werden.</li>
	<li>Dosieren Sie schnell 300 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche. Lassen Sie die Probe 1 min lang ungestört auf der Tischplatte sitzen. HINWEIS: Die Lösung wird sofort wolkig weiß angezeigt. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche nach Zugabe von Wasser zu mischen.</li>
	<li>Legen Sie die PP-Durchstechflasche in eine Zentrifuge und drehen Sie sie für mindestens 5 Minuten (10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur). HINWEIS: Nach der Zentrifugation bilden sich zwei sichtbare Lösungsmittelschichten (obere Schicht = Methanol/Wasser; unten = Chloroform). An der Lösungsmittelgrenzfläche bildet sich ein festes Proteinpellet (Abbildung 2A).</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer großen Mikropipettenspitze (1 ml) und halten Sie die Durchstechflasche bei ~ 45 ° und entfernen Sie ~ 700 μL des Lösungsmittels mit einer gleichmäßigen Rate aus der oberen Schicht.</li>
	<li>Verwenden Sie eine kleinere (200 μL) Mikropipettenspitze, um die obere Lösungsmittelschicht von der ~ 45 ° geneigten Durchstechflasche zu entfernen. In einer kontinuierlichen Bewegung pipettieren, bis die obere Lösungsmittelschicht eine Perle in der Durchstechflasche bildet.</li>
	<li>400 μL frisches Methanol in die Durchstechflasche der Probe geben, ohne das Pellet zu stören, indem das Lösungsmittel an der Seite der Durchstechflasche abgegeben wird.</li>
	<li>Verschließen Sie die Durchstechflasche. Kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln. HINWEIS: Es ist wichtig, eine Störung des Pellets zu vermeiden. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.</li>
	<li>Unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche im Rotor zentrifugieren Sie mindestens 10 min (10.000 x g bei Raumtemperatur). Das Proteinpellet haftet am Boden der Durchstechflasche (Abbildung 2B).</li>
	<li>Kippen Sie die Durchstechflasche um 45°, wobei das Pellet nach unten zeigt. Platzieren Sie die Pipettenspitze entlang der Oberkante der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer 1 ml Mikropipettenspitze mit einer langsamen, aber kontinuierlichen Geschwindigkeit. Halten Sie ~ 20 μL Lösungsmittel in der Durchstechflasche zurück.</li>
	<li>Waschen Sie das Proteinpellet für SDS-haltige Proben, indem Sie langsam 400 μL frisches Methanol dosieren. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.<ol><li>Fahren Sie direkt mit der Zentrifugation fort (10.000 x g für 2 min bei Temperatur) und legen Sie die Durchstechflasche mit der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel gemäß Schritt 4.9. Lassen Sie die Probe in einem Rauch an der Luft trocknen, bis das restliche Lösungsmittel verdunstet.</li>
	<li>Konsultieren Sie die empfohlenen Resolubilisierungsverfahren in Schritt 6.</li>
</ol>5. Proteinfällung mit einer Einweg-Filterpatrone
HINWEIS: Jedes in den Schritten 2-5 beschriebene lösungsmittelbasierte Fällungsprotokoll kann in einer zweistufigen Filtrations- und Extraktionskartusche durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Wenn der Stecker an der oberen Filterpatrone befestigt ist (Abbildung 3A), dosieren Sie das gewünschte Volumen des extrahierten Proteoms, Salzes und Lösungsmittels, wie in einer der drei folgenden Optionen beschrieben.<ol><li>(Option 1) Für die Proteinfällung mit Aceton 90 μL Protein- oder Proteomlösung, 10 μL 1 M wässriges NaCl und 400 μL Aceton kombinieren. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch. HINWEIS: Für konzentrierte Proteinproben (1 g/L) entsteht ein sichtbarer Niederschlag (Abbildung 3B).</li>
