Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop
16. März 2022
Hochauflösende Kryo-EM-Karten von Makromolekülen können auch mit 200-kV-TEM-Mikroskopen erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt die Best Practices für die Einstellung genauer optischer Ausrichtungen, Datenerfassungsschemata und Auswahl von Bildbereichen, die für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze mit einem 200-kV-TEM unerlässlich sind.
Cryo-EM hat sich zu einer Standardtechnik zur Strukturbestimmung von Proteinen und deren Komplexen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices zum Abrufen hochauflösender Cryo-EM-Datensätze aus den mittleren 200-kV-TEM-Mikroskopen. Kryo-EM kann die Proteinstruktur unter nativen Bedingungen in Lösung für mehrere Konformationszustände und funktionelle Zustände gleichzeitig bestimmen, was für andere Strukturtechniken schwer fassbar ist.
Die gewonnenen Strukturinformationen können zur Aufklärung molekularer Mechanismen der Proteinfunktion sowie für das strukturbasierte Wirkstoffdesign verwendet werden. Zum Beispiel zeigte eine kürzlich erschienene Veröffentlichung in der Struktur von Amyloidfibrillen mehrere Bindungsstellen eines lebenswichtigen Liganden. In diesem Protokoll verwenden wir jedoch die Standardproben von Apoferritin und Proteasom, um die kritischen Schritte bei der Gewinnung hochauflösender Kryo-EM-Daten zu demonstrieren.
Die Bedienung eines Cryo-TEM ist in den letzten Jahren einfacher geworden, insbesondere durch die Einführung fortschrittlicher Automatisierungsfunktionen. Für die erste Sitzung empfehlen wir Ihnen jedoch, eine Schulung mit erfahreneren Benutzern durchzuführen. Von dort aus ist der Fortschritt in der Technik relativ schnell.
Das Verfahren wird von Adrian Koh, Senior Application Scientist bei Thermo Fisher Scientific, demonstriert. Setzen Sie automatische Gitter unter flüssigen Stickstoffbedingungen in die Kassette des automatischen Ladegeräts ein. Setzen Sie die Kassette mit automatischen Gittern in eine mit flüssigem Stickstoff gekühlte Transferkapsel ein.
Führen Sie die Kapsel weiter in das Mikroskop ein und klicken Sie auf die Dock-Schaltfläche in der Mikroskop-Benutzeroberfläche, um die Kassette aus der Kapsel in den automatischen Lader des Mikroskops zu laden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Inventar, um das Vorhandensein von automatischen Rastern in der geladenen Kassette zu überprüfen. Klicken Sie dann auf die Schaltflächen Laden und Entladen, um die automatischen Raster in die Spalte für TEM-Imaging einzufügen.
Wählen Sie die Registerkarte Atlas und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Sitzung, um eine neue Sitzung zu öffnen. Geben Sie Details wie Sitzungsname und Datenspeicherort ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen. Wählen Sie die gewünschten Raster aus, indem Sie ein Kontrollkästchen neben der entsprechenden Rasternummer aktivieren.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine vollautomatische Sammlung von Atlanten aller ausgewählten Raster zu starten. Wenn die Sammlung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Rasterbeschriftungen, um die erworbenen Atlanten zu überprüfen. Wählen Sie die Registerkarte EPU und gehen Sie zu Neue Sitzung, um eine neue Sitzung im linken Bereich zu erstellen.
Wählen Sie die Option Neue Sitzung, um die aktuell eingestellten optischen Voreinstellungen zu verwenden. Geben Sie den Sitzungsnamen ein. Wählen Sie den manuellen Typ der Sitzung aus, um die Kontrolle über die Auswahl der einzelnen Bohrungen und Rasterquadrate zu haben, die für die Datenerfassung später im Protokoll ausgewählt wurden.
Wählen Sie den schnelleren Aufnahmemodus, um aberrationsfreie Bildverschiebung für die Datenerfassung zu verwenden. Geben Sie dann den Speicherort für die Metadaten ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen, um eine neue Sitzung zu erstellen.
Wählen Sie die quadratische Auswahlaufgabe im linken Bereich aus, um den gesammelten Atlas des Rasters anzuzeigen. Identifizieren Sie die Gitterquadrate mit intakter Stützfolie ohne Beschädigung, dünnem Glaseis und Folienlöchern, vernachlässigbarer kristalliner Eiskontamination im Gitterquadrat und minimalem Helligkeitsgradienten über das Gitterquadrat und innerhalb einzelner Folienlöcher. Wählen Sie die Rasterquadrate für die Datenerfassung aus, entweder im vollständigen Atlas oder in hochwertigen Kachelbildern.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Rasterquadrat von Interesse und wählen Sie die gesamte Auswahlaufgabe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto Eucentric, um automatisch zum ersten ausgewählten Rasterquadrat zu wechseln. Passen Sie die euzentrische Höhe an und erfassen Sie ein quadratisches Gitterbild, um Folienlöcher zu finden.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen suchen, um Folienlöcher im Bild zu finden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen entfernen, um die Schaltfläche Rasterleiste zu schließen, um die Auswahl von Bohrungen in der Nähe von Rasterbalken aufzuheben. Passen Sie die Grenzen im Helligkeitshistogramm des Eisfilters an, um alle Löcher mit zu dickem Eis und alle leeren Löcher zu entfernen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Loch im quadratischen Rasterbild und wählen Sie Bühne zu Position verschieben Bühne verschieben hier. Wählen Sie im linken Bereich die Vorlagendefinitionsaufgabe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben, um ein ganzes Bild zu erhalten.
Legen Sie die Werte für die Verzögerung nach der Bildverschiebung auf 0,5 Sekunden und die Verzögerung nach der Bühnenverschiebung auf fünf Sekunden fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrung suchen und zentrieren, um eine Bohrung im Bild zu zentrieren. Wählen Sie die Schaltfläche Aufnahmebereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Position im mittleren Loch auszuwählen, an der die Bildaufnahme mit hoher Vergrößerung durchgeführt wird.
Wählen Sie die Schaltfläche Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Position auf der Stützfolie neben der zentrierten Bohrung auszuwählen, an der der automatische Bildfokus durchgeführt wird. Klicken Sie auf den grünen Erfassungsbereich, um eine Abfolge von Defokussierungswerten in der Defokussierungsliste im oberen Bereich des Softwarefensters festzulegen. Nachdem Sie die Autofokus-spezifischen Einstellungen festgelegt haben, wählen Sie die Option Nach der Zentrierung zum Autofokus am Start jedes AFIS-Clusters.
Wählen Sie die Option Objektiv für schnellere Autofokussierung und reduzierte Bühnendrift. Klicken Sie in der Bohrungsauswahlaufgabe auf die Schaltfläche Alle Quadrate vorbereiten, um die Datenerfassung und alle anderen ausgewählten Gitterquadrate automatisch entsprechend den verwendeten Einstellungen in diesem ersten Rasterquadrat einzustellen. Wählen Sie die Vorlagendefinitionsaufgabe aus, erfassen Sie ein neues Bild, verschieben Sie die Bühne per Rechtsklick in einen sauberen Bereich auf Kohlefolie und wählen Sie hier den Menüpunkt Bühne verschieben.
Wählen Sie die Registerkarte Automatische Funktionen aus. Nachdem Sie den gewünschten Defokus und die Iteration eingestellt haben, wechseln Sie zum Autofokus-Preset und klicken Sie auf den Start-Button, um die Autofokus-Funktion auszuführen. Wählen Sie die Autostigmate-Aufgabe aus, wechseln Sie zur Voreinstellung Thon Ring und drücken Sie die Starttaste.
Wählen Sie den Autokoma-Task aus und drücken Sie die Start-Taste. Verschieben der Bühne in einen Bereich mit einem unterbrochenen Gitterquadrat Bestätigen Sie die Transparenz des Bereichs, indem Sie ein einzelnes Autofokusbild aufnehmen.
Öffnen Sie die Sherpa-Benutzeroberfläche und wählen Sie die Energiefilteranwendung aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Center und die Null-Verlust-Option, um den Null-Verlust-Energiefilter-Schlitz zu zentrieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Tune in der Option Isochromatizität.
Klicken Sie auf die Option Tune Magnification und Tune Distortions in den geometrischen und chromatischen Verzerrungen. Gehen Sie zur Registerkarte EPU, wählen Sie den Task Automatisierte Erfassung aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Start Run, um mit der vollautomatischen Datenerfassung zu beginnen. Die Abbildung zeigt Kryo-EM-Gitter, die einen Gradienten der Eisdicke über der Gitteroberfläche anzeigen.
Die von der weiteren Untersuchung ausgeschlossenen Gitter sind schlechtes Gitter mit dickem Eis und ein gebogenes Gitter mit schlechtem Eis und Verschmutzung, während akzeptable Gitter solche mit gutem Eisgradienten und ein typisches Gitter mit gutem dünnem Eis und kleinem Eisgradienten sind. Die Abbildung zeigt das endgültige 3D-Rendering der rekonstruierten Apoferritin-Kryo-EM-Karte. Die hohe Stabilität und Symmetrie machen es zu einem optimalen Benchmark-Sample für hochauflösende Cryo-EM-Bildgebung und Bildverarbeitung.
Bayes'sches Polieren, CTF-Verfeinerung und Ewald-Kugelkorrektur führten zu einer Angström-Auflösungskarte von 1,63. Die Abbildung zeigt eine detaillierte Ansicht der rekonstruierten Apoferritin-Kryo-EM-Karte auf der Ebene der einzelnen Aminosäure-Seitenketten. Die Dichte der Aminosäure-Seitenketten ist gut aufgelöst und das Atommodell kann eindeutig innerhalb der Karte aufgebaut werden.