		<li>(Option 2) Für die LMW-Peptidfällung kombinieren Sie 15 μL der Probe, 1,5 μL 1 MZnSO 4 und 485 μL Aceton. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch. HINWEIS: Eine Salzkonzentration von 90 mM in der wässrigen Probe hat keinen Einfluss auf die Erholung im Vergleich zu den in Schritt 3 empfohlenen 100 mM.</li>
		<li>(Option 3) Für die CMW-Fällung fügen Sie 50 μL Proteomextrakt, 200 μL Methanol und 50 μL Chloroform hinzu. Die Durchstechflasche verschließen und kurz zum Kombinieren umdrehen.<ol><li>Geben Sie schnell 150 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche ab. Inkubieren Sie für 1 min auf der Tischplatte.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifuge für 2 min bei 2.500 x g bei Raumtemperatur mit dem Stecker noch an der Filterkartusche befestigt.</li>
	<li>Drehen Sie die Patrone um, schrauben Sie sie ab und entfernen Sie den Stecker von der Patronenbasis.</li>
	<li>Legen Sie die Filterpatrone in eine saubere Durchstechflasche und kehren Sie sie zur Zentrifuge zurück. Drehen Sie für 3 Minuten bei 500 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Durchflusslösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche. HINWEIS: Wenn in der oberen Filterpatrone Lösungsmittel verbleibt, kehren Sie zur Zentrifuge zurück und führen Sie eine zusätzliche Drehung durch.</li>
	<li>Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 μL Aceton in die Filtrationskartusche geben (bei CMW-Fällung in Schritt 5.1.3 400 μL Methanol zugeben).</li>
	<li>Zentrifuge für 3 min bei 500 x g bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Kartusche verbleibt.</li>
	<li>Das Fällungspellet wie in Schritt 6 beschrieben wieder auflösen.</li>
</ol>6. Resolubilisierung von Proteinpellets
<ol><li>Befeuchten Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche, indem Sie 2-5 μL Isopropanol unmittelbar vor den unten beschriebenen Resolubilisierungsprotokollen direkt auf die Membran dosieren.</li>
	<li>Befolgen Sie eine der folgenden Resolubilisierungsmethoden.<ol><li>(Option 1) Mindestens 20 μL wässriger Puffer mit ≥2% SDB in die Filtrationspatrone geben. Kappe und Wirbel kräftig (~1 min). Alternativ beschallen (>10 min), um das Proteinpellet zu dispergieren.<ol><li>Erhitzen Sie die Probe bei 95 °C für 5 min). Wiederholen Sie den Mischschritt nach dem Erhitzen. HINWEIS: Laemmli Gel-Ladepuffer kann das Proteinpellet wieder auflösen. SDS-haltige Proben sind jedoch nicht kompatibel mit Trypsin-Aufschluss und Umkehrphasen-LC und MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Option 2) Bereiten Sie eine Lösung von 80% (v/v) Ameisensäure in Wasser vor. Die saure Lösung (-20 °C) sowie die Filtrationskartusche mit ausgefälltem Protein werden vorgekühlt.<ol><li>Geben Sie 50 μL kalte Ameisensäure in die Kartusche; Kappe und Wirbel für 30 s. Zurück zum Gefrierschrank (-20 °C) für 10 min.</li>
			<li>Wirbeln Sie die Patrone erneut für 30 s. Wiederholen Sie dann den Kühl- und Mischzyklus noch einmal (10 min, -20 °C, 30 s Vortex).</li>
			<li>Fügen Sie Wasser zu einem endgültigen 500 μL hinzu und verdünnen Sie die Ameisensäure auf 8%. HINWEIS: Das kalte Ameisensäureprotokoll ist mit dem nachfolgenden Trypsinaufschluss nicht kompatibel, aber mit LC-MS kompatibel.</li>
		</ol></li>
		<li>(Option 3) 50 μL frisch zubereiteter 8 Mio. Harnstoff in Wasser in die Filterpatrone geben. Beschallung für 30 min.<ol><li>Lassen Sie die Kartusche 1 Stunde (bis über Nacht) auf der Tischplatte inkubieren.</li>
			<li>Verdünnen Sie den 8 M Harnstoff mindestens 5-fach mit Wasser oder einem geeigneten Puffer. HINWEIS: Nach der Verdünnung ist das Harnstoff-Solubilisierungsprotokoll mit der nachfolgenden Trypsin-Verdauung sowie LC-MS kompatibel.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Proteinverdauung
<ol><li>Für die Bottom-up-MS-Analyse unterziehen Sie die re-solubilisierten Proteine der enzymatischen Verdauung mit einer der beiden unten genannten Methoden.<ol><li>(Option 1) Bei der Ameisensäure-Resobilisierung ist das Anfangsvolumen von 80 % Ameisensäure in Schritt 6.2.2.1 auf 25 μl zu reduzieren. In Schritt 6.2.2.3 wird die Ameisensäure mit 375 μl Wasser auf 5 % (v/v) verdünnt.</li>
		<li>Geben Sie Pepsin mit einem ungefähren Protein-Enzym-Verhältnis von 50:1 in die Kartusche ab. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur mit einem an der Filterpatrone befestigten Stecker.</li>
	</ol></li>
	<li>(Option 2) Für die Resolubilisierung in Harnstoff ist ein pH-Wert zwischen 8 und 8,3 unter Einbeziehung von 100 mM Tris oder Ammoniumbicarbonat in Schritt 6.2.3.2 sicherzustellen.<ol><li>Fügen Sie Trypsin bei einem ungefähren Verhältnis von Protein zu Enzymmasse von 50: 1 hinzu. Mit einem an der Kartusche befestigten Stecker wird die Probe über Nacht in einem warmen Wasserbad bei 37 °C inkubiert.</li>
		<li>Beenden Sie den Aufschluss, indem Sie die Lösung mit 10% TFA auf ein letztes 1% ansäuern.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewinnen Sie das Pepsin- oder Trypsin-verdaute Protein zurück, indem Sie den Pfropfen von der Basis des Filters entfernen und die in einer sauberen Durchstechflasche enthaltene Kartusche zentrifugieren (2 min, 5000 x g, Raumtemperatur).</li>
</ol>8. SPE-Bereinigung
HINWEIS: Für eine zusätzliche Probenentsalzung nach dem Aufschluss oder Lösungsmittelaustausch kann die Probe wie beschrieben einer umgekehrten Phasenreinigung unterzogen werden.
<ol><li>Grundierung einer SPE-Kartusche (siehe Materialtabelle) durch Passieren von 300 μL Methanol (2 min, 400 x g), gefolgt von 300 μL 5% Acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Schließen Sie die grundierte SPE-Kartusche an die Basis der Filtrationskartusche an, die resolubilisiertes oder verdautes Protein enthält.</li>
	<li>Drehen Sie das Protein durch die SPE-Kartusche (5 min, 800 x g bei Raumtemperatur). Wenn das Lösungsmittel in der oberen Kartusche verbleibt, bringen Sie die Kartusche zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie die Drehung. HINWEIS: Wenn Sie die Probe ein zweites Mal durch die SPE-Kartusche führen, kann dies die Wiederherstellung verbessern.</li>
	<li>300 μL 5 % Acetonitril/0,1 % TFA in Wasser in die Kartusche geben. Zum Waschen durch die SPE-Kartusche (2 min, 2000 x g) fließen. Verwerfen Sie den Flow-Through.</li>
	<li>Für LMW-Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 μL 50% Acetonitril/0,1% TFA (5 min, 2500 x g) fließen lassen.</li>
	<li>Für intakte Proteine folgen Sie Schritt 8.5 mit einem zusätzlichen Elutionsschritt mit 300 μL 75% Acetonitril/0,1% TFA. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte. HINWEIS: Schritt 8.6 ist optional.</li>
</ol>