Das Bild hier zeigt zwei verschiedene Datensätze mit unterschiedlichen Defokussierungswerten, die aus demselben Kryo-EM-Gitter mit ähnlichen Gitterquadraten mit einem vollständig geöffneten Spalt und einem 10-Elektronenvolt-Spalt gesammelt wurden, was darauf hinweist, dass der 10-Elektronenvolt-Spalt den Bildkontrast signifikant verbessert. Die Abbildung hierin zeigt eine Übersicht über die 20S Proteasom Cryo-EM Karte mit segmentierten Untereinheiten, die als Standard-Cryo-EM-Probe verwendet werden. Und seine vergrößerte Ansicht mit einem angepassten Atommodell stellt den stabilen katalytischen Kern des Proteasom-Komplexes mit der D7-Symmetrie dar.
Das Protokoll enthält zwei wichtige Schritte. Eine, die nach Bereichen mit dünnem Glaseis sucht, die homogene Partikel enthalten. Und zweitens, die Einrichtung einer parallelen Beleuchtung für die Datenerfassung.
Mit hochauflösenden Rekonstruktionen von Proteinen, die zwei bis drei Angström in Auflösung erreichen, sind Sie besser in der Lage, die molekularen Mechanismen der Krankheit zu verstehen und die Wirkstoffleitungen zu verbessern. Bisher war die Kristallisation notwendig, wenn man die strukturellen Grundlagen biologischer Phänomene untersuchen wollte. Heute ist das mit Cryo-EM nicht mehr nötig.
Und so ermöglichen wir es Wissenschaftlern mit Cryo-EM, ein breiteres Spektrum biologischer Phänomene auf struktureller Ebene zu untersuchen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt bewährte Praktiken für die Gewinnung hochauflösender Cryo-EM-Datensätze mit 200 kV TEM-Mikroskopen. Es betont genaue Optikausrichtungen, Datenerfassungsschemata und die Auswahl von Bildgebungsbereichen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Cryo-Elektronenmikroskopie
- Strukturbiologie
Hintergrund
- Cryo-EM ist eine Standardtechnik zur Proteinstrukturbestimmung.
- Es ermöglicht die Untersuchung von Proteinen unter nahezu nativen Bedingungen.
- Diese Methode kann mehrere konformationelle und funktionelle Zustände gleichzeitig erfassen.
- Jüngste Fortschritte haben den Betrieb von Cryo-TEMs erleichtert.
Zweck der Studie
- Um die kritischen Schritte bei der Gewinnung hochauflösender Cryo-EM-Daten zu demonstrieren.
- Um ein Protokoll für die Verwendung von Standardproben wie Apoferritin und Proteasom bereitzustellen.
- Um die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung durch detaillierte Strukturinformationen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Auto-Grids und Flüssigstickstoffbedingungen für die Probenvorbereitung.
- Automatisierte Sammlung von Atlanten von ausgewählten Grids.
- Manuelle Auswahl von Gitterquadraten für die Datenerfassung.
- Nutzung fortschrittlicher Automatisierungsfunktionen für eine effiziente Datenerfassung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Gewinnung hochauflösender Datensätze von 200 kV TEM-Mikroskopen.
- Identifizierung optimaler Gitterquadrate für die Bildgebung.
- Demonstration automatisierter und manueller Datenerfassungstechniken.
- Aufstellung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine umfassende Anleitung zur Gewinnung hochauflösender Cryo-EM-Daten.
- Training mit erfahrenen Benutzern wird für Anfänger empfohlen.
- Fortschritte in der Automatisierung erhöhen die Effizienz von Cryo-EM-Operationen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution cryo-EM using 200 kV TEM systems enables routine atomic-level protein structure determination, expanding access beyond specialized 300 kV platforms. Automation and real-time quality assessment streamline data acquisition, supporting rapid, reproducible generation of structural insights for early-stage drug discovery. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and lead identification inflection points across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables elucidation of molecular mechanisms underlying protein function and disease relevance.
- Supports structure-based drug design by providing atomic-resolution maps for target interrogation.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of conformational and binding states.
- Reduces reliance on crystallization, broadening the range of tractable targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated structural templates for downstream screening and assay development workflows.
- Standardizes imaging parameters and data quality, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative assessment of ligand binding and conformational changes.
- Supports scalable, automated data collection for high-throughput structural screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying structure-function relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions 200 kV cryo-EM as a core capability from early discovery through preclinical research, bridging target validation, lead identification, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein structures in near-native states.
- Screening: Provides reproducible, quantitative structural data for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Enables high-resolution measurements and statistical comparison of structural conditions and ligand interactions.
- Translational Research: Connects atomic-level insights to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automated workflow adaptable across diverse protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and real-time quality control.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM operation and data interpretation, with initial training recommended.
- Needs access to 200 kV TEM systems equipped with energy filters and direct electron detectors.
- Demands robust data management and quality assessment infrastructure for high-throughput workflows.
- Standardization of imaging parameters and automation protocols is critical for cross-team reproducibility.
- Adaptation to specific protein targets may require optimization of sample preparation and imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