Das Doucette-Labor konzipierte und patentierte die ProTrap XG, die in dieser Studie verwendet wurde. AAD ist auch Gründungspartner von Proteoform Scientific, das die Probenvorbereitungskartusche vermarktet hat.

Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne das Prot...

Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle Phasen des Workflows hinweg quantitativ zurückzugewinnen 6,7,8,9,10,11 . Um den Proteomstatus eines biologischen Systems genau widerzuspiegeln, müssen Proteine effizient und unvoreingenommen aus der nativen Probenmatrix isoliert werden. Zu diesem Zweck gewährleistet die Einbeziehung eines denaturierenden Tensids wie Natriumdodecylsulfat (SDS) eine effiziente Proteinextraktion und -solubilisierung12. SDS stört jedoch stark die Elektrospray-Ionisation, was zu einer starken MS-Signalunterdrückung führt, wenn es nicht ordnungsgemäß eliminiertwird 13.
Für die anschließende Proteomanalyse stehen verschiedene SDS-Depletionsstrategien zur Verfügung, wie z.B. die Retention von Proteinen über einem Molekulargewichts-Cutoff-Filter, der in Einweg-Spinkartuschen14,15,16 enthalten ist. Die filtergestützte Probenvorbereitungsmethode (FASP) wird bevorzugt, da sie SDS unter 10 ppm effektiv erschöpft und eine optimale MS ermöglicht. Die Proteinrückgewinnung mit FASP ist jedoch variabel, was die Erforschung anderer Techniken veranlasste. Chromatographische Ansätze, die selektiv Protein (oder Tensid) einfangen, haben sich zu verschiedenen praktischen Kartuschen oder perlenbasierten Formaten entwickelt 17,18,19,20,21. Angesichts dieser einfachen und (idealerweise) konsistenten Strategien zur Proteinreinigung wird der klassische Ansatz der Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln oft als vielversprechender Ansatz zur Proteinisolierung übersehen. Während gezeigt wird, dass die Ausfällung von Lösungsmitteln SDS erfolgreich unter kritische Werte abbaut, ist die Proteinrückgewinnung seit langem ein Problem dieses Ansatzes. Mehrere Gruppen haben eine Proteinrückgewinnungsverzerrung beobachtet, mit inakzeptabel niedrigen Niederschlagsausbeuten als Funktion der Proteinkonzentration, des Molekulargewichts und der Hydrophobie22,23. Aufgrund der Vielfalt der in der Literatur berichteten Niederschlagsprotokolle wurden standardisierte Niederschlagsbedingungen entwickelt. Im Jahr 2013 berichteten Crowell et al. erstmals über die Abhängigkeit der Ionenstärke von der Ausfällungseffizienz von Proteinen in 80% Aceton24. Für alle untersuchten Proteine erwies sich die Zugabe von bis zu 30 mM Natriumchlorid als unerlässlich, um die Ausbeute zu maximieren (bis zu 100% Rückgewinnung). In jüngerer Zeit zeigten Nickerson et al., dass die Kombination von noch höherer Ionenstärke (bis zu 100 mM) mit erhöhter Temperatur (20 °C) während der Acetonfällung zu einer nahezu quantitativen Erholung in 2-5 min25 führte. Es wurde ein leichter Rückgang der Rückgewinnung von niedermolekularen (LMW) Proteinen beobachtet. Daher zeigte ein nachfolgender Bericht von Baghalabadi et al. die erfolgreiche Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptiden (≤5 kDa) durch Kombination spezifischer Salze, insbesondere Zinksulfat, mit einem höheren Gehalt an organischem Lösungsmittel (97% Aceton)26.
Während die Verfeinerung des Fällungsprotokolls eine zuverlässigere Proteinreinigungsstrategie für MS-basierte Proteomik verleiht, hängt der Erfolg der konventionellen Niederschlagung stark von der Benutzertechnik ab. Ein primäres Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Fällungsstrategie zu präsentieren, die die Isolierung des Proteinpellets vom kontaminierenden Überstand erleichtert. Eine Einwegfiltrationskartusche wurde entwickelt, um das Pipettieren zu eliminieren, indem aggregiertes Protein über einem porösen PTFE-Membranfilterisoliert wird 27. MS-störende Bauteile im Überstand werden in einem kurzen, langsamen Zentrifugationsschritt effektiv entfernt. Die Einweg-Filterpatrone bietet auch eine austauschbare SPE-Kartusche, die eine anschließende Probenreinigung nach der Resobilisierung und dem optionalen Proteinaufschluss vor der Massenspektrometrie ermöglicht.
Eine Reihe von empfohlenen Proteom-Fällungs-Workflows werden hier vorgestellt, einschließlich modifizierter Aceton- und Chloroform/Methanol/Wasser-28-Protokolle , in einem konventionellen (auf Durchstechflaschen basierenden) und einem halbautomatischen Format in einer Einweg-Zwei-Zustands-Filtrations- und Extraktionskartusche. Die daraus resultierenden Proteinrückgewinnungsraten und SDS-Abbaueffizienzen werden zusammen mit der Bottom-up-LC-MS/MS-Proteomabdeckung hervorgehoben, um das erwartete Ergebnis jedes Protokolls zu demonstrieren. Die praktischen Vor- und Nachteile, die mit jedem Ansatz verbunden sind, werden diskutiert.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0,002 % Aldehyd</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>HPLC-Grad</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>Solide</td></tr><tr><td>Beta-Mercapptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Molekularbiologie-Bewertung</td></tr><tr><td>Bromophenolblau</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromophenol-blaues Natriumsalz</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Eluentes Additiv für LC-MS</td></tr><tr><td>Fusions-Lumos-Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>zur Analyse der Standardproteinmischung</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>Für Molekularbiologie > 99 %</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>HPLC-Grad</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>HPLC-Grad</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>Bis zu 21.000 xg</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhre (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>Konischer Boden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhre&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>Abgerundeter Boden</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Spitzen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (0.1-10 & mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Universelle Pipetspitze, nicht steril</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Spitzen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (1-200 & mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Universelle Pipetspitze, nicht steril</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Spitzen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (200–1000 & mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Universelle Pipetspitze, nicht steril</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Mikropipet-Trio-Paket</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Lyophilisiertes Pulver, &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; >3200 Einheiten/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 komplette Einheiten pro Box</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>ACS-Reagenz, >99 %</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>Pulverfester Stoff</td></tr><tr><td>timsTOF Pro Massenspektrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td>zur Analyse von Leberproteom-Extrakt</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Molekularbiologie-Bewertung</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>Von der Rinder-Bauchspeicheldrüse, TPCK-behandelt</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>Solide</td></tr><tr><td>Wasser (deionisiert)</td><td>Sartorius Arium Mini Wasseraufbereitungssystem</td><td>76307-662</td><td>Typ-1-Ultrareine (18,2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>Zinksulfat</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>Solide</td></tr></tbody></table>

proteinfällung auf organischer lösungsmittelbasis für eine robuste proteomreinigung vor der massenspektrometrie

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.

Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. Kurz ge...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.

Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Rückgewinnung sowie die Reinheit von Proteinen durch lösungsmittelbasierte Fällung zu maximieren. Wir zeigen Ihnen ein paar Tricks zur Durchführung von Fällungen in Fläschchen sowie einen halbautomatischen Ansatz im Spin-Cartridge-Format. Wir haben auch das Niederschlagsprotokoll optimiert, um konsistent und schnell zu sein.Das gesamte Protokoll dauert nur wenige Minuten. Diese Protokolle zeigen, dass die Lösungsmittelfällung von Proteinen ideal für die Probenvorbereitung vor der Massenspektrometrie ist. Die Protokolle fügen sich nahtlos in Bottom-Up- und Top-Down-Pro-Workflows ein.Ziheng Dang und Victoria Miller, leitende Wissenschaftlerin bei Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia, werden heute 90 Mikroliter partikelfreie Proteinlösung in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 Mikroliter eines Mols wässriges Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton in die Probenlösung hinzu, verschließen und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Lassen Sie die Durchstechflasche brüten.Raumtemperatur ungestört für mindestens zwei Minuten nach der Inkubation, zentrifugieren Sie die Proben unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche und drehen Sie mindestens zwei Minuten bei 10.000 RCF oder höher bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird ein sichtbares weißes Pellet am Boden des Röhrchens beobachtet. Lösen Sie an dieser Stelle das Rohr und dekantieren Sie das Supernat in einen Abfallbehälter, indem Sie das Rohr umdrehen.Verwenden Sie ein Papiertuch, um das restliche Lösungsmittel aus der Durchstechflasche zu ziehen. Für SDB, die Proben enthalten. Dosieren Sie vorsichtig 400 Mikroliter frisches Aceton, ohne das Pellet zu stören.Die Probe wird sofort eine Minute lang bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zentriert, indem Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie beim ersten Spin in den Rotor legen. Zählen Sie das Waschlösungsmittel wie zuvor beschrieben. Trocknen Sie die Probe bei geöffneter Kappe etwa eine Minute lang.In einem Abzug vor einer Pelletsolubilisierung. Geben Sie 100 Mikroliter der Proteinlösung in eine Durchstechflasche aus Polypropylen. Fügen Sie im Abzug 400 Mikroliter Methanol hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern Chloroform.Verschließen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel kurz, um zu mischen. Geben Sie schnell 300 Mikroliter Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche und lassen Sie sie eine Minute lang ungestört auf dem Tisch, nachdem Sie die Durchstechflasche aus Polypropylen in eine Zentrifuge gelegt und fünf Minuten lang bei 10.000 Mal G oder höher bei Raumtemperatur gedreht haben.Es wird beobachtet, dass die Durchstechflasche zwei Lösungsmittelschichten und ein sichtbares weißes Pellet bis zur Durchstechflasche bei etwa 45 Grad aufweist. Etwa 700 Mikroliter des Lösungsmittels werden mit einer großen Mikropipettenspitze von einem Milliliter und später mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze gleichmäßig aus der oberen Schicht entfernt, bis sie in der Durchstechflasche eine Perle bildet. Fügen Sie 400 Mikroliter frisches Methanol in das Probenfläschchen hinzu, ohne das Pellet zu stören, indem Sie das Lösungsmittel an der Seite des Fläschchens abgeben.Verschließen Sie die Durchstechflasche und kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln. Zur Beobachtung des weißen Proteinpellets ist die Ausrichtung der Durchstechflasche in der Rotorzentrifuge für mindestens 10 Minuten bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zu beachten. Winkeln Sie die Durchstechflasche mit dem Pellet nach unten.Platzieren Sie eine Pipettenspitze am oberen Rand der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipettenspitze von einem Milliliter langsam, aber gleichmäßig. Beibehaltung von ca. 20 Mikrolitern Lösungsmittel. Lassen Sie das restliche Lösungsmittel im Abzug trocknen.Um das Protein auszufällen. Befestigen Sie den Stecker mit einer Einweg-Filterpatrone an der oberen Filterpatrone. Kombinieren Sie 90 Mikroliter Proteinlösung 10 Mikroliter eines Mol-Aquas, Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton.Inkubieren Sie für mindestens zwei Minuten auf dem Tisch, zentrifugieren Sie die vorbereitete Proteinprobe mit dem noch an der Filterpatrone befestigten Stopfen für zwei Minuten bei 2.500 Mal G.At Raumtemperatur, drehen Sie die Patrone um und schrauben Sie den Stopfen von der Kartuschenbasis ab. Legen Sie die Filtrationskartusche in eine saubere Durchstechflasche, zentrifugieren Sie die Proteinprobe für drei Minuten bei 500 mal G bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das durchströmende Lösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche.Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 Mikroliter Aceton in die Filterpatrone geben, zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 500 mal G bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Patrone verbleibt. Nach den zuvor demonstrierten Proteinfällungsprotokollen. Re solubilisieren Sie das Protein, indem Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche benetzen, indem zwei bis fünf Mikroliter ISO-Propanol direkt auf die Membran gegeben werden, unmittelbar bevor mit dem Re-Solubilisierungsprotokoll zur Resolbilisierung des Proteinpellets fortgefahren wird, und stellen Sie 80% Volumenlösung Ameisensäure in Wasser her.Diese Säurelösung bei minus 20 Grad Celsius und die Filterkartusche mit gefälltem Protein vorkühlen. Geben Sie 50 Mikroliter kalt verdünnte Ameisensäure in die gekühlte Kartuschenkappe und den Wirbel für 30 Sekunden. Bringen Sie die Filterpatrone für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank.Wiederholen Sie die vorherigen Wirbel- und Inkubationsschritte. Fügen Sie 450 Mikroliter Wasser zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Ameisensäure auf 8 % verdünnenKehren Sie die Patrone ab, entfernen Sie den Stopfen vom Kartuschenboden, und befestigen Sie die SPE-Patrone an der Durchstechflasche.Schleudern Sie das Protein durch die SPE-Patrone in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 800 mal G.Wenn Lösungsmittel in der oberen Patrone verbleibt, bringen Sie die Patrone zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie den Spin. Spülen Sie, indem Sie 300 Mikroliter 5% Acetonitril mit 0,1% TFA in Wasser in die SPE-Kartusche geben, zwei Minuten lang mit 2000 mal G durch die SPE-Patrone fließen.Für niedermolekulare Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 Mikroliter fließen. Ein 50%Acetonitril mit 0,1% TFA für fünf Minuten bei 2.500 mal G.Für intakte Proteine.Anschließend folgt ein zusätzlicher Elusionsschritt mit 300 Mikrolitern 75% Acetonitril mit 0,1% Trifluorasketsäure. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte. Die Abbildung vergleicht die SDS-Erschöpfung nach Fläschchenbasis oder Fällung von Proteinen in einer Einwegfilterkartusche.Verwendung von Aceton mit den herkömmlichen Schnell- und CMW-Protokollen. Alle Ansätze reduzieren SDS, um eine optimale massenspektrometrische Analyse zu ermöglichen. Diese Abbildung zeigt die quantitative Proteingewinnung nach schneller Acetonfällung und CMW-Fällung durch SDS-Seitenanalyse eines verarbeiteten Hefe-Gesamtzelllysats.Eine konsistente Erholung wurde mit allen Niederschlagsprotokollen erreicht. Durch die Fällung in einer Einweg-Filterkartusche entfällt die Notwendigkeit, SDS-haltigen Überstand sorgfältig zu pipettieren, während die aggregierten Proteine über einem Membranfilter gehalten werden. Somit wurden keine sichtbaren Banden in den überstehenden Fraktionen über drei unabhängige Replikate nachgewiesen.Die kartuschenbasierte Proteinfällung zeigt eine überlegene Ausbeute einer Pepsin-verdauten Probe von Rinderplasma im Vergleich zur Fällung auf Fläschchenbasis. Signifikantere Unterschiede in der Ausbeute werden in der Kartusche festgestellt, wenn Natriumchlorid verwendet wird, während die Verwendung von Zinklösungsmittel zu der höchsten Ausbeute führte. Diese Abbildung quantifiziert die Peptidspitzenintensität jeder Peptidprobe mit einem Verhältnis über eins, das eine höhere Peptidhäufigkeit für Proben widerspiegelt, die in den Einwegfilterpatronen verarbeitet werden.Die Abbildung vergleicht die Anzahl der identifizierten Peptide pro Protein über die drei replizierten Probenvorbereitungen. Die Korrelationskoeffizienten von 0,94 bis 0,95 in diesen Grafiken zeigen die hohe Konsistenz des Probenvorbereitungsansatzes für die Bottom-up-Massenspektrometrie-Analyse. Sobald dieses Pellet gebildet ist, möchten Sie es wirklich vermeiden, es zu stören.Wenn Sie es als intaktes Pellet behalten, erhalten Sie einen höheren Ertrag. Vergessen Sie also nicht, das Pellet mit zusätzlichem Aceton zu waschen. Dies stellt sicher, dass wir das SDS loswerden, um unsere Probe so sauber wie möglich zu halten, und das gibt uns die beste massenspektrometrische Analyse.Wir haben also festgestellt, dass das Entfernen des überschüssigen Lösungsmittels durch Invertieren der Probe viel einfacher ist als der Versuch, die Probe zu pipettieren. Auf diese Weise erhalten Sie konstantere Erträge. Die Durchführung der Acetonfällung bei Raumtemperatur führte zu einer gleichmäßigeren und schnelleren Erholung als die herkömmliche Fällung im Gefrierschrank.

organic-solvent-based-protein-precipitation-for-robust-proteome

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert...

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse in metabolomics Experimente abhängig von der Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung. Beschrieben ist eine strenge und gründliche Methode, die Extraktion von Metaboliten aus biologischen Flüssigkeiten können mit der Option, später die Analyse bis zu Tausenden von Verbindungen, oder einfach nur die Verbindungsklassen von Interesse.

Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover

Dieses Protokoll ist für die Extraktion und Konzentration von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse, die aus Meerwasser gesammelt wurde, gefolgt von der Erzeugung von tryptischen Peptiden, die für die Tandem-Massenspektrometrie-basierte Proteomanalyse geeignet sind.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus biologischen Matrices mittels Trichloressigsäure (TCA)-Proteinfällung und Säurehydrolyse vor der Analyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie.

Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Entnahme von Tränenproben unter Verwendung von Schirmer-Streifen und einen integrierten quantitativen Workflow zur Entdeckung nicht-invasiver Tränenprotein-Biomarker. Der Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung ermöglicht eine schnelle und robuste Vorbereitung von Tränenproben und massenspektrometrische Analysen, was zu einer höheren Ausbeute an Peptidrückgewinnung und Proteinidentifikation führt als bei Standardverfahren in Lösung.

Eine Proteinsuspensions-Trapping-Probenvorbereitung für die Tränenproteomik mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Lernen Sie eine auf organischen Lösungsmitteln basierende Proteinfällungsmethode für die Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie. Dieses Protokoll maximiert Proteinrückgewinnung und Reinheit in wenigen Minuten.

Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

Weitere Videos entdecken